Introduction
Staphylococcus (S. aureus) è noto come il patogeno più importante a livello mondiale responsabile dell'infezione intramammaria (IMI) nei bovini 1. Lo studio di Fournier et al. 2 dimostrato in Mucche svizzere e gli studi da Cosandey et al. 3 e Boss et al. 4 in vacche di 12 paesi europei che S. aureus isolato da bovini IMI è un gruppo geneticamente eterogeneo. Con PCR amplificazione della regione intergenico distanziale 16S-23S rRNA (RS-PCR), per un totale di 17 genotipi sono stati inizialmente rilevati in 101 isolati epidemiologico indipendenti 2. Il genotipo B e C genotipo (CG) sono stati più comune (80%), mentre gli altri 15 genotipi (GTS) si sono verificati raramente, ogni rendendo 1-4% di tutti gli isolati. A livello europeo 3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR sono stati i genotipi più importanti che compongono il 76% di tutti i ceppi analizzati (n = 456). GTB era situato nell'Europa centrale wconsiderando che gli altri genotipi sono stati ampiamente diffusi. Il restante 24% dei ceppi inclusi 41 genotipi, molti dei quali, tuttavia, sono stati osservati solo una volta.
Gli studi di Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3, e Graber et al. 5 inoltre dimostrato che i genotipi erano altamente associati con il loro modello gene di virulenza, come pure alla Svizzera come a livello europeo. Gli studi hanno rivelato ulteriori enormi differenze nella prevalenza tra IMI S. aureus GTB, GTC e gli altri genotipi 2,5: considerando GTB, fino al 87% di mucche di un allevamento sono stati infettati da questo genotipo. Nel caso di GTC e degli altri genotipi, tuttavia, IMI è stato trovato solo in 1 a 2 mucche di una mandria.
IMI causata da S. aureus, normalmente si traduce in infiammazione dei corrispondenti ghiandole mammarie e un aumento di cellule infiammatorie nel latte. Di conseguenza, il somatico co celluleUNTS nel latte (SCC), l'indicatore chiave della qualità del latte nella maggior parte dei paesi, è aumentato portando ad un prezzo del latte è diminuito o addirittura fermare la consegna.
Oltre alla RS-PCR di Fournier et al. 2, altri metodi di tipizzazione sono stati descritti per sottotipizzazione ceppi bovini di S. aureus 8-11. Due più comuni includono spa digitazione 12 e Multi Locus Sequence Typing (MLST) 13. Il primo è basato sul DNA sequenziamento della regione distanziale variabile del gene che codifica per la proteina spa stafilococco A, mentre il secondo si richiede il sequenziamento dei geni housekeeping 7. Ciò significa che uno 12 e sette PCR 13, rispettivamente, devono essere eseguite, seguita da purificazione amplicone, reazione di sequenziamento e l'analisi utilizzando apparecchiature specifiche. Rispetto a RS-PCR, questi metodi richiedono un notevole sforzo supplementare in laboratorio con un conseguente rendimento partire campione e costi elevati. Ilil throughput è particolarmente basso per PFGE. Considerando la risoluzione di questi metodi per i ceppi bovini di S. aureus, RS-PCR è almeno altrettanto buono come spa digitando 4 e meglio di MLST 4 o PFGE 15.
Tutti questi metodi, tra cui la tipizzazione binario 13 hanno dimostrato la loro efficacia per ottenere una visione più completa della patogenesi di bovini IMI causata da S. aureus, ma a causa delle restrizioni di cui essi sono meno adatti per le grandi indagini cliniche. Inoltre, la genotipizzazione da RS-PCR come descritto da Fournier et al. 2 permette la previsione affidabile del epidemiologica e il potenziale patogeno di S. aureus coinvolto in IMI bovina, due valori fondamentali in medicina veterinaria clinica.
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Protocol
1. Staphylococcus aureus isolati
- Distribuire 10 ml di S. aureus magazzino cultura o di una colonia coltivate su un terreno selettivo su piastre di agar Columbia contenenti il 5% di sangue di pecora (BA).
- Incubare in aerobiosi a 37 ° C per 18 ore a 24 ore.
2. DNA Extraction
- Preparare tampone TEL contenente 10 mM Tris-HCl e 10 mm Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparare aliquote e autoclave a 121 ° C per 15 min.
- Raccogliere 1 colonia da BA utilizzando un'ansa sterile di plastica o una sterile stuzzicadenti in legno e risospendere in 100 microlitri TEL. Utilizzare provette da 1,5 ml con tappo a vite.
- Incubare a 95 ° C per 10 min. Successivamente, posizionare i campioni immediatamente in ghiaccio.
- Diluire i campioni 1: 100 in H 2 O adatto per PCR (= DNA stampo per PCR). I campioni non diluiti e diluiti possono essere conservati a -20 ° C per 1 mese.
3. RS-PCR
- Eseguire il programma di ciclo in un cycler PCR standard: 15 min 95 ° C, seguita da 27 cicli comprendenti 94 ° C per 1 min, seguiti da 2 min rampa e ricottura a 55 ° C per 7 minuti. Dopo ulteriori 2 min rampa, estendersi a 72 ° C per 2 min. Terminare PCR da una estensione finale a 72 ° C per 10 minuti seguito da raffreddamento a 4 ° C.
NOTA: I prodotti di PCR possono essere conservati a -20 ° C per 5 giorni. - Per ciascuna serie di RS-PCR include un controllo positivo, cioè, un campione con un genotipo noto (normalmente GTB), e un controllo negativo (H 2 O).
4. elettroforesi
- Utilizzare un kit commerciale elettroforesi miniaturizzato per il DNA (corredo MED) insiemecon un Bioanalyzer collegato ad un PC e il software installato. Studiare i corrispondenti manuali del costruttore con attenzione.
- Impostare la stazione di adescamento di chip e regolare la clip della siringa secondo il manuale del costruttore.
- Preparare la miscela gel-colorante secondo il manuale del costruttore.
- Caricamento il mix di gel-dye (secondo il manuale del costruttore).
- Equilibrare la miscela gel-colorante per RT per 30 minuti prima dell'uso.
- Mettere nuovo chip di DNA sulla stazione di chip di adescamento. Pipettare 9 ml di gel-colorante nel ben segnalata G.
- Assicurarsi che il pistone è posizionato a 1 ml e quindi chiudere la stazione di chip di adescamento. Premere il pistone fino a quando non è detenuto dal clip di siringa. Attendere esattamente per 30 secondi, quindi rilasciare la clip siringa.
- Attendere 5 sec. Lentamente tirare indietro lo stantuffo per 1 ml di posizione.
- Aperto chip di stazione di adescamento e pipetta 9 ml di gel-dye in entrambi i pozzetti contrassegnati 'G'.
- Caricamento del MArker
- Pipetta da 5 ml di marcatore in tutti i 12 pozzetti dei campioni e nella scala bene. Non lasciare nessuno di questi 13 pozzi vuoti.
- Caricamento della Scala ei campioni.
- Pipettare 1 ml di scala del DNA per il ben marcata con il segno scala.
- Pipettare 1 ml di campione (pozzi utilizzati) o 1 ml di acqua deionizzata (pozzetti non utilizzati).
- Mettere il chip orizzontalmente nel adattatore e vortex per 1 min a 2400 rpm.
- Eseguire il chip nel bioanalizzatore entro 5 minuti.
- Esecuzione dell'analisi
- Avviare il Bioanalyzer e il computer collegato. Aprire il software.
- Aprire il coperchio del bioanalizzatore e posizionare il chip nel supporto del circuito integrato (chip adatta solo modo). Chiudere con cura il coperchio.
- Nel contesto Instrument del software selezionare "Elettroforesi"> "dsDNA"> "DNA 7500". Accetta l'attuale prefisso file del software o modificarlo.
- Fare clic sul pulsante di avvio presente nel software. Immettere i nomi dei campioni nel software. Quando la corsa di chip è terminato (dopo circa 30 min) alla fine del messaggio Run appare nel software bioanalizzatore.
- Rimuovere il chip e pulire gli elettrodi del bioanalizzatore secondo le istruzioni del produttore.
5. Inferenza il genotipo dal profilo elettroforesi
- Caricare il software Mahal (il software è liberamente disponibile presso gli autori).
- i dati di riferimento delle importazioni nel software Mahal: "File"> "Importa dati di riferimento"
- Aprire il elettroforesi eseguito nel contesto dei dati del software bioanalizzatore. Selezionare un profilo elettroforesi di un campione.
- Controllare i picchi rilevanti.
- Utilizzare il software Mahal per controllare i picchi rilevanti: "Strumenti"> "Media di Fluorescenza". Inserire nella casella "fluorescenza"i valori di fluorescenza indicati come unità di fluorescenza (FU) in quanto possono essere letti dal software bioanalizzatore. Inserire i 4 (3) picchi con la massima fluorescenza in ordine crescente e separati da virgole. Esempio: 126.130.132.137.
Nota: se non tutti questi picchi FU sono indicati dal software Bioanalyzer, hanno bisogno di essere stimato da loro lettura dalla trama.
- Utilizzare il software Mahal per controllare i picchi rilevanti: "Strumenti"> "Media di Fluorescenza". Inserire nella casella "fluorescenza"i valori di fluorescenza indicati come unità di fluorescenza (FU) in quanto possono essere letti dal software bioanalizzatore. Inserire i 4 (3) picchi con la massima fluorescenza in ordine crescente e separati da virgole. Esempio: 126.130.132.137.
- Premere il pulsante "Calcola". Un picco è rilevante se la fluorescenza osservato supera il valore indicato nella casella "picco altezza minima".
- Dedurre il genotipo.
- Inserire nella casella di testo Mahal "picchi di ingresso (bp)" le dimensioni in bp di tutti i picchi rilevanti in ordine crescente e separati da virgole. Esempio: 440.462.519.579.637.
Nota: se non tutti questi formati di punta sono indicati dal software Bioanalyzer, hanno bisogno di essere stimato da loro lettura dalla trama.
- Inserire nella casella di testo Mahal "picchi di ingresso (bp)" le dimensioni in bp di tutti i picchi rilevanti in ordine crescente e separati da virgole. Esempio: 440.462.519.579.637.
- Premere il pulsante "Calcola".
- Nell'elencobox, cercare il minimo quadrato di Mahalanobis distanza "D2M". Se il corrispondente valore P destra esso è ≥0.05 allora la probabilità è ≥5% che l'ipotesi nulla H 0 è rifiutata (H 0: l'osservato e il profilo di riferimento sono identici) significa che il profilo osservato è accettato di essere identico al il profilo di riferimento del genotipo indicato.
- Se D2M è minimo ma il campo del valore P corrispondente è vuota, rifiutare H 0 con probabilità <5%.
NOTA: Ciò significa che i profili sono disuguali sebbene D2M è minima. Tale risultato può derivare da condizioni non medie elettroforesi.- Per correggere queste deviazioni, inserire nella casella di testo "Osservato Peak (bp)" il valore 395 e premere il pulsante "Calcola". Controllare nuovamente per D2M minimo e un corrispondente valore di P ≥0.05. Se non con successo, provare i valori 405, 415, e 425.
Nota: A volte piccoli passi sono ancoraindicato. Se ancora non riesce, il profilo osservato non è presente nei dati di riferimento, può essere un nuovo genotipo o variante.
- Per correggere queste deviazioni, inserire nella casella di testo "Osservato Peak (bp)" il valore 395 e premere il pulsante "Calcola". Controllare nuovamente per D2M minimo e un corrispondente valore di P ≥0.05. Se non con successo, provare i valori 405, 415, e 425.
- vari profili
- Ripetere i passaggi 5,6-5,9 per ogni profilo elettroforesi separatamente.
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Representative Results
Definizione di un genotipo e le sue varianti
Un profilo elettroforetico differiscono in più di una banda da tutti i genotipi identificati è considerato come un nuovo genotipo. I nuovi genotipi sono chiamati ed estese in base alle Fournier et al. 5 che conduce ai genotipi GTA per GTZ, seguiti dai genotipi GTAA a GTAZ, e GTBA a GTBZ, e GTCA a CGT attualmente. Variazione solo una banda è considerata una variante genotipica. E 'indicato con numeri romani in apice dopo il nome del genotipo (ad esempio, GTRI, GTRII). In totale, ci sono attualmente 141 genotipi e varianti nella base dati di riferimento.
Nelle condizioni di cui sopra, RS-PCR da Fournier et al. 5 è altamente riproducibile al genotipo ceppi di S. aureus. identificazione definitiva di unnoto genotipo o variante è sempre possibile se i problemi tecnici possono essere esclusi. Un risultato tipico è presentato in Figura 1 dimostra l'elettroforesi di 12 RS-PCR prodotti e presentato nella modalità pseudo gel dal software bioanalizzatore. Ogni corsia è caratterizzato da un modello di due o più bande di PCR e una banda marcatore davanti e una banda marcatore alla fine. Facendo doppio click in una corsia apre il corrispondente profilo elettroforetico effettivamente misurati in una finestra separata. Il software bioanalizzatore permette, tra le altre possibilità, i picchi osservati essere letti come formato come unità fluorescenti FU (figura 2) o in bp (Figura 3) per cui un picco corrisponde esattamente ad una banda in modalità pseudo-gel. Lettura Peak in FU è necessaria per valutare i picchi pertinenti di un profilo nel software Mahal (Figura 4), lettura in bp per inferire il genotipo. picchi non rilevanti sono definiti nel software Mahal come piccolo piselloks cui fluorescenza osservato FU è inferiore al 40% della media geometrica dei 4 (3) picchi con massima fluorescenza. Essi sono normalmente osservati quando vi è un eccesso di DNA in RS-PCR (> 30 ng puro DNA / dosaggio) 2.
Come esempio, il genotipo di campione 211 presenti in figura 1 è dedotto. Analisi visiva del profilo elettroforetico in figura 2 (software bioanalizzatore) e l'analisi con il software Mahal usando lo strumento per verificare picchi irrilevanti rivelato 6 picchi rilevanti con misure di picco di 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, e 622 bp (Figura 3). Questi valori vengono compilati e separate da virgole nella casella di testo "picchi di assorbimento (bp)" del software Mahal (Figura 4). Per correggere le deviazioni specifiche-run, il valore 415 è stato inserito nella casella di testo "Osservato Peak (bp)" (Figura 4). Dopo aver premuto il tasto "CPulsante alculate ", presentazione di una lista ordinata dal genotipo insieme al quadrato Mahalanobis distanza D2M tra il profilo genotipico interrogato e indicato. scorrere l'elenco alla ricerca di minima D2M. Nel caso di specie, il minimo D2M è pari a 4.499 (Figura 4) con un valore di P ≥0.05, il che significa che il profilo interrogato non si discosta significativamente da quello di GTB.
Varianti di genotipi sono indicati come _I al _XV nel software Mahal. Nel caso del genotipo B, ci sono le tre varianti GBT I, GBT II, e III GBT indicato come b_i, B_II, e B_III nel software (Figura 4).
Un chip del kit MED permette ai prodotti di analisi di 12 RS-PCR alla volta. Se meno prodotti sono disponibili, i pozzi rimanenti devono essere caricati con acqua deionizzata. I risultati possono essere interpretati solo se i controlli included in RS-PCR sono appropriati.
Figura 1. Pseudo-gel che rappresenta 12 RS-PCR prodotti e le loro genotipi dedurre. Dodici diversi ceppi di S. aureus sono stati analizzati da RS-PCR utilizzando il kit MED insieme ad un bioanalizzatore e il software incluso. La corsia sul lato sinistro mostra il marcatore o "scaletta" per la calibrazione dimensioni del sistema in bp. Sulla parte superiore della grafica, i nomi dei campioni e dei genotipi corrispondenti sono incriminati che sono stati ottenuti dal software Mahal. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. profilo elettroforetico di Sample 161 presenti in figura 1. In cima alle vette della fluorescenza misurato è indicato in FU. Picchi visivamente distinguibili che non sono stati rilevati dalla necessità software bioanalizzatore di essere stimati da loro lettura dalla trama come eseguita per la vetta con un valore di fluorescenza stimato di 113 FU (in blu). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. profilo elettroforetico di campione 211 presenti in figura 1. In cima alle vette loro dimensione è indicato in bp. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Schermata del software Mahal. Nella casella di testo "picchi di assorbimento (bp)" le dimensioni di picco di campione 211 di figura 3 sono riempiti in. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fase più critica dell'intero procedimento è quando vi è un eccesso di DNA in RS-PCR (> 30 ng puro DNA / dosaggio) 2. In generale, la risoluzione di un profilo è ottimale se tutti i suoi picchi di inizio e fine al basale. Se due picchi sono troppo vicini tra loro, la risoluzione è incompleta. In queste condizioni, il software bioanalizzatore può portare a contenuti picco di identificazione in modo che sia necessaria l'identificazione manuale.
Tutte le cime visibilmente separati e rilevanti espressi come BP o FU sono inclusi per ulteriori analisi. Troppo DNA template per RS-PCR si traduce in ampi picchi e quindi a picco risoluzione sovrapposizioni e compromissione dei picchi. Inoltre, la migrazione è lenta leader picco dimensioni che vengono falsamente aumentato in modo che il genotipo non può più essere dedotta. Infine, il numero di picchi irrilevanti è più grande. Per i profili con più di 3 picchi, il picco con il massimo di fluorescenza dovrebbe di norma non superiore a 150 FU.
Genotyping by RS-PCR come descritto è limitata dal fatto che gli investimenti in macchine è necessaria ed è necessario il software gratuito Mahal. In realtà, sono necessari una macchina PCR standard e il bioanalizzatore. Il primo è piuttosto a buon mercato al giorno d'oggi, mentre il secondo è più costoso. La risoluzione di elettroforesi di agarosio-based non è sufficiente anche se si usa alta risoluzione agarosio. In queste condizioni, è solo possibile distinguere tra GTB, GTC, e tutti gli altri genotipi. I costi per elettroforesi utilizzando il kit MED o l'elettroforesi di agarosio, tuttavia, sono simili. Il kit MED insieme bioanalizzatore ulteriormente supera elettroforesi di agarosio standard in un modo che quest'ultimo metodo è pratico, semplice, ei dati ottenuti è presente in forma elettronica che semplifica stoccaggio e ulteriori analisi considerevolmente. Principalmente tutti bioanalyzers disponibili in commercio sono adatti a questo tipo di analisi, a condizione che il electrophoretrisoluzione ic è adeguata e la dimensione ottenuto delle bande è accurato e imparziale.
La risoluzione di RS-PCR per i ceppi bovini di S. aureus è alto. E 'buono come tipizzazione spa, e meglio di MLST e PFGE 4,14. Inoltre, rispetto a tutti gli altri metodi di tipizzazione comunemente usati per sottotipo S. aureus (tipizzazione spa, MLST, PFGE), la sua produttività del campione è elevato: estrazione del DNA è facile e veloce, 96 campioni possono essere elaborati in una corsa RCR (normalmente O / N) e l'elettroforesi e genotipo inferenza è semplice. L'analisi completa dei 96 campioni richiede una notte per la PCR e un giorno per elettroforesi e valutazione. Altri vantaggi di RS-PCR da Fournier et al. 2 sono i costi bassi, in particolare rispetto a MLST che richiede sette geni ad essere sequenziati in entrambe le direzioni 15. Inoltre, RS-PCR è l'unico metodo predire contagiosity e la patogenicità dei ceppi diS. aureus coinvolti in mastite bovina 2,5, predittori chiave nella medicina veterinaria clinica. Infine, RS-PCR da solo è sufficiente per studiare l'epidemiologia di S. bovina aureus 3,4,5,14. Interpretazione dei dati è semplice, anche in un contesto internazionale come solo pochi grandi genotipi sono osservate 2,3. Per i confronti epidemiologici tra bovino e ceppi umani, RS-PCR e tipizzazione spa insieme sono preferibili come il secondo metodo è ampiamente usato per sottotipizzazione ceppi umani in modo che un sacco di dati sono disponibili. MLST, tuttavia, è adatto per valutare la clonalità dei ceppi 15 e per analisi filogenetiche 4.
Per la risoluzione dei problemi per quanto riguarda il cycler PCR, kit di MED e il bioanalizzatore, i manuali corrispondenti sono di essere consultato. Nel caso del metodo RS-PCR, la risoluzione dei problemi è massicciamente semplificato se adeguati controlli positivi e negativi di PCR sono included in ogni seduta. Se il controllo positivo è negativo, il mix PCR non è stato adeguatamente composto e / o il DNA di controllo era degradato. Se il controllo negativo (H 2 O) generato uno o più gruppi, la miscela di PCR è stato contaminato con qualche DNA. In entrambi i casi, i profili non devono essere interpretati e RS-PCR deve essere ripetuta. Se interpretazione è impossibile a causa di un problema elettroforetico, elettroforesi deve essere ripetuto con un nuovo chip. problemi elettroforetiche sono normalmente caratterizzati da migrazione inadeguata e l'allineamento di una o entrambe le bande marcatori derivanti dal caricamento e manipolazione del chip appropriati. Se il profilo elettroforesi ottenuto non può essere interpretata dal software Mahal, il file di profilo generato dal software bioanalizzatore viene inviato all'autore per ulteriori valutazioni. Normalmente, troppo DNA modello è stato utilizzato per la RS-PCR o il profilo rappresenta un nuovo genotipo o variante genotipica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
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- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
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