genotypebestemmelse af Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) er kendt som den vigtigste patogen verdensplan ansvarlig for intramammær infektion (IMI) hos kvæg ^1. Undersøgelsen fra Fournier et al. ² demonstreret i schweiziske køer og undersøgelserne af Cosandey et al. ³ og Boss et al. ⁴ i køer af 12 europæiske lande, at S. aureus isoleret fra kvæg IMI er en genetisk heterogen gruppe. Ved PCR-amplifikation af 16S-23S rRNA intergeniske spacerregion (RS-PCR), blev i alt 17 genotyper initialt detekterede i 101 epidemiologisk uafhængige isolater ^2. Genotype B og genotype C (GTC) var mest almindelige (80%), mens de øvrige 15 genotyper (GTS) forekom sjældent, hver gør 1 til 4% af alle isolater. På europæisk plan ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, og GTR var de vigtigste genotyper omfatter 76% af alle analyserede stammer (n = 456). GTB var beliggende i Centraleuropa whereas de andre genotyper blev formidles bredt. De resterende 24% af stammerne omfattede 41 genotyper, mange af dem blev dog observeret én gang.

Undersøgelserne af Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, og Graber et al. ⁵ viste endvidere, at genotyperne blev stærkt forbundet med deres virulens gen mønster, såvel som på den schweiziske som på europæisk plan. Undersøgelserne viste også massive forskelle i IMI prævalens blandt S. aureus GTB, GTC og de andre genotyper ^2,5: overvejer GTB, op til 87% af køer i en besætning var smittet af denne genotype. I tilfælde af GTC og de andre genotyper imidlertid IMI blev kun fundet i 1 til 2 køer af en besætning.

IMI forårsaget af S. aureus, resulterer normalt i inflammation af de tilsvarende brystkirtler og en stigning af inflammatoriske celler i mælk. Som følge heraf er den somatiske celler counts i mælk (SCC), den centrale indikator for mælkekvalitet i de fleste lande, øges fører til en nedsat mælkepris eller endda levering stop.

Udover RS-PCR af Fournier et al. ^2, har andre typningsmetoder blevet beskrevet til subtypning bovine stammer af S. aureus ^8-11. To almindelige omfatter spa skrive ¹² og Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. Førstnævnte ene er baseret på DNA-sekventering den variable spacerregionen af stafylokok spa genet, der koder for protein A, hvorimod den sidstnævnte kræver sekventering af 7 husholdningsgener. Det betyder, at en ¹² og syv PCR'er ¹³ henholdsvis skal udføres, fulgt af amplicon oprensning, sekventering reaktion og analyse med specifikt udstyr. Sammenlignet med RS-PCR, kræver disse fremgangsmåder en betydelig ekstra indsats i laboratoriet resulterer i en lav produktivitet og høje omkostninger. Detgennemløb er særlig lav for PFGE. I betragtning af løsningen af disse metoder for kvæg stammer af S. aureus, RS-PCR er mindst lige så god som spa skrive ⁴ og bedre end MLST ⁴ eller PFGE ^15.

Alle disse metoder, herunder binære skrive ¹³ demonstrerede deres effektivitet i at opnå yderligere indsigt i patogenesen af kvæg IMI forårsaget af S. aureus, men på grund af de nævnte begrænsninger, de er mindre egnede til store kliniske undersøgelser. Desuden genotypning af RS-PCR som beskrevet af Fournier et al. ² tillader pålidelig forudsigelse af den epidemiologiske og den patogene potentiale S. aureus involveret i kvæg IMI, to centrale værdier i klinisk veterinærmedicin.

Protocol

1. Staphylococcus aureus isolater

1. Spred 10 pi S. aureus stamkultur eller en koloni dyrket på et selektivt medium på Columbia-agarplader indeholdende 5% fåreblod (BA).
2. Inkubér aerobt ved 37 ° C i 18 timer til 24 timer.

2. DNA ekstraktion

1. Forbered TEL buffer indeholdende 10 mM Tris-HCl og 10 mM _Na2EDTA, pH 8,5. Der forberedes delprøver og autoklave ved 121 ° C i 15 min.
2. Indsaml 1 koloni fra BA anvendelse af en steril plastik sløjfe eller en steril træ tandstikker og resuspender i 100 pi TEL. Brug 1,5 ml rør med skruelåg.
3. Inkuber ved 95 ° C i 10 min. Bagefter straks placere prøverne på våd is.
4. Fortynd prøverne 1: 100 i _H2O egnet til PCR (= template DNA til PCR). De ikke-fortyndede og fortyndede prøver kan opbevares ved -20 ° C i 1 måned.

3. RS-PCR

H2O, 12,5 pi Taq Master Mix, 2 pi G1 primer 10 pM, 2 pi L1 primer 10 uM, og 7 pi template-DNA, der svarer til ca. 30 ng af ren DNA ^2.
1. Kør følgende cykling program i en standard PCR variator: 15 min 95 ° C, efterfulgt af 27 cyklusser bestående 94 ° C i 1 min, efterfulgt af en 2 min rampe og annealing ved 55 ° C i 7 min. Efter yderligere 2 min rampe, strækker ved 72 ° C i 2 min. Afslut PCR af en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 minutter efterfulgt af afkøling til 4 ° C.
   BEMÆRK: PCR-produkterne kan opbevares ved -20 ° C i 5 dage.
2. For hver kørsel af RS-PCR omfatter en positiv kontrol, dvs. en prøve med en kendt genotype (normalt GTB), og en negativ kontrol _(H2O).

4. Elektroforese

1. Brug en kommerciel miniaturiseret elektroforese kit til DNA (MED kit) sammenmed en Bioanalyzer tilsluttet en pc og den installerede software. Undersøgelse de tilsvarende håndbøger fra producenten nøje.
2. Opsæt chip priming station og justere sprøjten klip ifølge manualen fra producenten.
3. Forbered gel-dye mix ifølge manualen fra producenten.
4. Ilægning af gel-dye mix (ifølge manualen af ​​fabrikanten).
   1. Ækvilibrere gelen-farvestof blanding til stuetemperatur i 30 minutter før brug.
   2. Sæt ny DNA-chip på chippen priming station. Pipette 9 pi af gel-dye i godt afmærkede G.
   3. Sørg for, at stemplet er placeret på 1 ml, og luk derefter chip priming station. Tryk stemplet, indtil den holdes af sprøjten klip. Vent præcis i 30 sek og slip derefter sprøjten klip.
   4. Vent 5 sek. Træk langsomt tilbage stemplet til 1 ml position.
   5. Åbent chip priming station og pipette 9 pi af gel-dye i begge brønde mærket "G".
5. Ilægning af Marker
   1. Afpipetteres 5 pi markør i alle 12 prøvebrønde og i stigen godt. Lad ikke nogen af ​​disse 13 brønde tomme.
6. Ilægning af Ladder og prøver.
   1. Pipette 1 pi DNA-stige til godt markeret med stigen tegn.
   2. Pipetter 1 pi prøve (anvendes brønde) eller 1 pi deioniseret vand (ubrugte brønde).
   3. Sætte chippen horisontalt i adapteren og vortex i 1 minut ved 2.400 rpm.
   4. Kør chip i Bioanalyzer inden for 5 min.
7. Kørsel af Analyse
   1. Start Bioanalyzer og den tilsluttede computer. Åbne softwaren.
   2. Åbn låget på Bioanalyzer og placere chippen i holderen chippen (chippen passer kun én måde). Luk låget forsigtigt.
   3. I instrumentet forbindelse med software du vælge "Elektroforese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Accepter den aktuelle fil Præfiks af softwaren eller ændre det.
   4. Klik på startknappen til stede i softwaren. Indtast prøvenavne i softwaren. Når chippen løb er færdig (efter ca. 30 min) End of Run vises i Bioanalyzer software.
   5. Fjern chippen og rengør elektroderne på Bioanalyzer henhold til anvisningerne fra fabrikanten.

5. udlede Genotype fra Elektroforese Profile

1. Indlæs Mahal software (software er frit tilgængelige fra forfatterne).
2. Import referencedata ind i Mahal software: "File"> "Importer reference data"
3. Åbn elektroforese kørt i Data forbindelse med Bioanalyzer software. Vælg en elektroforese profil af én prøve.
4. Tjek for de relevante toppe.
   1. Brug Mahal softwaren til at kontrollere for de relevante toppe: "Funktioner"> "Mean Fluorescens". Sæt ind i feltet "Fluorescence"fluorescens-værdier angivet som fluorescensenheder (FU), da de kan læses ud fra Bioanalyzer software. Indsæt de 4 (3) toppe med højeste fluorescens i stigende rækkefølge og adskilt af komma. Eksempel: 126.130.132.137.
      BEMÆRK: Hvis ikke alle disse toppe FU er angivet med Bioanalyzer software, de skal estimeres ved at læse dem ud fra plottet.
5. Tryk på knappen "Beregn". En top er relevant, hvis den observerede fluorescens overstiger værdien i boksen "Minimal peak højde".
6. Udlede genotypen.
   1. Sæt ind i Mahal tekstboks "Input Peaks (bp)" størrelserne i bp af alle relevante toppe i stigende rækkefølge og adskilt af komma. Eksempel: 440.462.519.579.637.
      BEMÆRK: Hvis ikke alle disse peak størrelser er angivet ved Bioanalyzer software, de skal estimeres ved at læse dem ud fra plottet.
7. Tryk på knappen "Beregn".
8. På listenkasse, kigge efter den minimale kvadreret Mahalanobis distance "D2M". Hvis den tilsvarende P-værdi ret til det ≥0.05 så er sandsynligheden er ≥5% at nulhypotesen H ₀ afvises (H _0: de observerede og referenceprofilen er identiske) betyder, at den observerede profil er accepteret at være identisk med reference profil af den angivne genotype.
9. Hvis D2M er minimale, men inden for den tilsvarende P-værdi er tom, afviser H ₀ med en sandsynlighed <5%.
   BEMÆRK: Dette betyder, at profilerne er ulige selvom D2M er minimal. Et sådant resultat kan skyldes ikke-gennemsnittet elektroforesebetingelser.
   1. For at korrigere for disse afvigelser, indsætte i tekstfeltet "Observeret Peak (bp)" værdien 395 og tryk på knappen "Beregn". Tjek igen for minimal D2M og en tilsvarende P-værdi ≥0.05. Hvis ikke det lykkes, så prøv værdierne 405, 415, og 425.
      BEMÆRK: Nogle gange mindre trin er endnuangivet. Hvis der stadig ikke lykkes, det observerede profil ikke er til stede i referencedataene, kan det være en ny genotype eller variant.
10. Forskellige profiler
    1. Gentag trin 5.6 til 5.9 for hvert elektroforese profil separat.

Representative Results

Definition af en genotype og dens varianter

En elektroforetiske profil afviger i mere end én band fra alle identificerede genotyper betragtes som en ny genotype. Nye genotyper er navngivet og forlænget efter Fournier et al. ^5, der fører til genotyperne GTA til GTZ, efterfulgt af genotyperne GTAA til GTAZ, og GTBA til GTBZ, og GTCA til GTCC på nuværende tidspunkt. Variation i bare én bånd betragtes som en genotypisk variant. Det er angivet med romertal superscript efter navnet på genotypen (f.eks GTRI, GTRII). I alt er der i øjeblikket 141 genotyper og varianter i referencedata basen.

Under de ovenfor skitserede, RS-PCR af Fournier et al. ^5, er meget reproducerbar at genotypebestemme stammer af S. aureus. Definitiv identifikation af enkendt genotype eller variant er altid muligt, hvis kan udelukkes tekniske problemer. Et typisk resultat er vist i figur 1 demonstrerer elektroforese af 12 RS-PCR-produkter og præsenteres i pseudo-gel-tilstand ved Bioanalyzer software. Hver bane er karakteriseret ved et mønster af to eller flere PCR-bånd og en markør band foran og en markør bånd i slutningen. Dobbelt klikke ind i en bane åbner den tilsvarende, faktisk målte elektroforetiske profil i et separat vindue. Den Bioanalyzer software giver, blandt andre muligheder, de observerede toppe læses som størrelse som fluorescerende enheder FU (figur 2), eller i bp (figur 3), hvorved en top svarer nøjagtigt til et bånd i pseudo-gel-tilstand. Peak læsning i FU er påkrævet for at vurdere de relevante toppe af en profil i Mahal software (figur 4), læsning i bp for udledning af genotype. Irrelevante toppe er defineret i Mahal software som lille ærtks hvis observerede fluorescens FU er under 40% af det geometriske gennemsnit af de 4 (3) toppe med højeste fluorescens. De er normalt observeret, når der er et overskud af DNA i RS-PCR (> 30 ng ren DNA / assay) ^2.

Som et eksempel er genotypen af prøven 211 til stede i figur 1 udledes. Visuel analyse af den elektroforetiske profil i figur 2 (Bioanalyzer software) og analyse med Mahal software ved hjælp af værktøjet til at teste for irrelevante toppe afslørede 6 relevante toppe med peak størrelser på 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, og 622 bp (figur 3). Disse værdier er udfyldt og adskilt af komma i tekstfeltet "Input Peaks (bp)" i Mahal software (figur 4). For at korrigere for run-specifikke afvigelser, blev værdien 415 indsat i tekstfeltet "Observeret Peak (bp)" (Figur 4). Efter at have trykket på "Calculate "knappen, er en liste præsenteres bestilt af genotype sammen med den kvadrerede Mahalanobis afstand D2M mellem forespørges og angivet genotypisk profil. Rul listen udkig efter minimal D2M. I den foreliggende sag, minimal D2M er lig med 4,499 (figur 4) med en værdi af P ≥0.05, hvilket betyder, at forespørges profil ikke signifikant forskellig fra den ene af GTB.

Varianter af genotyper er angivet som _I at _XV i Mahal-softwaren. I tilfælde af genotype B, er der de tre varianter GBT ^I, GBT ^II, og GBT ^III angivet som b_i, B_II, og B_III i softwaren (Figur 4).

En chip af MED kittet tillader analyse af produkter på 12 RS-PCR ad gangen. Hvis mindre produkter er tilgængelige, skal fyldes med deioniseret vand de resterende brønde. Resultaterne kan kun fortolkes, hvis kontrollerne jegncluded i RS-PCR er passende.

Figur 1. Pseudo-gel, der repræsenterer 12 RS-PCR-produkter og deres udledte genotyper. Tolv forskellige stammer af S. aureus blev analyseret ved RS-PCR under anvendelse af MED-kittet sammen med en Bioanalyzer og den medfølgende software. Banen på venstre side viser markøren eller "stige" til størrelse kalibrering af systemet i bp. På toppen af grafikken, prøven navne og de tilsvarende genotyper er tiltalt, der blev fremstillet ved Mahal softwaren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Elektroforetisk profil sample 161 til stede i figur 1. På toppen af toppene den målte fluorescens er indiceret i FU. Visuelt skelnes toppe, som ikke blev opdaget af Bioanalyzer software behov skal estimeres ved at læse dem ud fra plottet som udføres for toppen med en anslået fluorescens værdi på 113 FU (i blåt). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3. Elektroforetisk profil af prøve 211 til stede i figur 1. På toppen af toppene deres størrelse er angivet i bp. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Skærmbillede af Mahal softwaren. I tekstfeltet "Input Peaks (bp)" peak størrelser af prøven 211 fra figur 3 er udfyldt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Det mest kritiske trin af hele processen er, når der er et overskud af DNA i RS-PCR (> 30 ng ren DNA / assay) ^2. Generelt opløsning på en profil er optimal, hvis alle dens toppe starter og slutter ved baseline. Hvis to toppe er for tæt på hinanden, opløsning er ufuldstændig. Under disse betingelser kan Bioanalyzer software føre til uhensigtsmæssig peak identifikation, således at manuel identifikation er påkrævet.

Alle synligt adskilt og relevante toppe udtrykt som bp eller FU er inkluderet for yderligere analyser. For meget template DNA for RS-PCR resulterer i brede toppe, og derfor at toppe overlapning og nedsat opløsning af toppene. Desuden migration er langsommere førende peak størrelser, der er fejlagtigt øges, således at genotypen ikke længere kan udledes. Endelig er antallet af irrelevante toppe er større. For profiler med mere end 3 toppe, bør toppen med maksimal fluorescens normalt ikke overstige 150 FU.

Genotypebestemmelse af RS-PCR som beskrevet, er begrænset af det faktum, at investeringerne i maskiner er nødvendig, og den frie Mahal software er påkrævet. Faktisk er der behov for en standard-PCR-maskine og Bioanalyzer. Førstnævnte er temmelig billigt i dag mens sidstnævnte er dyrere. Opløsningen af ​​agarose-baseret elektroforese er ikke tilstrækkeligt, selv om høj opløsning agarose anvendes. Under disse betingelser er det bare muligt at skelne mellem GTB, GTC, og alle de andre genotyper. Omkostningerne til elektroforese under anvendelse af MED-kit eller agaroseelektroforese, dog ligner hinanden. MED-kit sammen med Bioanalyzer yderligere overgår standard agaroseelektroforese på en måde, at sidstnævnte metode er praktisk, ligetil, og opnåede data er til stede i elektronisk form, som forenkler opbevaring og yderligere analyse betydeligt. Principielt alle kommercielt tilgængelige bioanalyzers er egnet til denne type analyse, såfremt electrophoretic opløsning er tilstrækkelig og den opnåede størrelse af de bands er korrekte og saglig.

Opløsningen af RS-PCR for kvæg stammer af S. aureus er høj. Det er så godt som spa skrive, og bedre end MLST og PFGE ^4,14. I forhold til alle andre typningsmetoder almindeligvis anvendes til subtypning S. aureus (spa typebestemmelse, MLST, PFGE), dens prøvegennemløb er høj: DNA-ekstraktion er nem og hurtig, 96 prøver kan behandles på en RCR køre (normalt O / N) og elektroforese og genotype udlede er ligetil. Den fuldstændige analyse af 96 prøver kræver en nat til PCR og en dag til elektroforese og evaluering. Andre fordele ved RS-PCR efter Fournier et al. ² er de lave omkostninger, især sammenlignet med MLST der kræver syv gener, der skal sekventeret i begge retninger ^15. Endvidere RS-PCR er den eneste metode forudsige contagiosity og patogenicitet af stammer afS. aureus er involveret i bovin mastitis ^2,5, centrale prædiktorer i klinisk veterinærmedicin. Endelig RS-PCR alene er tilstrækkeligt at undersøge epidemiologi af kvæg S. aureus ^3,4,5,14. Fortolkning af data er ligetil selv i en international sammenhæng som kun nogle få store genotyper overholdes ^2,3. For epidemiologiske sammenligninger mellem kvæg og menneskelige stammer, RS-PCR og spa skrive sammen er at foretrække, da den sidstnævnte metode er meget brugt til subtypning menneskelige stammer, så en masse data er tilgængelige. MLST, er imidlertid egnet til vurdering klonaliteten af stammerne ¹⁵ og til fylogenetiske analyser ^4.

For fejlfinding vedrørende PCR cycler, MED kit, og Bioanalyzer de tilsvarende vejledninger skal høres. I tilfælde af RS-PCR-fremgangsmåden, er fejlfinding massivt forenkles, hvis relevante positive og negative PCR-kontroller er included i hver kørsel. Hvis den positive kontrol er negativ, blev PCR-blandingen ikke tilstrækkeligt sammensat og / eller kontrol-DNA'et var nedbrudt. Hvis den negative kontrol _(H2O) genereres en eller flere bånd, PCR-blandingen blev kontamineret med noget DNA. I begge tilfælde skal profilerne ikke fortolkes og RS-PCR skal gentages. Hvis fortolkning er umulig på grund af et elektroforetisk problem, skal gentages under anvendelse af en ny chip elektroforese. Elektroforetiske problemer kendetegnes normalt ved utilstrækkelig migration og tilpasning af den ene eller begge markør bands som følge af uhensigtsmæssig belastning og manipulere af chippen. Hvis den opnåede elektroforese profilen ikke kan fortolkes af Mahal software, er profilen fil genereret af Bioanalyzer software sendt til forfatteren til yderligere vurdering. Normalt for meget skabelon-DNA blev anvendt til RS-PCR eller profilen repræsenterer en ny genotype eller genotypisk variant.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'