genotyping של Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

סטפילוקוקוס (S. aureus) ידוע בתור הפתוגן החשוב ביותר בעולם האחראי לזיהום intramammary (תעש) בבקר ^1. מחקרם של פורנייה et al. ² הפגינו פרות השוויצרי לבין מחקרים על ידי Cosandey et al. ³ ו בוס et al. ⁴ בפרות של 12 מדינות אירופה כי ס aureus מבודד שור תעש היא קבוצה הטרוגנית גנטית. על ידי PCR הגברה של אזור spacer 16S-23S rRNA גניים (RS-PCR), סך של 17 גנוטיפים בתחילה התגלו 101 אפידמיולוגיה עצמאית מבודדים ^2. גנוטיפ B ו- C גנוטיפ (GTC) היו הנפוצים ביותר (80%), לעומת 15 גנוטיפים אחרים (GTS) התרחשו לעתים רחוקות, כל מה שהופך 1 עד 4% מכלל הבידודים. ברמה ³ האירופי, GTB, GTC, GTF, GTI, ו GTR היו גנוטיפים החשובים ביותר המהווים 76% מכלל זני ניתח (n = 456). GTB היה ממוקם במרכז אירופה whereas גנוטיפים אחרים הופצו באופן נרחב. 24% הנותרים של הזנים כללו 41 גנוטיפים, רבים מהם, עם זאת, נצפו רק פעם אחת.

המחקרים ידי פורנייה et al. ^2, Cosandey et al. ^3, ו גרבר et al. ⁵ הפגינו עוד כי גנוטיפים היו קשורים מאוד עם דפוס הגנים הארסיים שלהם, כמו גם על שוויצרי ברמה האירופית. המחקרים נוספים חשף הבדלים מסיביים בשכיחות תעש בין ס aureus GTB, GTC ואת גנוטיפים אחרים ^2,5: בהתחשב GTB, עד 87% של פרות בעדר נדבקו גנוטיפ זה. במקרה של GTC ושל גנוטיפים אחרים, לעומת זאת, תעש נמצא רק 1 עד 2 פרות של עדר.

תעש הנגרם על ידי S. aureus, בדרך כלל תוצאות דלקת של בלוטות החלב המקבילות וגידול של תאים דלקתיים בחלב. כתוצאה מכך, שיתוף תא סומטיunts בחלב (SCC), מחוון המפתח של איכות חלב ברוב מדינות העולם, הוא גדל מוביל מחיר חלב ירד או להפסיק בלידה אפילו.

מלבד RS-PCR של פורנייה et al. ^2, שיטות הקלדה אחרות תוארו עבור תת-סוגי זני שור של ס aureus ^8-11. שני נפוצים כוללים הקלדת ספא ¹² ו Multi לוקוס רצף הקלדה (MLST) ^13. האחד לשעבר מבוסס על DNA רצף באזור spacer משתנה של הגן המקודד ספא staphylococcal לחלבון A, ואילו אחד הדרישות המאוחרות רצף של 7 גנים משק. משמעות הדבר היא כי אחד ¹² ושבעה PCRs ^13, בהתאמה, צריכה להתבצע, ואחריו טיהור amplicon, תגובת סידור וניתוח באמצעות ציוד ספציפי. לעומת RS-PCR, השיטות האלה דורשות מאמץ נוסף ניכר במעבדה וכתוצאה מכך תפוקת מדגם נמוכה ומחירים גבוהים. ההתפוקה נמוכה במיוחד עבור PFGE. בהתחשב ברזולוציה של שיטות אלה זני שור של ס aureus, RS-PCR הוא טוב לפחות כמו ספא הקלדת ⁴ וטוב יותר מאשר MLST ⁴ או PFGE ^15.

כל השיטות הללו כוללים הקלדה בינארי ¹³ הפגינו יעילותם בהשגת תובנה נוספת לתוך בפתוגנזה של שור תעש הנגרמת על ידי S. aureus, אבל בגלל המגבלות שהוזכרו הם פחות מתאימים חקירות קליניות גדולות. בנוסף, גנוטיפ ידי RS-PCR כפי שתואר על ידי פורנייה et al. ² מאפשר חיזוי אמין של אפידמיולוגיים והפוטנציאל פתוגניים של ס aureus מעורב שור תעש, שני ערכים מרכזיים ברפואת וטרינרית קלינית.

Protocol

1. Staphylococcus aureus מבודד

1. מורחים 10 μl של ס תרבות מניות aureus או מושבה אחד גדלה על מצע סלקטיבי על צלחות אגרו קולומביה המכילות דם כבשים 5% (BA).
2. דגירה אירובית על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות עד 24 שעות.

2. DNA הפקה

1. הכן חיץ טל המכיל 10 mM Tris-HCl ו -10 מ"מ Na ₂ EDTA, pH 8.5. כן aliquots חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
2. אסוף 1 מושבת מבני עקיבא באמצעות לולאת פלסטיק סטרילית או מכוש שן עץ סטרילית גלולה ב 100 TEL μl. השתמש 1.5 מ"ל צינורות עם פקקי הברגה.
3. לדגור על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, מניח את הדגימות מייד על קרח רטוב.
4. לדלל את דגימות 1: 100 ב H ₂ O מתאים PCR (= DNA תבנית עבור ה- PCR). הדגימות הלא מדולל למניה והרווח המדולל נשמרות ב -20 ° C עבור 1 חודש.

3. RS-PCR

2 O, 12.5 μl תקי מיקס מאסטר, 2 μl פריימר G1 10 מיקרומטר, 2 μl פריימר L1 10 מיקרומטר, ו -7 μl של תבנית ה- DNA המתאים לכ -30 ננוגרם של טהור DNA ^2.
1. הפעל את תכנית האופניים הבא בתוך Cycler PCR תקן: 15 דקות 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 27 מחזורים המהווים 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ואחריו רמפת חישול 2 דקות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר רמפה 2 דקות נוספות, ישתרע על 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לסיים PCR על ידי רחבה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו הרגעות עד 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: מוצרי PCR יכולים להיות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
2. עבור כל מחזור של RS-PCR לכלול שליטה חיובית, כלומר, מדגם עם גנוטיפ ידוע (בדרך כלל GTB), וכן שליטה שלילית (H ₂ O).

אלקטרופורזה 4.

1. השתמש ערכת אלקטרופורזה מסחרי מיניאטורי עבור DNA (ערכת MED) יחדעם bioanalyzer מחובר למחשב ואת התוכנות המותקנות. ללמוד את החוברות המקבילות של היצרן בקפידה.
2. הגדר את התחנה יחול שבב ולהתאים את קליפ המזרק פי הוראות היצרן.
3. מכינים את תערובת ג'ל צבע בהתאם למדריך של היצרן.
4. טעינת תערובת ג'ל צבע (על פי הוראות היצרן).
   1. לאזן את תמהיל ג'ל לצבוע RT למשך 30 דקות לפני השימוש.
   2. שים שבב דנ"א חדש בתחנת השבב יחול. פיפטה 9 μl של צבעי ג'ל ג מסומן היטב
   3. ודא כי הבוכנה ממוקמת 1 מ"ל ולאחר מכן לסגור את תחנת השבב יחול. בוכנה לחץ על עד הוא מוחזק על ידי קליפ המזרק. חכה בדיוק למשך 30 שניות ולאחר מכן שחררו את הקליפ המזרק.
   4. מתן 5 שניות. לאט לאט למשוך בחזרה הבוכנה 1 מ"ל עמדה.
   5. תחנה יחולו שבב פתח פיפטה 9 μl של ג'ל צבע בשתי הבארות מסומנות "G".
5. טעינת Marker
   1. פיפטה 5 μl של הסמן בכל 12 בארות מדגם ב הסולם היטב. אין להשאיר לכל אחת מ -13 אלה בארות ריקות.
6. טעינת הסולם ואת הדוגמות.
   1. פיפטה 1 μl של סולם ה- DNA אל מסומן היטב עם סימן הסולם.
   2. μl של מדגם 1 פיפטה (בארות בשימוש) או 1 μl של מים ללא יונים (בארות ללא שימוש).
   3. שים את השבב אופקי מתאם מערבולת דקות 1 ב -2,400 סל"ד.
   4. הפעל שבב bioanalyzer תוך 5 דקות.
7. הרצת ניתוח
   1. הפעל את bioanalyzer והמחשב מחובר. פתח את התוכנה.
   2. פתח את המכסה של bioanalyzer ומניח השבב לתוך החזיק השבב (השבב מתאים רק כיוון אחד). סגור את המכסה בזהירות.
   3. בהקשר Instrument של התוכנה לבחור "אלקטרופורזה"> "dsDNA"> "DNA 7500". קבל את קידומת הקובץ הנוכחית של התוכנה או לשנות אותה.
   4. לחץ על כפתור התחל הנוכחי בתוכנה. הזן את שמות מדגם בתוכנה. כאשר לרוץ השבב הוא סיים (לאחר כ -30 דקות) בסוף הודעת ההפעלה מופיע תוכנת bioanalyzer.
   5. הסר את השבב ולנקות את האלקטרודות של bioanalyzer בהתאם להוראות היצרן.

5. הסקת גנוטיפ מן בפרופיל אלקטרופורזה

1. טען את תוכנת המאהל (תוכנה זמינה באופן חופשי מן המחברים).
2. נתוני התייחסות יבוא לתוך התוכנה מהאל: "קובץ"> "נתוני הפנית יבוא"
3. פתח את אלקטרופורזה לפעול בהקשר הנתונים של תוכנת bioanalyzer. בחר פרופיל אלקטרופורזה של דגימה אחת.
4. בדקו הפסגות הרלוונטיות.
   1. השתמש בתוכנת המאהל לבדוק פסגות הרלוונטיות: "כלים"> "Mean קרינה". הכנס לתוך תיבת "הקרינה"ערכי הקרינה הצביעו כיחידות קרינה (FU) כפי שהם יכולים להיות הקריא מתוך תוכנת bioanalyzer. הכנס את 4 (3) פסגות עם הקרינה הגבוהה ביותר בסדר עולה המופרדים בפסיק. דוגמה: 126,130,132,137.
      הערה: אם לא כל FU הפסגות האלה מסומנים על ידי תוכנת bioanalyzer, הם צריכים להיות מוערכים על ידי קריאה אותם החוצה מן העלילה.
5. לחץ על כפתור "חשב". פסגה רלוונטית אם הקרינה נצפתה עולה על הערך הנתון בתיבה "גובה שיא מינימאלי".
6. להסיק הגנוטיפ.
   1. הכנס לתיבת טקסט מאהל "פיקס הקלט (נ"ב)" שהגדלים נ"ב של כל הפסגה הרלוונטית בסדר עולה המופרדים בפסיק. דוגמה: 440.462.519.579.637.
      הערה: אם לא כל בגדלי שיא אלה מסומנים על ידי תוכנת bioanalyzer, הם צריכים להיות מוערכים על ידי קריאה אותם החוצה מן העלילה.
7. לחץ על כפתור "חשב".
8. ברשימהתיבה, לחפש את המרחק המינימאלי בריבוע Mahalanobis "d2m". אם ערך P המקביל זכות הוא ≥0.05 אז ההסתברות היא ≥5% שההשערה H ₀ null נדחה (H _0: והנצפה והפרופיל למספרים זהים) כלומר הפרופיל ציין מקובל להיות זהה פרופיל הפניה של גנוטיפ המצוין.
9. אם d2m הוא מינימלי אבל בתחום הערך P המקביל ריק, לדחות H ₀ בהסתברות <5%.
   הערה: משמעות הדבר היא כי פרופילים הם לא שווים אף d2m היא מינימלית. תוצאה כזו עשויה לנבוע תנאי אלקטרופורזה הלא ממוצע.
   1. כדי לתקן את חריגות אלו, הכנס לתוך תיבת הטקסט "ציין שיא (נ"ב)" הערך 395 ולחץ על כפתור "חשב". בדוק שוב עבור d2m מינימאלית וכן ≥0.05 ערך P מקביל. אם לא מצליח, נסה את הערכים 405, 415, ו -425.
      הערה: לפעמים צעדים קטנים הם אפילוהצביע. אם עדיין לא מוצלח, הפרופיל שנצפה הוא לא נוכח נתוני ההפניה, זה יכול להיות הגנוטיפ או גרסה חדשים.
10. פרופילים שונים
    1. חזור על שלבים 5.6 כדי 5.9 עבור כל פרופיל אלקטרופורזה בנפרד.

Representative Results

הגדרה של גנוטיפ גירסאותיה

פרופיל electrophoretic הנבדלים יותר להקה אחת מכל גנוטיפים המזוהה נחשב גנוטיפ חדש. גנוטיפים חדשים בשם והאריך פי פורנייה et al. ⁵ המוביל גנוטיפים GTA כדי GTZ, ואחריו גנוטיפים GTAA כדי GTAZ, ו GTBA כדי GTBZ, ו GTCA כדי GTCC כיום. וריאציה רק ​​להקה אחת נחשבת כווריאציה גנוטיפ. יצוין עם ספרות רומית העילית אחרי השם של הגנוטיפ (למשל, GTRI, GTRII). בסך הכל, ישנם כיום 141 גנוטיפים וגירסאות בבסיס הנתונים התייחסות.

בתנאים שתוארו לעיל, RS-PCR ידי פורנייה et al. ⁵ הוא מאוד לשחזור כדי גנוטיפ זנים של S. aureus. זיהוי סופי שלגנוטיפ או גרסה ידוע הוא תמיד אפשרי אם ניתן לשלול בעיות טכניות. אחת תוצאות טיפוסיות מוצגות באיור 1 הוכחת אלקטרופורזה של 12 RS-PCR מוצרים המוצגות במצב ג'ל פסאודו ידי תוכנת bioanalyzer. שביל כל מאופיין דפוס של שתיים או יותר להקות PCR ולהקה סמן מלפנים להקה סמן בסוף. לחיצה כפולה לתוך סמטה פותחת את פרופיל electrophoretic המקביל, הנמדד בפועל בחלון נפרד. Bioanalyzer התוכנה מאפשרת, בין אפשרויות אחרות, הפסגות הנצפות להיות לקרוא כמו גודל כמו FU יחידות ניאון (איור 2) או ב BP (איור 3) לפיה שיא אחד מתאים בדיוק להקה אחת במצב פסאודו-ג'ל. קריאת שיא FU נדרשה להערכת הפסגות הרלוונטיות של פרופיל בתוכנת המאהל (איור 4), קריאה נ"ב כדי להסיק מסקנה הגנוטיפ. פסגות לא רלוונטיות מוגדרות בתוכנת המאהל כמו אפונה קטנהks שאת FU קרינה נצפית הוא מתחת ל -40% של הממוצע הגיאומטרי של 4 (3) פסגות עם הקרינה הגבוהה ביותר. הם הם נצפו בדרך כלל כאשר יש עודף של דנ"א RS-PCR (> 30 ng DNA / assay טהור) ^2.

כדוגמה, הגנוטיפ של ההווה מדגם 211 באיור 1 הוא להסיק. ניתוח חזותי של הפרופיל electrophoretic ב 2 איור (תוכנת bioanalyzer) וניתוח עם תוכנת מאהל שימוש באפשרות לבדוק פסגות רלוונטיות חשף 6 פסגות רלוונטיות בגדלי שיא של 395 נ"ב, 432 נ"ב, 453 נ"ב, 505 נ"ב, 567 נ"ב, ו 622 נ"ב (איור 3). ערכים אלה מולאו והופרדו פסיק "פיקס הקלט (נ"ב)" הטקסט של תוכנת המאהל (איור 4). כדי לתקן את החריגות ספציפיות לרוץ, הערך 415 הוכנס לתוך תיבת הטקסט "ציינה שיא (נ"ב)" (איור 4). לאחר הלחיצה "Calculate "כפתור, רשימה מוצגת מסודרת על פי גנוטיפ יחד עם d2m מרחק Mahalanobis בריבוע בין השאילתה והצביע פרופיל גנוטיפ. גלול ברשימה מחפשת d2m המינימאלי. במקרה הנוכחי, d2m המינימאלי שווה 4.499 (איור 4) עם ערך של P ≥0.05, כלומר פרופיל השאילתה אינו שונה באופן משמעותי מזו של GTB.

נוסחים שונים של גנוטיפים מסומנים ככאלה _I כדי _XV בתוכנת המאהל. במקרה של גנוטיפ B, יש שלוש גרסאות GBT ^לי, GBT ^II ו- ^III GBT הצביעו כפי B_I, B_II, ו B_III בתוכנה (איור 4).

שבב של ערכת MED מאפשר מוצרי ניתוח של 12 RS-PCR בכל פעם. אם מוצרים פחות זמינים, הבארות הנותרות צריכות להיות טעונות עם מים ללא יונים. התוצאות עשויות להתפרש רק אם בקרות included ב RS-PCR מתאים.

באיור 1. ג'ל פסאודו מייצגים 12 RS-PCR מוצרים גנוטיפים המשוערת שלהם. שנתי עשרה זנים שונים של ס aureus נותח על ידי RS-PCR באמצעות ערכת MED יחד עם bioanalyzer ואת התוכנה הכלולה. השביל בצד שמאל ניתן לראות את הסמן או "סולם" לכיול גודל של המערכת נ"ב. בחלק העליון של הגרפיקה, שמות המדגם ואת גנוטיפים המקבילים הם לדין כי התקבלו על ידי תוכנת המאהל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. פרופיל Electrophoretic של sample 161 נוכחי באיור 1. על גבי פסגות הקרינה הנמדדת מצוינת FU. ראיית פסגות להבחין כי לא אותרו על ידי צורך תוכנת bioanalyzer כדי להיות מוערכות על ידי קריאה אותם מן העלילה כפי שבוצע על השיא עם ערך קרינה משוערת של 113 FU (בכחול). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 3. Electrophoretic פרופיל של מדגם 211 נוכחי באיור 1. על גבי פסגות גודלם מצוינים נ"ב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. צילום מסך של תוכנת המאהל. בתיבת הטקסט "פיקס קלט (נ"ב)" בגדלי השיא של מדגם 211 מהתרשים 3 מולאו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השלב הקריטי ביותר של ההליך כולו הוא כאשר יש עודף של דנ"א RS-PCR (> 30 ng DNA / assay טהור) ^2. באופן כללי, ברזולוציה של פרופיל היא אופטימלית אם כל הפסגות שלה התחלה וסיום על קו הבסיס. אם שתי פסגות הם קרובים מדי זה לזה, ברזולוציה אינה שלמה. בתנאים אלה, תוכנת bioanalyzer עלולה להוביל לזיהוי שיא הולם כך זיהוי ידני נדרש.

כל הפסגות המופרדות בעליל ורלוונטיות המבוטאות נ"ב או FU כלולים עבור ניתוחים נוספים. תבנית ה- DNA יותר מדי עבור RS-PCR תוצאות פסגות רחבות ולכן לשיא ברזולוציה חופפת ולקויה של הפסגות. בנוסף, גירה היא מובילה איטית לשיא גדל כי הם הגדילו באופן כוזב כך גנוטיפ כבר לא יכול להיות מוסק. לבסוף, מספר פסגה הרלוונטית הוא גדול. עבור פרופילים עם יותר מ -3 פסגות, הפסגה עם קרינה מרבית צריכה בדרך כלל לא תעלה על 150 FU.

Genotyping ידי RS-PCR כמתואר מוגבל על ידי העובדה כי ההשקעה במכונות הכרח תוכנת המאהל פנויה. למעשה, מכונת PCR תקנה ואת bioanalyzer נדרשים. הראשון הוא די זול בימים ואילו האחרון הוא יקר יותר. הרזולוציה של אלקטרופורזה מבוסס agarose אינה מספיק אפילו אם agarose ברזולוציה גבוהה משמש. בתנאים אלה זה רק ניתן להבחין בין GTB, GTC, וכל גנוטיפים אחרים. העלויות אלקטרופורזה באמצעות ערכת MED או אלקטרופורזה agarose, לעומת זאת, הם דומים. הערכת MED יחד עם bioanalyzer נוספת בביצועיו אלקטרופורזה agarose הסטנדרטי בצורה כי השיטה השנייה היא בהישג יד, ישר קדימה, ועל נתונים מתקבלים נוכחים בצורה אלקטרונית המפשטת אחסון וניתוח נוסף משמעותית. בעיקר כל bioanalyzers הזמין מסחרי מתאים לסוג זה של ניתוח ובלבד electrophoretic הרזולוציה היא נאותה ואת הגודל מתקבל הלהקות מדויק ובלתי משוחד.

הרזולוציה של RS-PCR עבור זני שור של ס aureus הוא גבוה. זה טוב כמו הקלדת ספא, וטוב יותר מאשר MLST ו PFGE ^4,14. בנוסף, בהשוואה לכל שיטות ההקלדה האחרות נפוצה עבור ס תת-סוגים (הקלדת ספא, MLST, PFGE) aureus, התפוקה המדגמת שלה היא גבוהה: מיצוי DNA הוא קל ומהיר, 96 דגימות ניתן לעבד בטווח אחד RCR (בדרך כלל O / N) ו אלקטרופורזה ו הסקת מסקנות העובדתית גנוטיפ היא ישר קדימה. הניתוח המלא של 96 דגימות דורש לילה אחד עבור PCR ויום אחד אלקטרופורזה והערכה. יתרונות נוספים של RS-PCR ידי פורנייה et al. ² הם העלויות הנמוכות, במיוחד כשמשווים MLST הדורש שבעה גנים להיות רצף בשני הכיוונים ^15. יתר על כן, RS-PCR הוא contagiosity ו פתוגניות לניבוי השיטה היחידה של זניAureus S. מעורב שור דלקת בשד ^2,5, מנבאים מפתח ברפואה וטרינרית קלינית. לבסוף, RS-PCR בלבד מספיק כדי לחקור את האפידמיולוגיה של שור ס aureus ^3,4,5,14. פרשנות של הנתונים היא ישר קדימה אפילו בהקשר בינלאומי כמו שרק כמה גנוטיפים עיקריים הם נצפו ^2,3. להשוואות אפידמיולוגיים בין שור זני אדם, RS-PCR והקלדת ספא יחד עדיפים כשיטה האחרונה נעשתה שימוש נרחב לתת-סוגים של זני אדם כך הרבה נתונים נגישים. MLST, לעומת זאת, היא מתאימה להערכת clonality של זנים ¹⁵ ו עבור פילוגנטי מנתח ^4.

עבור פתרון בעיות בנוגע Cycler PCR, ערכת MED, ואת bioanalyzer, הספרים המקבילים יש להתייעץ. במקרה של שיטת RS-PCR, תקלות הן פשוטות מסיבית אם שולט PCR חיובית ושלילי מתאימים הם included בכל ריצה. במידה והשלט החיובי הוא שלילי, תמהיל PCR לא הורכב כראוי ו / או ה- DNA השליטה הייתה מושפלת. אם השליטה השלילית (H ₂ O) שנוצר אחד או יותר להקות, תמהיל PCR היה מזוהם עם כמה DNA. בשני המקרים, את הפרופילים אין לפרש ו- RS-PCR יש צורך לחזור. אם פרשנות בלתי אפשרית בגלל בעית electrophoretic, אלקטרופורזה צריך להיות חוזר ונשנה באמצעות שבב חדש. בעיות Electrophoretic מאופיינות בדרך כלל על ידי הגירה לקוית ויישור של אחד או שני להקות הסמן הנובע טעינה הולם מניפולציה של השבב. אם פרופיל אלקטרופורזה שהושג לא יכול להתפרש על ידי תוכנת המאהל, קובץ הפרופיל שנוצר על ידי תוכנת bioanalyzer נשלח המחבר לצורך הערכה נוספת. בדרך כלל, יותר מדי DNA תבנית נעשה שימוש עבור RS-PCR או פרופיל מייצג גנוטיפ חדש או גרסה גנוטיפ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'