Summary
हाथ में flexor tendons सामान्यतः घायल हुए हैं, बिगड़ा हाथ समारोह के लिए अग्रणी। हालांकि, निशान ऊतक चिकित्सा प्रतिक्रिया अच्छी तरह से विशेषता नहीं है। flexor कण्डरा चिकित्सा का एक murine मॉडल यहां प्रदर्शन किया है। यह मॉडल घाव भरने की प्रक्रिया के समग्र समझ बढ़ाने और चिकित्सा में सुधार करने के लिए चिकित्सकीय दृष्टिकोण का आकलन कर सकते हैं।
Abstract
कण्डरा कंकाल की मांसपेशियों और हड्डियों को जोड़ता है, लगभग पूरे शरीर की आवाजाही की सुविधा। हाथ में, flexor tendons (FTS) उंगलियों और सामान्य हाथ समारोह के बल सक्षम करें। Fts को चोट लगने की घटनाएं आम हैं, और संतोषजनक चिकित्सा अक्सर अतिरिक्त निशान ऊतक और कण्डरा और आसपास के ऊतकों के बीच adhesions के कारण बिगड़ा हुआ है। हालांकि, छोटे एफटी मरम्मत की आणविक और सेलुलर घटकों के बारे में जाना जाता है। कि अंत करने के लिए, एफटी मरम्मत की एक murine मॉडल है कि इस प्रस्ताव का बिगड़ा रेंज सहित मनुष्यों में उपचार के कई पहलुओं का स्मरण दिलाता है और यांत्रिक गुणों में कमी आई है, विकसित किया गया है और पहले से वर्णन किया। यहाँ इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया का एक में गहराई से प्रदर्शन प्रदान की जाती है, transection और murine हिंद पंजा में flexor digitorum longus (FDL) कण्डरा के बाद मरम्मत से जुड़े। इस तकनीक जीन लाभ या हानि के समारोह के प्रभाव का आकलन, और effi परीक्षण करने के लिए, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के वंश विश्लेषण का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताचिकित्सा की प्रक्रिया में औषधीय हस्तक्षेप के cacy। i) murine हिंद पंजा, जहां transection और मरम्मत होने के मध्य भाग में FDL पट्टा, एक श्लेष म्यान से घिरा हुआ नहीं है: हालांकि, इस मॉडल के लिए दो प्राथमिक सीमाएं हैं। इसलिए इस मॉडल निशान गठन की प्रक्रिया के लिए म्यान के संभावित योगदान के लिए खाते में नहीं है। द्वितीय) की मरम्मत साइट की अखंडता की रक्षा करने के लिए, एफटी myotendinous जंक्शन पर जारी की है, कण्डरा के यांत्रिक बलों कम है, की संभावना बढ़ गई निशान गठन में योगदान दे। प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान एफटी का दानेदार ऊतक से पर्याप्त कोशिकाओं का अलगाव चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है; इन कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करने की कोशिका विज्ञान centrifugation एक वैकल्पिक विधि का इस्तेमाल किया है, और सेल की तैयारी की पीढ़ी जिस पर immunofluorescent लेबलिंग किया जा सकता है के लिए अनुमति देता है। इस विधि के साथ, एफटी उपचार के दौरान कोशिकाओं या ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का ठहराव संभव हो जाता है।
Introduction
प्रकोष्ठ के flexor मांसपेशियों और डिजिटल शीथ के साथ संगीत कार्यक्रम में हाथ काम में flexor tendons अंकों के बल और हाथ की लोभी समारोह में सक्षम है। Flexor tendons हाथ की हथेली पहलू के साथ चलाने के; इस अपेक्षाकृत सतही स्थान अक्सर हाथ करने के लिए आघात के दौरान flexor tendons के घायल होने का परिणाम है। Tendons एक निशान ऊतक प्रतिक्रिया के बजाय सामान्य कण्डरा ऊतक 1 के उत्थान के माध्यम से चंगा। हालांकि इस निशान ऊतक कण्डरा को निरंतरता प्रदान करता है, समारोह नाटकीय रूप से स्वस्थ कण्डरा के सापेक्ष कम हो जाती है। कण्डरा-निशान ऊतक कंपोजिट बिगड़ा यांत्रिक गुणों 1 की विशेषता है, और अधिक होने की संभावना टूटना मरम्मत tendons प्रतिपादन। इसके अलावा, निशान ऊतक मूल निवासी कण्डरा कोलेजन फाइबर संरचना के संगठन का अभाव है, पट्टा आकार और थोक में वृद्धि हो जाती है। कण्डरा-म्यान इकाई की शारीरिक कमी है, यहां तक कि पट्टा आकार में एक मामूली वृद्धि को देखते हुए यह कर सकते तेजी से लालकण्डरा के ग्लाइडिंग समारोह, और गति और हाथ समारोह की इसलिए अंकों रेंज UCE।
Flexor tendons के लिए 1960 चोटों, विशेष रूप से हाथ की जोन द्वितीय में उन लोगों के लिए पहले, नियमित रूप से है कि इन मरम्मत 2 के साथ पैदा हुई उपचार में गंभीर जटिलताओं के कारण मरम्मत नहीं कर रहे थे। हाथ के इस क्षेत्र में 'कोई आदमी की भूमि' 3 के रूप में भेजा गया था। हालांकि, शल्य चिकित्सा तकनीक, सीवन पैटर्न और भौतिक चिकित्सा पुनर्वास प्रोटोकॉल में सुधार नाटकीय रूप से flexor कण्डरा मरम्मत 2 के परिणामों में सुधार हुआ है। इन अग्रिमों के बावजूद, मरम्मत का 40% तक पर्याप्त आसंजन गठन में परिणाम हाथ समारोह 4 बाधित करने के लिए। इसलिए, एक जैविक दृष्टिकोण चिकित्सा में सुधार की आवश्यकता है। दुर्भाग्य से, बहुत कम सेलुलर और आणविक स्तर पर पट्टा घाव भरने की प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है। इस प्रकार, लक्ष्य एक murine मॉडल है कि मौलिक समझ में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया गया थाflexor कण्डरा चिकित्सा और निशान गठन प्रतिक्रिया के सेलुलर और आणविक घटकों, चिकित्सा में सुधार करने के उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक साधन के रूप में के जी।
बड़ा पशु मॉडल flexor कण्डरा घाव भरने की प्रक्रिया की समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। कुत्ते और खरगोश के अध्ययन flexor tendons 5,6 के दोनों आंतरिक और बाह्य उपचार करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, स्थिरीकरण से 7 आसंजन गठन रिश्तेदार को कम करने में जल्दी नियंत्रित निष्क्रिय गति का महत्व है, साथ ही चिकित्सा की प्रक्रिया 8 के आधार पर अलग अलग सीवन पैटर्न का प्रभाव 9। इसके अलावा, कुत्ते मॉडल translational ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण का परीक्षण चिकित्सा 10 में सुधार करने में उपयोगी किया गया है। हालांकि, वहाँ एक बड़े जानवर मॉडल के लिए एक murine मॉडल रिश्तेदार, रिश्तेदार लागत, murine विशिष्ट अभिकर्मकों की उपलब्धता सहित का उपयोग करने में कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं, और वैश्विक knoc पैदा करने में आसानीकश्मीर बहिष्कार या ऊतक विशेष विलोपन / overexpression निर्माणों। इसके अलावा, flexor tendons 11 के संबंध में मानव और चूहों के बीच कार्यात्मक समानता एक murine मॉडल विकसित करने में संभावित उपयोगिता संकेत मिलता है।
flexor कण्डरा transection और मरम्मत mimics नैदानिक चिकित्सा के कई पहलुओं, प्रचुर मात्रा में निशान ऊतक और बिगड़ा यांत्रिक गुणों के गठन सहित के एक murine मॉडल का विकास। मॉडल यहाँ वर्णित आदेश मरम्मत साइट की रक्षा के लिए myotendinous जंक्शन पर FDL की transection के कारण नैदानिक अभ्यास के एक सच्चे संक्षिप्त नहीं है। इसके अलावा, इस मॉडल चिकित्सा प्रतिक्रिया के लिए श्लेष म्यान कोशिकाओं के योगदान के लिए खाते में नहीं है, जैसे कोई श्लेष कण्डरा जहां मरम्मत होता है की मध्य भाग को कवर म्यान है। इन सीमाओं के बावजूद, इस मॉडल murine मॉडल है कि अधिक Clos में प्रदर्शन किए जाने की गति को सीमित adhesions के सृजन रेंज है, जो अभी तक का लाभ दिया हैइली नैदानिक परिदृश्य लगभग। यह मॉडल नाक आउट माउस मॉडल 12,13 आकलन करने के लिए, और उपचार 14-17 में सुधार करने के लिए विभिन्न औषधीय दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऊतकीय इस मॉडल का विश्लेषण करती है, immunohistochemistry का उपयोग और सीटू संकरण में, चिकित्सा के दौरान महत्वपूर्ण जीन और प्रोटीन का स्थानीयकरण करने में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, ऊतक विज्ञान केवल एक पार के अनुभागीय स्थानिक विश्लेषण प्रदान करता है और पूरे ऊतक भर मात्रा का ठहराव की अनुमति नहीं देता। प्रवाह cytometry एक और मात्रात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन केवल कोशिकाओं का एक बहुत ही सीमित संख्या माउस मॉडल में चिकित्सा कण्डरा के ऊतकों से अलग किया जा सकता है, और इस संख्या में आगे निर्धारण, permeabilization, और वाशिंग चरणों के दौरान कमी आई है। खाते में लेते हुए, प्रवाह cytometry जानवरों की संख्या है कि आवश्यकता होगी के कारण एक अव्यावहारिक दृष्टिकोण बन जाता है। एक वैकल्पिक तरीका आदेश में इस छोटे से सेल की आबादी का बहुमत बनाए रखने के लिए आवश्यक हैआगे चिकित्सा परिवेश को चिह्नित करने के लिए। विधि यह पूरा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यहाँ दिखाया गया है, एक गिलास स्लाइड, immunocytochemistry द्वारा पीछा किया पर कोशिका विज्ञान centrifugation के माध्यम से अलग कक्षों की एकाग्रता शामिल है। वर्तमान अध्ययन edu (5-ethynyl-2'deoxyuridine, एक thymidine एनालॉग) में शामिल करने और बाद में लेबलिंग चिकित्सा स्थल पर कोशिकाओं के रिश्तेदार proliferative स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह दृष्टिकोण सेल प्रसार, जीन नाकआउट या overexpression पर औषधीय उपचार की प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए, या पहचान और अलग सेल आबादी यों के लिए लागू किया जा सकता है।
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Protocol
रोचेस्टर विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान पर विश्वविद्यालय समिति ने सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी। दस-12 सप्ताह पुरानी महिला C57BL / 6J चूहों का इस्तेमाल किया गया था।
Flexor कण्डरा सर्जरी के लिए पशुओं की 1. तैयारी (~ 15 मिनट)
- आटोक्लेव शल्य चिकित्सा उपकरणों, बाँझ भर बाँझ दस्ताने पहनते हैं, और एक बाँझ ऑपरेटिंग क्षेत्र बनाए रखने के लिए।
- एक ketamine की मात्रा (80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) शरीर के वजन को इसी के साथ intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से माउस anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी पलटा के अभाव के माध्यम से बेहोश करने की क्रिया की गहराई की पुष्टि करें।
- अग्रकय पीड़ानाश (buprenorphine, 0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से। बाहर सुखाने से आंखों को रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
- पूरे हिंद अंग पर फर कतरन द्वारा शल्य साइट तैयार करें। povidone आयोडीन के साथ फिर से povidone आयोडीन के साथ क्रमिक रूप से, 70% इथेनॉल के बाद स्क्रबिंग से त्वचा जीवाणुरहित, और।
- flexor digitorum longus (FDL) कण्डरा, बछड़ा की औसत दर्जे का पहलू में अल्पज्ञता देखा खोजें। एक छुरी का प्रयोग, कण्डरा बेनकाब करने के लिए सूक्ष्म कैंची के साथ त्वचा में एक छोटे से 0.5-1 सेमी चीरा बनाते हैं।
- आसपास के ऊतकों से FDL कण्डरा अलग और myotendinous जंक्शन करने के लिए इसे पता लगाने के लिए संदंश का प्रयोग करें। वसंत कैंची इसे जारी करने के साथ इस जंक्शन पर कण्डरा कट, देखभाल करने के पीछे tibial धमनी से बचने के लिए।
- 5-0 नायलॉन टांके के साथ त्वचा को बंद करें।
नोट: FDL transection और मरम्मत (कदम 2.4) एक stereomicroscope का उपयोग किया जाना चाहिए। - हिंद पंजा वसंत सूक्ष्म कैंची का उपयोग करने का posterolateral पहलू पर एक 3 मिमी चीरा। धीरे आसपास के कोमल ऊतक और संदंश के साथ मांसपेशियों को वापस लेना, ऊतकों को नुकसान कम करने, और FDL कण्डरा की पहचान करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
- धीरे FDL पट्टा बढ़ाने के लिए और पूरी तरह से मील का उपयोग कर इसे आड़ा काटसीआरओ-कैंची। FDL के सिरों कण्डरा एक साथ सीवन 8-0 टांके के साथ एक संशोधित केसलर पैटर्न में समय-समय पर नमक के साथ यह गीला करके कण्डरा के सूखने से परहेज।
- पट्टा खत्म मुलायम ऊतकों और मांसपेशियों को बदलें, फिर 5-0 नायलॉन टांके के साथ चीरा बंद करें।
- एक स्लाइड 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म सेट पर चूहों की जगह, शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए संज्ञाहरण से बरामद तक।
- चूहों पर नजर रखने के बाद operatively बढ़ा vocalizing और झालरदार फर सहित हानि या संक्रमण के लक्षण के लिए। buprenorphine (50 μl / माउस) एनाल्जेसिक चूहों जब तक हर 12 घंटा अब कोई दर्द या संकट के लक्षण दिखाने के रूप में इंजेक्षन।
- चूहों अगले कदम के लिए जारी रखने से पहले 10 दिनों के बाद सर्जरी की अवधि के लिए चंगा करने की अनुमति दें।
नोट: कोशिकाओं को किसी भी समय बिंदु के बाद सर्जरी में काटा जा सकता है। इधर, 10 दिन के इस समय में ऊतक के अपेक्षाकृत उच्च कोषमयता दिया ये प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए चुना जाता है।
3. labeliसाइकिलिंग प्रकोष्ठों के एनजी (~ 10 मिनट)
- Edu (5-ethynyl-2'deoxyuridine) समाधान तैयार (10 मिलीग्राम / बाँझ फॉस्फेट बफर खारा में मिलीलीटर [पीबीएस] + 1% डाइमिथाइल sulfoxide [DMSO] घुलनशीलता बढ़ाने के लिए)।
- आईपी इंजेक्शन के माध्यम से 100 μl edu (50 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों इंजेक्षन 24 घंटा का त्याग करने से पहले।
4. कोशिका विज्ञान केन्द्रापसारण के लिए फसल कोशिकाओं (2.5 मानव संसाधन, ~ 30 मिनट पर हाथ टाइम)
- पीबीएस में 3 मिलीग्राम / एमएल मैं collagenase तैयार करें।
- कोई अधिक से अधिक 3 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation के माध्यम से माउस euthanize, और एक माध्यमिक उपाय के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
- ऊपर 2.4 कदम का उपयोग कर मरम्मत कण्डरा जानें, और सूक्ष्म कैंची के साथ चोट साइट के दोनों तरफ के बारे में 2 मिमी काटने से कण्डरा ऊतक अलग।
- 3 मिलीग्राम / एमएल collagenase के 1 मिलीलीटर के साथ एक पेट्री डिश में छुरी के साथ कीमा ऊतक, तो ऊतक को तोड़ने के लिए एक 18 जी सुई के माध्यम से कई बार मिश्रण से गुजरती हैं। एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में मिश्रण लीजिए। झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कण्डरा ऊतक को पचाने।
- स्पिन ऊतक नीचे (5 मिनट के लिए 300 XG), महाप्राण कोलेजिनेस, तो कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा resuspend पीबीएस में 500 μl 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ कोशिकाओं / ऊतक।
- मलबे और कण्डरा के बड़े टुकड़े, और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अलग सेट को हटाने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर सेल निलंबन।
- कण्डरा ऊतक एक और 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें, और 1 मिलीलीटर collagenase समाधान के साथ ताज़ा, ऊपर और नीचे pipetting मिश्रण करने के लिए।
- ऊतक झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे सेते हैं।
- पचा कण्डरा ऊतक (5 मिनट के लिए 300 XG) नीचे स्पिन, तो ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे पीबीएस में 500 μl 3% BSA में resuspend।
- एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर, 4.3.3 में पृथक निलंबन के साथ गठबंधन है, तो एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती।
- पीबीएस में 3% BSA के साथ एक बार फिर कोशिकाओं को धो लें तो 3-6 को resuspend10 x 4/100 μl।
- एक सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड के लिए एक कोशिका विज्ञान कीप देते हैं और स्लाइड वाहक में ताला। एक कोशिका विज्ञान सेंट्रीफ्यूज में पूरे तंत्र डालें और कीप के लिए 100 μl सेल निलंबन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र स्लाइड पर कोशिकाओं को तितर-बितर करने के लिए।
5. Immunocytochemistry edu का पता लगाने के लिए (2 घंटा, ~ 45 मिनट पर हाथ टाइम)
नोट: सभी ऊष्मायन चरणों fluorophores के photobleaching सीमित करने अंधेरे में किया जाना चाहिए।
- एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम निम्नलिखित कदम के लिए आवश्यक समाधान को कम करने के साथ सर्किल कोशिकाओं, तो तुरंत कमरे के तापमान पर पीबीएस 15 मिनट में 150 μl 3% paraformaldehyde (आरटी) के साथ तय कर लो।
- पीबीएस में 150 μl 3% BSA के साथ 5 मिनट के लिए दो बार धोएं।
- 0.5% ट्राइटन एक्स 100 पीबीएस 20 मिनट में आरटी पर साथ Permeabilize कोशिकाओं।
- 5.1.1 के रूप में धो दोहराएँ कदम है।
- Edu प्रतिक्रिया cockt तैयारबीमार किट निर्देश 30 से अधिक नहीं उपयोग करने से पहले मिनट के हिसाब से।
- प्रत्येक स्लाइड के लिए 150 μl कॉकटेल जोड़ें, आरटी पर 30 मिनट सेते हैं।
- 5.1.1 के रूप में धो दोहराएँ कदम है।
- आरटी पर पीबीएस 30 मिनट में 2,000: 150 μl परमाणु counterstain Hoechst33342 पतला 1 के साथ सेते हैं।
- पीबीएस 1x 150 μl के साथ 5 मिनट के लिए दो बार धोएं।
- बुलबुले को रोकने के लिए कम coverslip जोड़े 1-2 बूँदें विरोधी फीका बढ़ते कोशिकाओं को मध्यम, फिर धीरे धीरे।
- बढ़ते मध्यम आरटी पर अंधेरे में रात इलाज करने की अनुमति दें।
- स्लाइड के लिए coverslip सील करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का प्रयोग करें।
- 40X बढ़ाई छवि स्लाइड एक फ्लोरोसेंट / उत्तेजना उत्सर्जन DAPI (Hoeschst33342) का पता लगाने में सक्षम फिल्टर के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग, और टेक्सास लाल (एलेक्सा स्त्राव 594)।
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Representative Results
Flexor digitorum longus (FDL) मांसपेशी, बछड़ा में स्थित है, (चित्रा 1 ए में नीले रंग में उल्लिखित, और चित्रा 2A में histologically दिखाया गया है) flexor कण्डरा के माध्यम से माउस हिंद पंजा के अंक फ्लेक्स के लिए है, जो myotendinous से proximally चलाता कार्य करता है जंक्शन और बाहर का phalanges में समाप्त। Flexor कण्डरा चिकित्सा के इस मॉडल में, FDL कण्डरा हिंद पंजा के अंक (लाल तीर, चित्रा 1 ए) के विभाजन के लिए transected और मिड-पैर में मरम्मत की है, समीपस्थ। मरम्मत, जो प्रयोगात्मक विश्लेषण बंद करना होगा का टूटना को रोकने के लिए, पट्टा (और आसन्न मांसपेशी) में कटौती, या myotendinous जंक्शन (चित्रा 1 बी में पीले तीर, रिलीज चित्रा 1C में दिखाया गया है) में जारी की है। हालांकि इस कदम नैदानिक परिदृश्य के प्रतिनिधि नहीं है, यह चोट साइट पर तनाव को कम करके मरम्मत की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 2 डीएक उठी flexor कण्डरा मरम्मत की एक ऊतकीय उदाहरण के लिए, चित्रा -2 में दिखाया गया एक सफल मरम्मत की तुलना में है। बाद में, दानेदार ऊतक को प्रदर्शित करता है के रूप में बहुत रिहाई का पट्टा (चित्रा 2 बी) की तुलना में कोषमयता वृद्धि हुई है, और इस सेल की आबादी तो एक स्लाइड immunocytochemistry द्वारा पीछा किया पर कोशिका विज्ञान centrifugation के माध्यम से आगे का विश्लेषण किया जा सकता है। चित्रा 3 मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा नए संश्लेषित डीएनए में edu समावेश के माध्यम से चिकित्सा tendons 10 दिनों के बाद मरम्मत से एकत्र कोशिकाओं के proliferative राज्य। Edu लेबलिंग इसलिए केवल उन कोशिकाओं है कि सक्रिय रूप से, के रूप में चित्रा 4 में देखा 24 घंटा अवधि लाइव चूहों में edu नाड़ी के बाद के दौरान प्रचूर मात्रा में पता चलता है। चिकित्सा कण्डरा के दानेदार ऊतक में प्रसार का एक मात्रात्मक आकलन तो बात-गणना के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है पूरे सेल तैयार की। इस तरह, prolife की एक आधारभूतराशन हर समय बिंदु पर स्थापित किया जा सकता है, और आनुवंशिक या औषधीय हस्तक्षेप के कारण किसी भी परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है।
चित्रा 1 :. Murine हिंद पंजा एनाटॉमी और Flexor digitorum longus कण्डरा की पहचान। Flexor digitorum longus (FDL) माउस हिंद पंजा में अंकों flexes और (FDL नीले रंग में उल्लिखित) जहां यह हिंद पंजा की हथेली पहलू के साथ चलाता है अंक (लाल तीर) (चित्रा 1 ए) में bifurcates। Proximally, FDL पट्टा, टखने की हड्डियों सुरंग (काला तीर) के माध्यम से चलाता बछड़ा में, myotendinous जंक्शन (पीले तीर) (चित्रा 1 बी) पर समाप्त। टूटना को रोकने के लिए myotendinous जंक्शन पर कण्डरा की रिहाई चित्रा 1C में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। अन घायल हो गए, सामान्य चिकित्सा और उठी flexor कण्डरा मरम्मत के प्रतिनिधि ऊतकीय छवियाँ murine हिंद पंजा में FDL कण्डरा के शरीर रचना विज्ञान चित्रा 2A में दिखाया गया है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़े 2 बी-डी में, कण्डरा एक अक्षुण्ण और उठी मरम्मत (आंकड़े -2 सी और 2 डी, क्रमशः) को रिहाई कण्डरा ऊतक (चित्रा 2 बी) की तुलना करने पर 8X बढ़ाया है। पूरे हिंद पंजा नमूने तटस्थ बफर formalin में तय किया गया, आयल में एम्बेडेड, 3 माइक्रोन वर्गों के लिए में कटौती, और के रूप में पहले 13 में वर्णित Alcian ब्लू / Hematoxylin / ऑरेंज जी के साथ दाग। मूल पट्टा नीले रंग में उल्लिखित है, पट्टा / दानेदार ऊतक समग्र हरे रंग में उल्लिखित है, और काला तीर टांके संकेत मिलता है। स्केल सलाखों 200 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। पीपट्टे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। प्रायोगिक प्रक्रिया edu क्लिक करें-यह रसायन शास्त्र सेल तैयारी पर पर दिन में 10 के बाद सर्जरी चिकित्सा FDL tendons माउस हिंद पंजे से विच्छेदित किए गए प्रदर्शन करते हैं। tendons तो कीमा थे कोलैजिनेज़ में दो घंटे मैं कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए पच। सेल निलंबन मलबे को हटाने के लिए तनावपूर्ण हो गया था, और ~ 6 एक्स 10 4 कोशिकाओं एक कोशिका विज्ञान सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर सकारात्मक आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर एक monolayer में घूमती रहे थे। कोशिकाओं को एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ परिक्रमा कर रहे थे और फिर paraformaldehyde के साथ तुरंत तय की। ट्राइटन X-100 के साथ permeabilization के बाद, कोशिकाओं एक edu पता लगाने के कॉकटेल के साथ इलाज किया गया है, और एक क्लिक के रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया शामिल edu के लिए एलेक्सा स्त्राव 594 बंधे। Hoechst 33342 कोशिकाओं को एक परमाणु दाग के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और wer ई एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ 10-40X पर विश्लेषण किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। Flexor कण्डरा हीलिंग हीलिंग FDL tendons के दौरान साइकिलिंग एडू-लेबल की कोशिकाओं के Immunocytochemistry विश्लेषण चूहों के हिंद पंजे 10 दिनों के बाद सर्जरी से काटा और एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए collagenase के साथ पचा रहे थे। Centrifugation स्लाइड पर एक monolayer, छवि edu समावेश करने के लिए immunocytochemistry के द्वारा पीछा में इन कोशिकाओं को फैलाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा -4 ए और चित्रा 4 बी immunocytochemical विश्लेषण निम्नलिखित कोशिकाओं के क्रमश: 10x और 40x पर लिया छवियों हैं। परमाणु दाग Hoechst 33342 नीला है, और कोशिकाओं है कि edu को शामिल किया है लाल के साथ बिंदीदार हैं। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
पूरा transection और flexor digitorum longus कण्डरा की मरम्मत के एक murine मॉडल के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया इस अध्ययन में प्रस्तुत किया है। इसके अलावा कोशिका विज्ञान सेंट्रीफ्यूज के साथ छोटे सेल आबादी ध्यान केंद्रित का एक उपन्यास आवेदन प्रदर्शन किया है, flexor कण्डरा उपचार के दौरान सेलुलर पर्यावरण के मात्रात्मक immunocytochemical विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। flexor कण्डरा की मरम्मत का यह मॉडल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चिकित्सा प्रतिक्रिया है, जो पीटकर मॉडल का उपयोग कर चिकित्सा की प्रक्रिया में परिवर्तन या औषधीय हस्तक्षेप के साथ आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता को दर्शाता है। सर्जरी के बाद, एक भड़काऊ प्रतिक्रिया 24 घंटा, जिसके दौरान कोशिकाओं चोट साइट के लिए भर्ती कर रहे हैं और रेशेदार ऊतकों की एक घट्टा आकार लेती भीतर शुरू होता है। एक proliferative चरण चार दिन, बहुत बढ़ कोषमयता और मरम्मत स्थल पर बेतरतीब बाह्य मैट्रिक्स की प्रचुर मात्रा में बयान से जुड़े बारे में इस प्रकार, 14-21 दिनों के बीच आसंजन के गठन के लिए अग्रणी। ऊतक remodeling कोंटीNues दिन 35 के माध्यम से, जिस पर समय निरंतरता और flexor कण्डरा के संगठन बहाल है, और कोषमयता 18 कम है।
वर्तमान में, वहाँ यहाँ प्रस्तुत एक के अलावा flexor कण्डरा की मरम्मत के कई murine मॉडल हैं। Tsubone एट अल।, Flexor कण्डरा चिकित्सा 19 की इन विट्रो मॉडल का वर्णन किया है। इस मॉडल के समय के साथ जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का आकलन कर सकते हैं, यह बाह्य कोशिकाओं या भड़काऊ / साइटोकाइन परिवेश कि विवो में होता है में परिवर्तन की भर्ती के लिए खाते में नहीं कर सकते हैं। विवो में, आंशिक transection के दो मॉडल या तो incisional या excisional का उपयोग कर विकसित किया गया है दोष 20,21। हाल ही में, वोंग एट अल।, एक murine मॉडल 22 में flexor कण्डरा चोट का एक जोन द्वितीय मॉडल की विशेषता है। यह एक महत्वपूर्ण विकास के रूप में यह अनुमति देता है घाव भरने की प्रक्रिया को श्लेष म्यान व्युत्पन्न कोशिकाओं के योगदान को परिभाषित किया जा रहा है। हालांकि, कोई मात्रात्मक ग्लाइडिंग समारोह में परिवर्तन इस मॉडल का उपयोग वर्णित किया गया है। प्रत्येक मॉडल अपने स्वयं के लाभ और सीमाओं कि तकनीकी आसानी, नैदानिक प्रासंगिकता और शरीर रचना विज्ञान सहित विचार किया जाना चाहिए है। मॉडल यहाँ वर्णित का एक मुख्य सीमा यह है कि चिकित्सा कण्डरा मूल्यांकन करने से पहले टूटना सकता है, यह आगे के विश्लेषण के लिए अनुपयोगी है। पर्याप्त कोशिकाओं की कटाई में इन परिस्थितियों में अव्यावहारिक बना है, और एक उठी कण्डरा मानक चिकित्सा ऊपर वर्णित प्रक्रिया का पालन नहीं करता है के रूप में किसी भी histochemical विश्लेषण व्यवहार्य नहीं है। FDL कण्डरा proximally विमोचन चिकित्सा कण्डरा पर तनाव कम करने के लिए इसलिए रोकथाम के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, तथ्य यह है कि यह चिकित्सकीय प्रासंगिक नहीं है के बावजूद है। सर्जरी का आयोजन एकतरफा भी टूटना की दर को कम करती है। एक और सीमा, पेरी-मांसल म्यान कोशिकाओं के योगदान को ट्रैक करने के लिए के रूप में श्लेष म्यान FDL पट्टा है कि इस मॉडल में घायल हो जाता है की खंड के चारों ओर नहीं है असमर्थता है।
jove_content "> इस flexor कण्डरा मरम्मत मॉडल का एक महत्वपूर्ण कार्य है कि यह चिकित्सा साइट पर कोशिकाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस / immunohistochemistry (आईएचसी) एक आम जैविक तकनीक है कि इन कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जबकि आईएचसी विशिष्ट रूप से अनुकूल है स्थानिक जानकारी के निर्धारण के लिए, यह काफी हद तक एक गुणात्मक विधि है। ऊतक या ऊतक की गहराई भर सेल संरचना में परिवर्तन याद किया जा सकता है, और आबादी की मात्रा का ठहराव मुश्किल है। प्रवाह cytometry परिभाषित यों और संभावित सेल को अलग-थलग करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है उपचार के दौरान आबादी है। हालांकि, अलगाव और चिकित्सा कण्डरा ऊतक के पाचन इस मॉडल की पैदावार से प्रवाह cytometric विश्लेषण (1-2 एक्स 10 प्रत्येक माउस से औसतन 5), और निर्धारण के लिए बहुत कम सेल नंबर / permeabilization कदम intracellular मार्कर का पता लगाने के लिए कम कर देता है इस संख्या के आगे। कोशिका विज्ञान centrifugation का उपयोग अलग कक्षों ध्यान केंद्रित करने, immunocytoche द्वारा पीछा कियामिस्त्री, इन छोटे सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण लाभ एक साथ पूल नमूने करने की कोई जरूरत के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए है कि वहाँ है; इसलिए प्रत्येक माउस के विश्लेषण के लिए एक व्यक्ति नमूना प्रतिनिधित्व करता है। इन सेल की तैयारी पैदा करने में एक महत्वपूर्ण विचार ऊतक विश्लेषण के लिए काटा में निरंतरता बनाए रखने की है। आसपास के मांसपेशियों और प्रावरणी दानेदार ऊतक का पालन कर सकते हैं और ध्यान से दूर विच्छेदित किया जाना चाहिए। चूंकि यह विधि कोशिकाओं स्लाइड पर निर्धारण करने से पहले कम से कम प्रसंस्करण शामिल है, यह आगे के विश्लेषण के लिए अलग कक्षों के बहुमत बरकरार रखती है। इस तरह, लगभग मरम्मत स्थल पर आसंजन ऊतक कोशिकाओं बनाने की पूरी आबादी मात्रात्मक immunocytochemistry के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, edu समावेश proliferating कोशिकाओं द्वारा इस कोशिका विज्ञान तकनीक के आवेदन प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि, यह भी अधिक जटिल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में गहराई लक्षण वर्णन ओflexor कण्डरा चिकित्सा में शामिल विषम सेल आबादी च। इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों, सेल कण्डरा चिकित्सा में शामिल आबादी की गहराई लक्षण वर्णन में और अधिक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में यह चिकित्सा कण्डरा में दानेदार ऊतक के साथ जुड़े कोशिकाओं में सेलुलर मार्करों के सह स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
इस काम आंशिक हाथ पायलट पुरस्कार और एनआईएच / NIAMS 1K01AR068386-01 (AEL) और NIAMS / एनआईएच P30AR061307 की सर्जरी के लिए अमेरिकन सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
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