Summary
손에 굴근 힘줄은 일반적으로 손상된 손 기능에 이르는 부상하고 있습니다. 그러나, 흉터 조직의 치유 반응은 잘 특징되지 않습니다. 굴곡 건 치유의 쥐 모델은 여기에 설명된다. 이 모델은 치유 과정의 전체적인 이해를 향상시키고 치유를 개선하는 치료 적 접근 방식을 평가할 수있다.
Abstract
건 거의 몸 전체의 움직임을 촉진, 골격 근육과 뼈를 연결합니다. 손에, 굴근 힘줄 (FT들)은 손가락과 일반 손 기능의 굴곡을 할 수 있습니다. FT들에게 부상은 공통이며, 만족스러운 치료는 종종 인해 과잉 흉터 조직 및 힘줄과 주변 조직 사이의 유착에 손상된다. 그러나, 거의 FT 수리의 분자 및 세포 성분에 대한 알려져있다. 이를 위해, 운동 장애를 포함한 다양한 인간 치료의 많은 부분을 되풀이되었습니다 및 기계적 특성을 저하 FT 수리의 뮤린 모델이 개발하고 이전에 설명되었다. 다음은이 수술에 대한 심층적 인 시위는 절개와 쥐의 뒷발의 굴곡 심지 longus (FDL) 힘줄의 후속 수리를 포함, 제공된다. 이 방법은 유전자 이득 또는 기능 상실의 영향을 평가하고 effi을 테스트하는 다른 세포 유형의 계통 분석을 수행하는데 사용될 수있다치유 과정의 약리학 적 개입 cacy. ⅰ) 절개 및 수리가 발생 쥐의 뒷발의 중간 부분에서 FDL 건을하는 활막 외피로 둘러싸여되지 않습니다 그러나,이 모델의 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 따라서이 모델은 흉터 형성 공정에 시스의 잠재적 인 기여를 고려하지 않는다. ii) 상기 보수 사이트의 무결성을 보호하기 위해, FT는 가능성 증가 흉터 형성에 기여하고, 힘줄의 기계적 힘을 감소시키는 상기 myotendinous 교차점에서 해제된다. 유세포 분석을위한 치료 과정 동안 FT의 육아 조직의 충분한 세포의 분리는 어려운 입증되었다; 이들 세포를 집중 세포학 원심 분리에 사용되는 다른 방법이며, 면역 표지가 수행 될 수있는 세포 제제의 생성을 허용한다. 이 방법, FT 치유하는 동안 세포 또는 관심의 단백질의 정량이 가능하게된다.
Introduction
굴근 팔뚝의 근육과 디지털 시스와 협력의 손 작업의 굴근 힘줄은 숫자의 굴곡과 손 잡고 기능을 활성화합니다. 굴근 힘줄은 손의 손바닥 측면을 따라 실행; 이 상대적으로 피상적 인 위치는 종종 손에 외상 동안 굴근 힘줄에 손상을 초래한다. 힘줄은 정상 힘줄 조직을 하나의 흉터 조직 응답보다는 재생을 통해 치유. 이 반흔 조직이 건에 연속성을 제공하지만, 기능은 건강한 건에 비해 감소 극적으로된다. 건 - 흉터 조직 복합체가 파열 할 가능성이 복구 된 힘줄을 렌더링, 장애인 기계적 특성 (1)을 특징으로한다. 또한 흉터 조직이 힘줄의 크기와 부피의 증가의 결과로, 고유 힘줄 콜라겐 섬유의 조직 구조 없다. 힘줄 - 시스 유닛의 해부학 적 제약, 건 크기도 완만 한 증가를 감안할 수 과감하게 빨간색활공 힘줄의 기능 및 동작과 손 기능에 따라서 숫자 범위를 UCE.
굴근 건에 1960의 부상, 손의 영역 II에서 특히 이전에 정기적으로 인해이 수리 2 일어나 치유의 심각한 합병증을 수리되지 않았다. 손이 지역은 '어떤 사람의 땅'3라고 하였다. 그러나, 수술 기법, 봉합 패턴과 물리 치료 재활 프로토콜의 개선은 크게 굴곡 건 수리 (2)의 결과를 개선했다. 이러한 발전에도 불구하고, 수리 40 % 손 함수 (4)를 방해하기에 충분한 유착 형성 될. 따라서, 생물학적 방법은 치료를 개선 할 필요가있다. 불행하게도, 약간은 세포 및 분자 수준에서 건 치료 과정에 대한 알려져있다. 따라서, 목표는 기본 understandin을 향상시키기 위해 사용될 수있는 쥐 모델을 개발했다치유를 개선하는 신규 한 치료 표적을 식별하기위한 수단으로서 굴근 힘줄 치유 및 흉터 형성 반응의 세포 및 분자 성분의 g.
큰 동물 모델은 굴근 건 치유 과정의 이해를 증진하는 수단이되고있다. 송곳니 토끼 연구는 굴근 힘줄 -5,6-의 고유 및 외부 치유 능력을 모두 증명 고정화 7 유착 형성에 대하여 최소화 초기 제어 수동 동작의 중요성뿐만 아니라, 치유 과정 8 가지 봉합 패턴의 영향 9. 게다가, 송곳니 치유 모델 (10)을 개선하기 위해 병진 조직 공학 방법을 테스트하는데 유용하고있다. 그러나, 상대적 비용, 뮤린 특정 시약의 이용 가능성을 포함하는 많은 동물 모델 쥐 모델 대하여 사용의 몇 가지 중요한 이점은, 글로벌 공사 생성의 용이성또는 조직 특이 삭제 / 과발현 구조 아웃 케이. 또한, 굴근 힘줄 (11)에 대한 인간과 쥐 사이의 기능적 유사성은 쥐 모델 개발에 잠재적 인 유틸리티를 나타냅니다.
굴근 건 절개 및 수리 모방 풍부한 흉터 조직 및 장애 기계적 특성의 형성을 포함하여 임상 치료의 여러 측면의 쥐 모델 개발. 여기에 설명 된 모델은 복구 사이트를 보호하기 때문에 myotendinous 접합부에서 FDL의 절개로 임상의 진정한 재현부 아니다. 복구가 발생하는 힘줄의 중앙 부분을 더 덮고 활막 시스가없는 더욱이,이 모델은 치유 응답 활막 세포 외피의 기여를 고려하지 않는다. 이러한 제한에도 불구하고,이 모델은 뮤린 모델이 더 클에서 입증 될 아직 움직임이 제한 유착의 발생 범위의 이점을 갖는다엘리는 임상 시나리오에 근접. 이 모델은 녹 - 아웃 마우스 모델 (12, 13)을 평가하고, 치료 14-17을 향상시키는 다른 약물 학적 방법을 테스트하기 위해 사용되어왔다. 조직 학적는 면역 조직 화학 염색을 사용하여,이 모델 분석 및 현장 하이브리드에, 치료 동안 키 유전자와 단백질의 현지화에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 조직학는 단면 공간 분석을 제공하고, 전체 조직에 걸쳐 정량화를 허용하지 않는다. 유세포보다 정량적 방법을 나타내지 만, 전지의 수가 매우 제한 마우스 모델에서 치료 힘줄 조직으로부터 단리 할 수 있고,이 수는 상기 고정, permeabilization과 세정 단계 동안 감소된다. 계정에이 촬영, 세포 계측법으로 인해 요구되는 동물의 수에 실행할 수없는 접근을하게 흐른다. 다른 방법은 주문이 소세포 인구의 대부분을 보존 할 필요가있다상기 치료 환경을 특성화. 여기에 도시이를 달성하기 위해 사용 된 방법은, 면역 세포이어서 유리 슬라이드 상에 세포학 원심 분리를 통해 분리 된 세포의 농도를 포함한다. 본 연구 EDU (5- 에틴 2'deoxyuridine, 티미 딘 유사체)에 통합 이후 라벨링 치료 부위에서 세포 증식의 상대적인 상태를 판정하는데 사용되었다. 이 방법은 세포 증식 유전자 녹아웃 또는 과발현에 약물 치료의 효능을 테스트하기 위해, 또는 다른 세포 집단을 식별 및 정량화에 적용 할 수있다.
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Protocol
로체스터 대학의 동물 연구에 대학위원회는 모든 동물 실험을 승인했다. 열-12 주 된 여성 C57BL은 / 6J 마우스를 사용 하였다.
굴근 힘줄 수술에 대한 동물의 1. 준비 (~ 15 분)
- 오토 클레이브 수술기구는 소독을 통해 멸균 장갑을 착용하고, 무균 조작 필드를 유지합니다.
- 체중에 대응하는 양의 케타민 (80 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사 (IP)를 통해 마우스를 마취. 발가락 - 핀치 반사의 부재를 통해 진정의 깊이를 확인합니다.
- 피하 주사를 통해 선제 진통제 (프레 노르 핀, 0.05-0.1 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다. 건조에서 눈을 방지하기 위해 안과 연고를 적용합니다.
- 전체 뒷다리에 모피를 클리핑하여 수술 부위를 준비합니다. 포비돈 요오드 다시 70 % 에탄올 다음 포비돈 요오드로 순차, 세정하여 피부를 소독하고.
- 종아리의 내측 측면에서 표면적으로 보이는 굴곡 심지 longus (FDL) 건을 찾을 수 있습니다. 메스를 사용하여 건을 노출 마이크로 가위로 피부에 작은 0.5 cm의 절개를합니다.
- 주변 조직에서 FDL 건을 분리하고 myotendinous 접합에 그것을 추적 집게를 사용합니다. 후방 경골 동맥 않도록주의하면서 그것을 풀어 봄 가위로이 접합에 힘줄을 잘라.
- 5-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다.
참고 : FDL의 절개 및 수리 (2.4 단계) 실체 현미경을 사용하여 수행해야합니다. - 봄, 마이크로 가위를 사용하여 뒷발의 외측면에 걸쳐 3mm의 절개를합니다. 부드럽게 조직 손상을 최소화하고, FDL 건을 확인해야하고, 집게로 주변의 연부 조직과 근육을 수축.
- 조심스럽게 FDL 건 올리고 완전히 마일을 사용하여 가로로 쪼개다CRO 가위. 주기적 식염수로 습윤함으로써 힘줄의 건조를 방지 8-0 봉합 변형 케슬 패턴 힘줄 함께 FDL의 단부 봉합사.
- 힘줄을 통해 부드러운 조직과 근육을 교체 한 후 5-0 나일론 봉합사와 절개를 닫습니다.
- 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해, 37 ° C에 슬라이드 따뜻한 설정에 마우스를 놓습니다.
- 수술 후 증가 가창과 주름 장식 모피를 포함하여 손상이나 감염의 징후 마우스를 모니터링합니다. 마우스까지 매 12 시간이 더 이상 통증이나 고통의 흔적을 보여주지 진통제로 부 프레 노르 핀 (50 μL / 마우스)를 주입한다.
- 마우스는 다음 단계를 계속하기 전에 십일 수술 후 기간 동안 치료를 할 수 있습니다.
참고 : 세포가 언제든지 포인트 수술 후 수확 할 수있다. 다음 10 일이 때 조직의 상대적으로 높은 세포 수를 소정 이러한 대표적인 실험을 위해 선택된다.
3. Labeli사이클링 세포 NG (~ 10 분)
- EDU (5- 에틴 2'deoxyuridine) 용액을 준비한다 (멸균 인산 완충 식염수에 10 ㎎ / ㎖를 [PBS]은 + 1 % 디메틸 술폭 시드 [DMSO] 용해도를 증가시키기 위해).
- IP 주입을 통해 희생하기 전에 24 시간을 100 ㎕를 EDU (50 ㎎ / ㎏)와 마우스를 주입한다.
세포학 원심 분리 4. 수확 셀 (2.5 시간 ~ 30 분 실습 시간)
- PBS에서 3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 I을 준비합니다.
- 이하 3 L / min의 유량으로 이산화탄소 질식 통해 마우스를 안락사 및 보조 수단으로 경추 탈구를 수행한다.
- 위의 단계 2.4을 사용하여 수리 건을 찾은 마이크로 가위로 부상 사이트의 양쪽에 약 2 mm로 절단하여 힘줄 조직을 격리 할 것.
- 3 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 1 mL를 페트리 접시에 메스 말하다 조직은 다음 조직을 분쇄하기 위해 18 G 바늘을 여러 번을 통해 혼합물을 전달합니다. 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브로 혼합물을 수집합니다. 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 건 조직 다이제스트.
- 스핀 다운 조직 (5 분 300 XG), 흡 콜라게나 후 수회 피펫을 상하로 PBS 500 ㎕의 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 세포 / 조직을 재현 탁.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포 현탁액 파편과 힘줄의 큰 조각, 그리고 37 ° C 배양기에서 따로 설정을 제거합니다.
- 또 다른 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 힘줄 조직을 배치하고 최대 피펫 팅, 1 ml의 콜라겐 용액으로 새로 고침 아래로 혼합.
- 진탕 37 ° C에서 조직에게 또 다른 시간을 품어.
- 소화 건 조직 (5 분 300 XG)를 스핀 다운, 다음, 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 PBS 500 ㎕의 3 % BSA에 재현 탁.
- , 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터 4.3.3에 고립 된 서스펜션과 결합, 다음 혈구와 세포를 계산합니다.
- 다음 3-6로 재현 탁, PBS에서 3 % BSA와 함께 다시 한 번 세포를 씻으× 10 1백분의 4 μL.
- 양으로 하전 된 슬라이드에 세포 검사 깔때기를 연결하고 슬라이드 캐리어에 고정. 세포학 원심 분리기로 전체 장치를 삽입하고 깔때기에 100 ㎕의 세포 현탁액을 추가합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기는 슬라이드에 세포를 분산합니다.
5. 면역 세포 화학이 EDU를 감지하기 (2 시간 ~ 45 분 실습 시간)
주 : 모든 인큐베이션 단계는 형광체의 광표백을 제한하는 암에서 수행되어야한다.
- 단계에 따라 필요한 용액을 최소화 소수성 장벽 펜, 원형 셀, 즉시 실온에서 15 분간 PBS 150 ㎕의 3 % 파라 포름 알데히드 (RT)로 고정한다.
- PBS 150 ㎕의 3 % BSA 5 분 동안 두 번 씻으십시오.
- RT에서 PBS 20 분에서 0.5 % 트리톤-X 100 Permeabilize 하시려면 세포.
- 5.1.1에서와 같이 반복 세척 단계.
- 에듀 반응 cockt 준비괴롭히다 킷 지시하게 사용하기 전에 최소 30 이상에 따라.
- 각 슬라이드에 150 μl의 칵테일을 추가 RT에서 30 분을 품어.
- 5.1.1에서와 같이 반복 세척 단계.
- RT에서 PBS 30 분에서 2000 : 핵 Counterstain과 Hoechst33342 1 희석 150 μL와 함께 품어.
- PBS 1 배 150 ㎕를 5 분 동안 두 번 씻으십시오.
- 천천히, 1-2 세포에 매체를 장착 안티 - 페이드 방울 거품을 방지하기 위해 낮은 커버 슬립을 추가합니다.
- 실온에서 어둠 속에서 밤새 치료 매체를 장착 할 수 있습니다.
- 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉하기 위해 명확한 매니큐어를 사용합니다.
- DAPI (Hoeschst33342)를 검출 할 수 여기 / 방출 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하여 40X 배율에서 이미지 슬라이드, 텍사스 레드 (알렉사 플 루어 594).
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Representative Results
굴근 심지 longus 종아리에있는 (FDL) 근육,의 myotendinous에서 근위 실행되는, (도 1a에 파란색으로 설명하고,도 2a에 조직 학적으로 표시) 굴근 건을 통해 마우스의 뒷발의 숫자를 플렉스 역할 접합 및 원위 지골의 종료. 상기 뒷발의 숫자 (빨간색 화살표, 그림 1A)에있는 분기에, 근위을 굴근 건 치유의이 모델에서, FDL 건은 횡단하고, 중간 발에서 제품을 수리. 실험 분석을 배제 할 수리의 파열을 방지하기 위해 건 (인접 근육)을 절단, 또는 myotendinous 접합 (그림 1B 노란색 화살표, 그림 1C에 표시된 자료)에서 발표했다. 이 단계는 임상 시나리오를 나타내는 것은 아니지만,이 부상 부위의 변형을 감소시킴으로써 보수를 보호하는 것이 중요하다.도 2D도 2c에 도시 성공 보수에 비해 파열 굴근 건 수리의 조직 학적 예입니다. 후자에서, 육아 조직 디스플레이는 크게 손상되지 않은 건 (도 2B)에 비해 세포 수를 증가하고,이 세포 집단은 면역 세포 따르는 슬라이드에 세포학 원심 분리를 통해 추가 분석 할 수있다. (3)를 평가하기 위해 사용 된 실험 절차를 설명 도표 새로 합성 된 DNA에 듀 통합을 통해 힘줄에게 십일 후 수리를 치유에서 수집 한 세포의 증식 상태입니다. 에듀 라벨 따라서 그림 4와 같이 적극적으로 살아있는 쥐의 듀 펄스 다음 24 시간 기간 동안 증식 만 셀을 보여줍니다. 치유 힘줄의 육아 조직의 증식의 정량적 평가는 다음 포인트 계산에 의해 결정될 수있다 전체 세포 제제. 중절 합법화 이런 방식으로, 기저배급량은 각 시점에서 설정 될 수 있고, 유전 적 또는 약학 적 개입에 대한 변경이 부과 될 수있다.
그림 1은 :. 쥐 뒷발 해부학과 굴근 심지 Longus 힘줄의 식별. 굴근 심지 longus (FDL)는 마우스 뒷 발에 자리 노끈과 (FDL가 파란색으로 설명) 곳을 뒷발의 손바닥 측면을 따라 실행 숫자 (빨간색 화살표) (그림 1A)로 분기합니다. 근위의 FDL 건은 myotendinous 접합 (노란색 화살표) (그림 1B)에서 끝나는, 종아리에, 눈꺼풀 터널 (검은 색 화살표)을 통해 실행됩니다. 파열을 방지하기 위해 myotendinous 접합에서 힘줄의 릴리스도 1c에 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 않은 부상, 일반 치유와 파열 굴근 힘줄 수리의 대표 조직 학적 이미지 쥐의 뒷다리 발에서 FDL 건의 해부학 그림 2A에 표시됩니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 도 2B-D에서 건은 손상 및 파손 수리 (도 2C 및 2D, 각각)에 손상되지 않은 건 조직 (그림 2B)를 비교하는 8X로 확대됩니다. 항목의 뒷발 샘플은 3 μm의 섹션에 절단, 파라핀, 중성 완충 포르말린에 고정하고, 이전 13 설명 된대로 알 시안 블루 / 헤 마톡 실린 / 오렌지 G로 염색 하였다. 기본 힘줄이 파란색으로 설명되어, 건 / 육아 조직의 합성은 녹색으로 설명하고, 검은 색 화살표는 봉합을 표시합니다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. P임대이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 실험 절차는 EDU는 클릭을 화학 셀 준비에 FDL의 힘줄을 치료 10 일 후 수술 마우스 뒷발에서 해부에 수행합니다. 힘줄은 다진 난 세포를 떼어 놓다하는 콜라게나에서 2 시간 동안 소화했다. 세포 현탁액은 이물질을 제거하는 변형하고, ~ 6 × 104 세포를 세포학 원심 분리기를 사용하는 양으로 하전 된 유리 슬라이드 위에 단층으로 방사 하였다. 세포는 소수성 장벽 펜으로 원하고 파라 포름 알데히드 즉시 고정시켰다. 트리톤 X-100 permeabilization 후, 세포는 듀 검출 칵테일로 처리하고, 클릭 화학 반응은 인용 듀 알렉사 형석 594 바인딩. 훽스트 33342 염색 핵으로서 사용하고, 셀 하였다 WER 형광 현미경으로 10-40X에서 분석 전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 굴근 힘줄 치유 치유 FDL 힘줄 동안 자전거 에듀 표지 세포의 면역 세포 화학 분석 쥐의 뒷다리 발 십일 후 수술에서 수확 및 세포 현탁액을 얻기 콜라게나로 소화했다. 원심 분리 이미지 에듀의 결합에 면역 세포 다음 슬라이드에 단층으로이 세포를 분산하는 데 사용되었다. 도 4a 및도 4b는 면역 세포 화학적 분석 다음 셀 각각 10X 및 40X에서 찍은 사진이다. 핵 얼룩의 Hoechst 33342은 파란색이며, 에듀를 통합 한 세포는 빨간 점 재해있다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg"대상 = "_ 빈"HREF>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
완전 절개와 굴곡 심지 longus 건 수리의 쥐 모델에 대한 수술은이 연구에서 제시된다. 또한 세포학 원심 작은 세포 집단을 농축하는 새로운 애플리케이션은 굴근 힘줄 치유 동안에 셀룰러 환경의 면역 세포 화학적 정량 분석을 가능하게 입증된다. 굴근 힘줄이 수리 모델 녹아웃 모델을 사용하여 치료 과정에서 변경 또는 약리학 적 개입을 평가하기 위해 사용될 수있는 재현성 치유 반응을 보여준다. 수술 후, 염증 반응 세포가 상처 사이트에 모집 및 섬유 조직의 캘러스가 형성되기 시작하는 동안 24 시간 내에 시작합니다. 증식 단계는 14-21일 사이에 유착 형성을 선도 크게 증가 세포 수 및 복구 사이트에서 조직을 파괴 세포 외 기질의 풍부한 증착과 관련된 일 네, 약에 따른다. 조직 리모델링 콘티nues 일 (35),되는 시간의 연속성과 굴근 건 조직이 복원되고, 세포 수는 18 감소된다.
현재, 여기에 제시된 하나에 추가 굴근 건 수리의 여러 쥐 모델이있다. Tsubone 등., 굴곡 건 치유 (19)의 체외 모델을 설명했다. 이 모델은 시간에 따른 유전자 발현의 변화를 평가할 수 있지만, 외부 세포 또는 생체 내에서 일어나는 염증 / 사이토킨 환경 변화의 채용을 설명 할 수있다. 생체는 부분 절개 두 모델 절개 나 절제를 사용하여 개발되어왔다 결함 (20, 21). 최근 웡 외.은 뮤린 모델 22 굴근 힘줄 부상 영역 II 모델을 특징으로한다. 그 치유 과정에 활액 외피 - 유래 세포의 기여가 정의 할 수 이것은 중요한 발전이다. 그러나, 정량화 할 수 없다 글라이딩 함수의 변화는이 모델을 사용하여 설명되었다. 각 모델은 자신의 장점과 기술적 용이성, 임상 관련성 및 해부학을 포함하여 고려되어야 한계가있다. 여기에 설명 된 모델의 주요 제한은 치유 건은 추가 분석을 위해 사용하지 못할 렌더링, 평가 이전에 파열 수 있다는 것이다. 충분한 세포를 수확하여 이러한 상황에서 실행할 수 없게 만들고, 파열 힘줄 상술 한 표준 치료 과정을 수행하지 않고 임의의 조직 화학 분석이 아닌 실용적이다. 치유 건에 부담을 감소 근위 FDL 건을 떼면 따라서는 임상 적으로 관련이없는 사실에도 불구하고 예방을위한 중요한 단계이다. 수술을 실시하는 것은 일방적으로도 파열의 속도를 낮 춥니 다. 또 다른 제한은 활막 시스는이 모델에서 부상 FDL 힘줄의 세그먼트를 둘러싸는 없기 때문에, 조갑 건의 시스 세포의 기여를 추적 할 수 없다는 것이다.
jove_content ">이 굴근 힘줄 수리 모델의 중요한 기능은 치료 부위에서 세포의 평가를 허용한다는 것이다. IHC 고유하게 적합하지만 면역 형광 / 면역 조직 화학 (IHC)이. 이들 세포를 특성화하는 데 사용될 수있는 일반적인 생물학적 기법 공간 정보의 결정을 위해, 상기 조직의 깊이에 걸쳐 조직 또는 세포 성분의 변화가 놓칠 수있다. 대체로 질적 방법이며, 인구의 정량은 곤란하다. 유동 세포 계측법 세포를 분리 잠재적 정의 정량화하는 이상적인 방법을 나타낸다 치료 기간 동안 인구. 세포 마커의 검출 감소를위한 그러나, 유세포 분석 (각 마우스에서 평균 1-2 × 10 5), 및 고정이 모델 수율에서 격리 및 치료 건 조직의 소화 매우 낮은 세포 수 / permeabilization 단계 immunocytoche 다음에 분리 된 세포를 집중 세포 검사 원심 분리를 사용하여 더이 수.,Mistry의 이러한 작은 세포 집단을 특성화하는 방법을 제공한다. 이 기술의 중요한 장점은 충분한 세포를 수득하기 위해 함께 풀 샘플 할 필요가 없기 때문이다; 따라서 각 마우스는 분석을위한 개별 샘플을 나타냅니다. 이러한 세포 제제를 생성하는데 중요한 고려 사항은 분석을 위해 수확 된 조직의 일관성을 유지한다. 주변의 근육과 근막은 육아 조직을 준수 할 수 조심스럽게 해부해야합니다. 이 방법은 슬라이드에 고정하기 전에 세포의 최소한의 처리를 수반하기 때문에, 추가 분석을 위해 분리 된 세포의 대부분을 유지한다. 이와 같이, 복구 현장에서 부착 조직을 구성하는 세포의 거의 전체 모집단 정량적 면역 세포를 통해 평가 될 수있다. 본 연구에서, 세포 증식에 의해 EDU 혼입이 세포 검사 기술의 적용을 설명하는 데 사용하지만, 또한보다 복잡한 사용 및 심층 특성화 O 수굴곡 건 치유에 관여하는 이종의 세포 집단 (F). 그것이 치유 건에서 육아 조직과 관련된 세포에서 세포 마커의 공동 현지화를 결정하는 허용하는이 기술의 미래 응용 프로그램은 건 치유에 관여하는 세포 집단의 깊이 특성에 더 발생할 수 있습니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 손 파일럿 수상 및 NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (AEL에) 및 NIAMS / NIH P30AR061307의 수술에 대한 미국 사회에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
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