Summary
Сгибательных сухожилий в руке, как правило, получили ранения, что приводит к нарушению функции руки. Тем не менее, рубцовой ткани заживление ответ не очень хорошо характеризуется. Мышиной модели сухожилия сгибателей исцеление здесь продемонстрировано. Эта модель может повысить общее понимание процесса заживления и оценить терапевтические подходы для улучшения заживления.
Abstract
Сухожилие соединяет скелетные мышцы и кости, облегчая перемещение почти всего тела. В руке, сгибательных сухожилий (FTS) позволяют сгибание пальцев и общей функции руки. Травмы FTS являются общими, и удовлетворительное заживление часто нарушается из-за избытка рубцовой ткани и спаек между сухожилием и окружающими тканями. Тем не менее, мало известно о молекулярных и клеточных компонентов ремонта FT. С этой целью, на мышиной модели ремонта FT, который повторяет многие аспекты заживления в организме человека, в том числе ослабленным диапазон движения и снижение механических свойств, было разработано и описано ранее. Здесь углубленное демонстрация этой хирургической процедуры обеспечивается, включая рассечение и последующий ремонт сгибателя пальцев (FDL) сухожилие в мышиной заднюю лапу. Этот метод может быть использован для проведения анализа клонов различных типов клеток, оценить эффекты усиления гена или с потерей функции, а также для проверки Эффитивность фармакологических вмешательств в процессе заживления. Тем не менее, существует два основных ограничения для этой модели: I) сухожилие FDL в средней части мышиного заднюю лапу, где происходит рассечение и ремонт, не окружен синовиальной оболочкой. Поэтому данная модель не учитывает потенциальный вклад оболочки в процессе формирования рубца. б) Для защиты целостности сайта ремонта, FT выпущен на myotendinous переходе, уменьшая механические силы сухожилия, вероятно, способствует повышенному образованию рубцов. Выделение достаточных клеток из грануляционной ткани FT во время процесса заживления для проточной цитометрии анализа оказалось сложной задачей; цитологическое центрифугирование, чтобы сконцентрировать эти клетки альтернативный метод, используемый, и позволяет для генерации клеточных препаратов, на которых может быть выполнена иммунофлуоресцентного маркировка. С помощью этого метода, определение количества клеток или интерес белков во время FT заживления становится возможным.
Introduction
Сгибательных сухожилий в руке работают совместно с сгибателей предплечья и цифровых ножен, чтобы позволить сгибание цифр и схватив функции руки. Сгибательных сухожилий бежать вдоль ладонной аспекту стороны; это относительно поверхностное расположение часто приводит к травмам сухожилий сгибателей во время травмы руки. Сухожилия заживают через ответ рубцовой ткани , а не регенерации нормальной ткани сухожилия 1. В то время как это рубцовая ткань обеспечивает непрерывность сухожилия, функция резко снизился относительно здорового сухожилия. Композиты сухожилие-рубцовой ткани характеризуются обесцененным механическими свойствами 1, что делает восстановленных сухожилий более вероятно к разрыву. Кроме того, рубцовой ткани не хватает организации нативной структуры сухожилие коллагенового волокна, что приводит к увеличению размера сухожильных и навалом. С учетом анатомических ограничений блока сухожилие оболочки, даже небольшое увеличение размера сухожилие может резко красныйUce планирующего функцию сухожилие, и поэтому цифры диапазон движения и функции рук.
До начала 1960 - х годов травмы сухожилий сгибателей, особенно в зоне II руки, не регулярно ремонтировать из - за серьезных осложнений в исцелении , которые возникли с этим ремонт 2. Эта область стороны упоминался как «нет человека земли» 3. Тем не менее, улучшение хирургических методов, моделей шовных и протоколов реабилитации физической терапии значительно улучшились результаты сгибателя ремонта 2. Несмотря на эти успехи, до 40% ремонтов приводит к достаточного образования спаек препятствовать функции рук 4. Таким образом, биологический подход необходим для улучшения заживления. К сожалению, очень мало известно о процессе заживления сухожилия на клеточном и молекулярном уровне. Таким образом, цель состояла в том, чтобы разработать мышиной модели, которые можно было бы использовать для улучшения фундаментального понять нег клеточных и молекулярных компонентов сгибателя исцеления и реакции образования рубца, в качестве средства для идентификации новых терапевтических мишеней для улучшения заживления.
Более крупные модели животных играют важную роль в содействии пониманию процесса заживления сухожилия сгибателей. Собачьи и кролика исследования показали , как внутренняя и внешняя целебный способность сухожилий сгибателей 5,6, важность раннего контролируемого пассивного движения в минимизации образования спаек по отношению к иммобилизации 7, а также влияние различных моделей шовных на процессе заживления 8 , 9. Кроме того, собачий модель была полезна при тестировании поступательные ткани инженерных подходов к улучшению заживлению 10. Тем не менее, существует несколько важных преимуществ в использовании мышиной модели относительно большой модели животных, в том числе относительной стоимости, доступности мышевидных специфических реагентов, а также легкость генерации глобального KnocK-ауты или тканеспецифические удаление / сверхэкспрессии конструкции. Кроме того, функциональные сходства между человеком и мышей по отношению к сухожилиями сгибателей 11 указывают на потенциальную полезность в разработке мышиной модели.
Разработка мышиной модели рассечение сухожилия сгибателей и ремонт мимике многие аспекты клинического исцеления, в том числе формирование рубцовой ткани, обильной и обесцененных механическими свойствами. Модель, описанная здесь, не является истинным рекапитуляцию клинической практике из-за перерезки FDL на myotendinous перекрестке, чтобы защитить сайт ремонта. Кроме того, эта модель не учитывает вклад синовиальных клеток оболочки в ответ исцеления, так как нет синовиальной оболочки покрытия средней части сухожилия, где происходит ремонт. Несмотря на эти ограничения, эта модель имеет преимущество генерирующего диапазона спаек движения ограничения, которое еще должно быть продемонстрировано в мышиных моделях, которые больше КлосаEly приближают клинического сценария. Эта модель была использована для оценки выбиваемые модели мыши 12,13, а также проверить различные фармакологические подходы к улучшению заживления 14-17. Гистологический анализ этой модели, с помощью иммуногистохимии и гибридизации in-situ, может предоставить важную информацию в локализации ключевых генов и белков в процессе заживления. Тем не менее, гистологическое исследование дает только поперечное сечение пространственного анализа и не позволяет количественно оценить по всей ткани. Проточная цитометрия представляет собой более количественный подход, но лишь очень ограниченное количество клеток, могут быть выделены из заживлении сухожилие ткани в мышиной модели, и это число далее уменьшилось во время фиксации, пермеабилизирующего, и промывки. Принимая это во внимание, чтобы, проточной цитометрии становится неосуществимой подход из-за количества животных, которые потребовались бы. Альтернативный метод необходим, чтобы сохранить большую часть этой небольшой популяции клеток в порядкедля дальнейшей характеристики заживления среду. Метод, используемый для достижения этой цели, как показано здесь, включает в себя концентрацию изолированных клеток через цитологическим центрифугирования на предметное стекло, а затем иммуногистохимии. В настоящем исследовании ОБР (5-этинил-2'deoxyuridine, тимидин аналог) включение и последующее мечение использовали для определения относительного пролиферативного состояния клеток на лечебница. Этот подход может быть применен для проверки эффективности фармакологических обработок на пролиферацию клеток, генного нокаута или избыточной экспрессии, или для идентификации и количественного определения различных клеточных популяций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по научным исследованиям университета животных в Университете Рочестера одобрил все эксперименты на животных. / Были использованы десять-12 недельных самок C57BL 6J мышей.
1. Подготовка животных для сгибателя хирургии (~ 15 мин)
- Автоклавы хирургические инструменты для стерилизации, носить стерильные перчатки повсюду, и поддерживать стерильную операционное поле.
- Обезболить мышь через внутрибрюшинной инъекции (IP) с объемом кетамина (80 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг), соответствующего веса тела. Подтвердить глубину седации через отсутствие ног-пинча рефлекс.
- Администрирование упреждающего анальгезию (бупренорфин, 0,05-0,1 мг / кг) с помощью подкожной инъекции. Применение глазной мази, чтобы предотвратить глаз от высыхания.
- Подготовьте место операции, закрепляя меха на всю заднюю конечность. Стерилизовать кожу путем мокрой очистки последовательно повидон-йод, а затем 70% -ным этанолом, и снова с повидон-йод.
- Найдите длинного сгибателя пальцев (FDL) сухожилие, видно внешне в медиальной теленка. С помощью скальпеля, сделать небольшой 0,5-1 см надрез в коже с микро-ножницами, чтобы подвергать сухожилие.
- Используйте пинцет, чтобы отделить сухожилия FDL от окружающих тканей и проследить его до myotendinous перехода. Обрежьте сухожилие на этом перекрестке с пружинными ножницами, чтобы освободить ее, следя за тем, чтобы избежать задней большеберцовой артерии.
- Закройте кожу с 5-0 нейлоновыми швами.
Примечание: рассечение и ремонт (шаги 2.4) FDL должны быть выполнены с помощью стереомикроскопа. - Сделайте 3 мм разрез по заднебоковой аспекту задней лапы с помощью пружинных микро-ножницы. Аккуратно втягивать окружающих мягких тканей и мышц с пинцетом, убедившись, чтобы свести к минимуму повреждения тканей, а также определить сухожилие FDL.
- Осторожно поднимите сухожилие FDL и полностью секут его, используя миCro-ножницы. Шовный концы FDL сухожилие вместе в зарегулированию Kessler с 8-0 швами, избегая высыхания жилами периодически смачивая его с физиологическим раствором.
- Заменить мягкие ткани и мышцы над сухожилием, а затем закрыть разрез с 5-0 нейлоновыми швами.
- Место мышей на слайде теплее установленного до 37 ° С, для поддержания температуры тела до тех пор, пока выздоровел от анестезии.
- Монитор мышей после операции на наличие признаков повреждения или инфекции в том числе повышенной вокализации и взъерошенными меха. Вводят бупренорфин (50 мкл / мышь) в качестве анальгетика каждые 12 ч до мышей больше не показывают признаков боли или страданий.
- Разрешить мышей, чтобы зажить в течение 10 дней после операции, прежде чем продолжить к следующим шагам.
Примечание: Клетки могут быть собраны в любой временной точке после операции. Здесь, за 10 дней выбраны для этих представительных экспериментах с учетом относительно высокую насыщенность клетками ткани в это время.
3. Labeliнг велосипедного клеток (~ 10 мин)
- Готовят ОБР (5-этинил-2'deoxyuridine) раствор (10 мг / мл в стерильном фосфатно-солевом буферном [PBS] + 1% диметилсульфоксида [ДМСО] для увеличения растворимости).
- Вводят мышей с 100 мкл Эду (50 мг / кг) с помощью инъекции IP 24 ч перед умерщвлением.
4. Сбор урожая Клетки для цитологии центрифугировани (2,5 часа, ~ 30 мин Практическое время)
- Приготовьте 3 мг / мл коллагеназы I в PBS.
- Эвтаназии мышь через асфиксией диоксидом углерода при скорости потока не более 3 л / мин, а также выполнять шейки дислокации в качестве вторичной меры.
- Расположить ремонтируемый сухожилие, используя шаг 2.4 выше, и изолировать ткань сухожилия резанием около 2 мм по обе стороны от места повреждения с микро-ножниц.
- Фарш ткани скальпелем в чашке Петри с 1 мл 3 мг / мл коллагеназы, а затем проходит через смесь 18 г игольчатых несколько раз, чтобы разрушить ткань. Собирают смесь в 1,5 мл центрифужную пробирку. Дайджест сухожилие ткани в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании.
- Спин ткани вниз (300 мкг в течение 5 мин), аспирация коллагеназы, а затем ресуспендирования клеток / ткани с 500 мкл 3% сыворотки бычьего альбумина (BSA) в PBS с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Фильтр клеточной суспензии через сито 70 ячейки мкм для удаления мусора и большие куски сухожилие, и отложите в 37 ° С инкубатор.
- Поместите ткань сухожилия в другую 1,5 мл центрифужную пробирку, и освежать с 1 мл раствора коллагеназы, пипетированием вверх и вниз, чтобы перемешать.
- Инкубируйте ткани еще один час при температуре 37 ° C при встряхивании.
- Спин вниз переваривается ткань сухожилия (300 мкг в течение 5 мин), затем ресуспендируют в 500 мкл 3% БСА в PBS с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Фильтры суспензии клеток через клеточный фильтр 70 мкм, в сочетании с подвеской, изолированных в 4.3.3, а затем подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
- Промыть клетки еще раз с 3% БСА в PBS, а затем вновь суспендируют в 3-6х 10 4/100 мкл.
- Прикрепите цитологии воронку к положительно заряженным горкой и зафиксировать в держатель слайдов. Вставьте весь аппарат в цитологии центрифугу и добавить суспензию 100 мкл клеток в воронку. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин, чтобы разогнать клетки на слайде.
5. Иммуноцитохимическая для обнаружения Edu (2 часа, ~ 45 мин Практическое время)
Примечание: Все стадии инкубации следует проводить в темноте , чтобы ограничить фотообесцвечивания флуорофоров.
- Окружность клетки с гидрофобный барьер пера, чтобы свести к минимуму решения, необходимого для следующих шагов, а затем сразу же зафиксировать с помощью 150 мкл 3% параформальдегид в PBS 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Промыть два раза в течение 5 мин с 150 мкл 3% БСА в PBS.
- Проницаемыми клеток с 0,5% Тритон-X 100 в PBS, 20 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаг стирки, как в 5.1.1.
- Подготовка EDU реакции cocktАйыл согласно инструкции к набору не более чем за 30 мин перед использованием.
- Добавьте 150 мкл коктейля для каждого слайда, инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаг стирки, как в 5.1.1.
- Инкубируют 150 мкл ядерной контрастное Hoechst33342 разводили 1: 2000 в PBS, 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть два раза в течение 5 мин с 150 мкл 1X PBS.
- Добавьте 1-2 капли против замирание монтажной среды к клеткам, а затем медленно опустите покровное, чтобы предотвратить пузыри.
- Разрешить монтаж среды вылечить в течение ночи в темноте при комнатной температуре.
- Используйте ясный лак для ногтей для герметизации покровное на слайде.
- слайды изображение при 40-кратном увеличении с помощью флуоресцентного микроскопа, оборудованного с помощью фильтров возбуждения / излучения, способных обнаруживать DAPI (Hoeschst33342) и Texas Red (Alexa Fluor 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сгибателя пальцев (FDL) мышца, расположенная в икре, действует сгибать цифры мыши заднюю лапу через сгибателя (выделены синим цветом на рисунке 1А, и показано гистологически на рисунке 2А), которая проходит в проксимальном направлении от myotendinous узел и оканчивается в дистальных фаланг. В этой модели сухожилия сгибателей исцеления, сухожилие FDL перерезают и отремонтировано в середине стопы, проксимальнее бифуркации к цифрам задней лапы (красные стрелки, рис 1А). Для предотвращения разрыва ремонта, который бы исключает экспериментальный анализ, сухожилие (и прилегающих мышц) режется, или отпущена, на myotendinous переходе (желтая стрелка на рисунке 1В, выпуск показано на рисунке 1С). Хотя этот шаг не является представителем клинического сценария, крайне важно , чтобы защитить ремонт за счет уменьшения нагрузки на месте повреждения. Рисунок 2Dявляется гистологическое примером разорванного ремонта сухожилия сгибателя, по сравнению с успешным ремонтом , показанной на фиг.2С. В последнем случае , дисплеи грануляционной ткани значительно увеличилась клеточности по сравнению с неповрежденной сухожилие (Фигура 2В), и эта клеточная популяция , то может быть дополнительно проанализированы с помощью цитологического центрифугирования на предметное стекло с последующим иммуногистохимии. Рисунок 3 описывает экспериментальную процедуру , используемую для оценки пролиферативная состояние клеток, собранных от заживления сухожилий 10 дней после ремонта с помощью EDU включения во вновь синтезированную ДНК. Поэтому ОБР маркировка показывает только те клетки , которые активно пролиферирующие в течение периода 24 ч после импульса ОБР в живых мышей, как показано на рисунке 4. Количественная оценка пролиферации в грануляционной ткани заживления сухожилия , то может быть определено с помощью точечного подсчета всего клеточного препарата. Таким образом, базовая линия ProlifeРацион может быть установлена в каждый момент времени, а также любые изменения из-за генетических или фармакологических вмешательств, могут быть оценены.
Рисунок 1 :. Мышиные Hind Paw Анатомия и Идентификация сгибателя пальцев сухожилие. Сгибателей пальцев мышцы (FDL) сгибает цифры в мыши заднюю лапу и проходит вдоль ладонной аспект задней лапы (FDL выделены синим цветом) , где его разветвляется на цифры (красные стрелки) (Рис. 1А) Проксимально, сухожилие FDL проходит через лапок туннель (черная стрелка), в икре, заканчивающиеся на myotendinous переходе (желтая стрелка) (рис 1B). Освобождение сухожилия в myotendinous перехода , чтобы предотвратить разрыв показан на рисунке 1C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Типичные гистологические Изображения Un-ранения, нормальное заживление и разрывают сгибателя Ремонт Анатомия сухожилия FDL в мышиной задней лапы показано на рисунке 2А. Шкала бар представляет 1 мм. На рисунках 2В-D, сухожилие увеличивается на 8X для сравнения неповрежденную ткань сухожилия (рис 2В) к неповрежденной и ломанного ремонта (рис 2C и 2D, соответственно). Цельные образцы подушечки задних фиксировали в нейтральном забуференном формалине, заливали в парафин, разрезать на участках 3 мкм, и окрашивали Альциановый синий / гематоксилин / оранжевый G , как описано выше 13. Родные сухожилие выделены синим цветом, композитный сухожилие / грануляционной ткани описана в зеленый цвет, а черные стрелки указывают на швы. Масштабные столбики представляют 200 мкм. Pсдавать в аренду, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Экспериментальная процедура используется для выполнения Edu Click-Химия его по сотовому препаратов на 10 день после операции заживление FDL сухожилия были разрезаны от мыши задних лап.. Жилы измельчали затем переваривается в течение двух часов в коллагеназы я диссоциировать клетки. Затем клеточную суспензию напряженными для удаления мусора, и ~ 6 х 10 4 клеток центрифугировали в монослой на положительно заряженные предметные стекла с использованием цитологического центрифугу. Клетки обведено с гидрофобным барьерной ручкой и затем фиксировали непосредственно с параформальдегидом. После того, как пермеабилизации с Triton X-100, клетки обрабатывали с коктейлем обнаружения Эду, и реакция химии нажмите связанный Alexa Fluor 594 к встроенным Edu. Hoechst 33342 использовали в качестве окрашивающим ядра, и клетки ВЕР е анализируется на 10-40X с флуоресцентным микроскопом. Нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Иммуноцитохимическая Анализ задействуя Edu-меченых клеток во время сгибателя Исцеление Исцеление FDL сухожилия собирали из задних лап мышей через 10 дней после операции и переваривают коллагеназы для получения клеточной суспензии. Центрифугирование использовался для разгона этих клеток в монослое на слайдах, а затем иммуноцитохимию к изображению Edu включения. Рисунок 4А и 4Б являются снимки, сделанные в 10х и 40х соответственно из клеток после иммуногистохимического анализа. Ядерная пятно Hoechst 33342 синего цвета, и клетки, которые включили Edu усеяны красными. Шкала баров составляет 50 мкм.HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хирургическая процедура для мышиной модели полного рассечения и ремонта сгибателя пальцев сухожилие представлен в данном исследовании. Кроме того роман применение концентрируясь небольших клеточных популяций с цитологии центрифуге демонстрируется, что позволяет для количественного анализа Иммуноцитохимическую клеточной среды во время заживления сухожилия сгибателей. Эта модель ремонта сухожилия сгибателя демонстрирует воспроизводимое целебный ответ, который может быть использован для оценки изменений в процессе заживления с использованием модели нокаута или с фармакологического вмешательства. После операции, воспалительная реакция начинается в течение 24 часов, в течение которых клетки, набираемых на месте повреждения и каллуса фиброзной ткани начинает формироваться. Пролиферативная фаза следует примерно в четыре дня, с участием значительно увеличилось клеточности и обильные отложения неорганизованного внеклеточного матрикса на месте ремонта, что приводит к образованию спаек между 14-21 дней. Ремоделирование тканей Continues через 35 день, при котором непрерывность времени и организация сгибателя восстанавливается, и Клеточность уменьшается 18.
В настоящее время существует несколько мышиных моделей сгибателей ремонта сухожилия в дополнение к приведенному здесь. Tsubone и др., Описали модель ин витро сгибателя исцеления 19. Хотя эта модель может оценить изменения в экспрессии генов с течением времени, она не может объяснить набора внешних клеток или изменения в воспалительном / цитокина среде , которая происходит в естественных условиях. В естественных условиях, две модели частичного рассечения были разработаны с использованием либо инцизионная или эксцизионная дефекты 20,21. Совсем недавно, Вонг и др., Характеризуется моделью зоны II травмы сухожилия сгибателя в мышиной модели 22. Это важное событие, поскольку оно позволяет вклад синовиальной оболочки клеток, полученных в процессе заживления, чтобы определить. Однако не поддаются количественной оценке Изменения в функции глиссирования были описаны с использованием этой модели. Каждая модель имеет свои преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать, в том числе технической легкости, клинической значимости и анатомии. Основным ограничением модели, описанной здесь является то, что заживление сухожилия может привести к разрыву до оценки, что делает его непригодным для дальнейшего анализа. Сбор достаточное количество клеток производится неосуществимо при таких обстоятельствах, и любой гистохимических анализ не является жизнеспособным, как разорванный сухожилия не следовать стандартному процессу заживления, описанный выше. Высвобождение сухожилия FDL проксимально, чтобы уменьшить нагрузку на заживление сухожилия, следовательно, является важным шагом для предотвращения, несмотря на то, что это не клинически значимым. Проведение операции в одностороннем порядке также снижает скорость разрыва. Другим ограничением является невозможность отслеживать вклад пери-сухожильных клеток оболочки, так как синовиальная оболочка не окружает сегмент FDL сухожилия, который получил травму в этой модели.
jove_content "> Важной функцией этой сгибателя модели ремонта сухожилие является то, что она позволяет оценить клеток на лечебница. Иммунофлуоресценции / иммуногистохимии (IHC) является общим биологическим методом, который может быть использован для характеристики этих клеток. В то время как ВВК уникально подходит для определения пространственной информации, она в значительной степени качественный метод. Изменения в ткани или клеточного состава по всей глубине ткани может быть пропущено, и количественное определение популяций трудно. Проточная цитометрия представляет собой идеальный подход для определения, количественной оценки и потенциально изолировать клетки популяции в процессе заживления. Тем не менее, выделение и переваривания заживления ткани сухожилия от этой модели урожайности очень низкие количества клеток для анализа потока цитометрии (1-2 × 10 5 в среднем от каждой мыши), и фиксации / шаги пермеабилизирующего для обнаружения внутриклеточных маркеров уменьшает это число дальше. с помощью цитологии центрифугирование сконцентрировать изолированных клеток, с последующим immunocytocheМистри, дает возможность охарактеризовать эти небольшие клеточные популяции. Существенным преимуществом этого метода является то, что нет необходимости в образцах пула вместе, чтобы получить достаточное количество клеток; поэтому каждая мышь представляет отдельный образец для анализа. Важным фактором при создании таких клеточных препаратов является поддержание согласованности в ткани заготовленной для анализа. Ближайшие мышцы и фасции могут прилипать к грануляционной ткани и должны быть тщательно отсечен. Так как этот метод включает в себя минимальный обработку клеток перед фиксацией на слайдах, она сохраняет большинство изолированных клеток для дальнейшего анализа. Таким образом, почти вся популяция клеток, образующих ткани на адгезию к месту ремонта может быть количественно оценена с помощью иммуногистохимии. В настоящем исследовании, введение EDU с помощью размножающихся клеток используется для демонстрации применения этого метода цитологии, однако, он также может быть использован для более сложной и углубленной характеристики Oе гетерогенных популяций клеток, участвующих в сгибателей сухожилие исцеления. Будущие приложения этой техники может привести к более глубинной характеристике клеточных популяций, участвующих в сухожилие исцеления, так как она позволяет определять совместную локализацию клеточных маркеров в клетках, связанных с грануляционной ткани в заживлении сухожилие.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Американским обществом по хирургии Pilot премии Hand и NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (до AEL) и NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
