Summary
Bu protokol, bakım davranışı ölçmek için sağlam, nicel veri üreten, Drosophila'daki ölçeklendirilebilir bireysel bakım tezgah tekniğini tanımlamaktadır. Yöntem, bakımsız ve bakımlı hayvanlar arasındaki boya birikimindeki farkın belirli bir süre boyunca karşılaştırılmasına dayanmaktadır.
Abstract
Drosophila tımar etme davranışı hem ön hem arka kıskaçların koordine hareketini gerektiren karmaşık, çok adımlı bir lokomotif programdır. Burada, damlama deneyi protokolünü ve Drosophila damatlaştırma konusundaki küçük ölçekli veya büyük ölçekli araştırmalar için uygun maliyetli ve ölçeklendirilebilir yeni oda tasarımı sunuyoruz. Sinekler Brilliant Yellow boya ile vücudun her tarafına tozlanır ve boya oda içindeki bedenlerinden uzaklaştırılması için zaman verilir. Sinekler daha sonra, boya çözündürmek için belirli bir hacimde etanol içine çöker. Dezenilmemiş hayvanlara kıyasla bakımsız hayvanlar için boya etanol numunelerinin göreceli spektral absorbansı ölçülür ve kaydedilir. Protokol, tek tek sinekler için boya birikiminin niceliksel verilerini verir; bunlar kolaylıkla ortalanabilir ve örnekler arasında karşılaştırılabilir. Bu, deneysel tasarımların mutant hayvan çalışmaları veya devre manipülasyonları için damat yeteneğini kolayca değerlendirmesini sağlar. Bu verimli prosedür çok yönlü ve ölçeklenebilir. WOrk akışını ve Drosophila tip I Dopamin Reseptörü ( DopR ) için WT hayvanları ve mutant hayvanlar arasındaki karşılaştırma verileri.
Introduction
Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) 'de tımarlama , birden fazla bağımsız motor programının koordinasyonunu içeren sağlam bir doğuştan gelen davranıştır 1 . Meyve, toz, mikrop ve diğer patojenler vücutlarını temizler; bu da, görme ve uçuş gibi normal fizyolojik fonksiyonları engelleyebilir veya önemli bağışıklık sorunlarına yol açabilir. Hem mekanik 2 hem de bağışıklık aktivasyonunu 3 algılar ve yanıt verirken, sinekler yeterli derecede temizleninceye ve vücudun bir başka bölümüne doğru ilerleyinceye kadar bacaklarını birlikte ya da hedeflenen bir vücut bölgesine tekrar ovarlar. Sinekler, kalıplaşmış desenler 1 , 4'te büyük oranda ortaya çıkan belirgin vuruşlarda tımar etme hareketleri gerçekleştirirler. Davranışsal bir hiyerarşi, tımar sinyalleri önceliklendirildiğinde ortaya çıkar. Etkinlik devreleri ve kalıpları;hiyerarşinin en üstünde tımar programlar sonradan 5 bakımlı vücut bölgelerinden paralel sinyallerini ilk oluşur ve bastırmak fa modeli. Başa en yüksek öncelik verilir, daha sonra karın, kanatlar ve nihayetinde toraks 5 verilir .
D. melanogaster'ın tımar programı, sinirsel devreleri, modüle edici moleküler sinyaller ve nörotransmitterleri incelemek için ideal bir sistemdir. Örneğin, nörofibromin fonksiyonunun 6 uzlaşılması, Drosophila kırılgan X zihinsel gerilik proteininin ( dfmrl ) 7 kaybı ve bisfenol A (BPA) 8'e maruz kalma, aşırı nevrofibromatozis , kırılgan X semptomlarına benzeyen aşırı bakımı ve diğer davranışlara neden olur Sendromu ve otistik spektrum bozukluklarının ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğunun (DEHB) yönlerini içerir. Bakım davranışı aynı zamanda habitua da olabilirBu motor programını davranışsal plastisite çalışmaları için ödünç alan mutant suşlar 2 boyunca farklı şekilde ölçülmüştür. Drosophila tarafından modellenebilen nörolojik olayların genişliği, sineklerin kendilerini damatlama yeteneğini ölçmek için yeni bir karşılaştırmalı yaklaşım gerektirir.
Vesiküler monoamin taşıyıcılarının ve vücudun içindeki diğer dopamin ve diğer biyojenik aminlerin bol miktarda biraraya getirilmesinin, meyve sineği tımar etme davranışına aracılık ettiği gösterildi 9 , 10 . Tiramin, oktopamin bir öncüsü, aynı zamanda daha az bir oranda 7 bakım tetikler oktopamin ve dopamin, başları sinekler karşılaştırılabilir Arka bacak bakım aktivitesini uyarır. D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14'te dört dopamin reseptörü tanımlanmıştır 15 tımar Tip I ailesi Dopamin Reseptör DopR (dilsiz DopR, dDA1) Arka bacak içinde bir rol belirlendi.
Bakım dolaylı olarak, bir hayvanın tüm vücudu bir işaretleyici boya veya flüoresan tozu 5 , 16 ile tozladıktan sonra tamamen damat olabileceği temizlik derecesine bakarak nicelleştirilebilir. Vücutta kalan tozun geri kalanı genel davranış için göreceli bir işaretleyici olarak kullanılabilir. Damlamaya yetecek vakit verildikten sonra tozlu sinekler tımar davranışında belirgin bir eksikliği gösterebilirler. Tımar araştırmalar daha geniş olmak gibi, protokoller boyun bağ sinirler 10 üzerine farmakolojik tedaviler ekleme kafaları kesilmek gibi uygulamalar dahil olması, bakım yanıtı 2 ortaya çıkarmak için, kılların dokunsal uyarılmasıVe davranış video kaydı 15 . Tımar doğrudan gözlenmesi, kolaylıkla görsel gözlem ile ve elle belirli bakım etkinlikleri 4 süresini ve sıklığını kaydedilmesiyle incelenebilir.
Bir 3B yazıcı veya lazer kesici ile yapılabilecek on beş kuyu bakım odasını tasarladık ve üretim planı tasarımları üreme için hazırdır 15 . Tasarım, sırasıyla sinek ve / veya boya yüklü, örgü ve iki ek kayar üst ve alt plaka ile birbirine uyan açıklıklar olan iki birleştirilmiş merkezi plakalar kullanıyor. Toz haline getirilmiş sinekler damat kılmaya izin verdikten sonra, onları boya çözündürmek ve bu solüsyonun emiciliğini boyanın dalga boyunda ölçmek için etanolde bırakırız. Birden fazla paralel numune için bir plaka okuyucu kullanılabilir veya tekli numuneler için tekli okunur bir spektrofotometre kullanılabilir. Bu yöntem kullanım ve harekete geçirme hatalarını en aza indirir.Daha düşük, daha düşük maliyetli bir ölçekte yapılacak tımar testleri için düşükler. Bu yöntem, elde edilen ve sıcaklığa duyarlı devre manipülasyonlar için 5 ısıtma elemanları ile daha büyük bir bakım odaları kullanımı Julie Simpson ve Andrew tohumları, öncülük metotlardan modifiye edilmiştir. Aşağıdaki protokol, vücudun her bölümünde boya birikiminin nicelleştirilmesi için alternatif yöntemlerin yanı sıra, tüm vücut bakımlarının sayısallaştırılmasını gösterir. Ayrıca, WT ve DopR mutantları arasında örnek karşılaştırma verisinin yanı sıra bakım davranışı için basit bir performans indeksinin hesaplanması için yöntemler sunuyoruz .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık
- Canlı Drosophila'yı kültür şişesinden damat odasına taşımak için bir aspiratör hazırlayın. Aspiratörler, anestezinin sonraki davranışsal gözlemi etkilememesini sağlamak için bilinçli hayvanların davranış odasına transfer edilmesine izin verir.
- Makas kullanarak, 1 fitlik tek kullanımlık mikropipet ucunun ucundan en az 1 inç uzakta, 1.5 fit tigon borusu ID 1/8 kes. Kesme ucu üzerine 1 cm'lik kare mesh (açıklık 0.196 inç) tutun.
NOT: Çoğu 1mL ipucu, tipin paket kutusuna oturduğu, genellikle o satıra kesilen bir derecelendirme çizgisine sahiptir. - Örgü / kesme ucu üzerine taze 1 mL'lik bir mikropipet ucu yerleştirin. Örgü şeklini iki ipucu arasında sıkı bir engel oluşturarak izleyin. Yeni ucun içi sinekler için bir tutma odası oluşturur.
- Tek bir sineğin geçişini sağlayacak kadar genişliği açmak için yeni mikropipet ucunun ucunu kesin. KulübeYakıt deposunun deliğine yaklaşık olarak uyacaktır (yaklaşık 1.5-2 mm çapında).
- İç içe geçmiş ipuçlarını tygon hortumunun ucuna tam olarak oturtun. Vakum basıncına izin vermek için sıkı bir şekilde oturmasını sağlamak için uçları borunun içine doğru itin.
- Borunun diğer ucunda 200 μL'lik bir mikropipet ucunun ucunu kesin ve borunun içine dar kesim ucunu yerleştirin. Bu aspiratörün "ağız" tarafıdır.
- Makas kullanarak, 1 fitlik tek kullanımlık mikropipet ucunun ucundan en az 1 inç uzakta, 1.5 fit tigon borusu ID 1/8 kes. Kesme ucu üzerine 1 cm'lik kare mesh (açıklık 0.196 inç) tutun.
- Toz alikot tüpleri hazırlayın. Katranlı tartı kağıdına yaklaşık 5 mg Parlak Sarı boya tartın. Tozu 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın ve kapağı sıkıca kapatın.
NOT: Bazı lateks eldivenleri boya geçirgen olduğu için, kısımların hazırlanması sırasında nitril eldiven kullanmanızı öneririz. - Denemedeki tüm numuneler için (her odadaki her sinek için bir tane) adım 1.2'yi tekrarlayın.
- Etanol (EtOH) tüpleri hazırlayın: 1 mL% 100 EtOH, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Genotipler veya koşullar için etiket tüpleri. </ Li>
- Denemedeki tüm numuneler için (her odadaki her sinek için bir tane) adım 1.4'ü tekrarlayın. Bakım testinin tamamlanması için EtOH tüplerini kapatın ve kaydedin. Negatif kontroller için sadece bir sinek olmadan sadece 1 mL EtOH olacak en az bir "Boş" numune de ekleyin.
- Her damat haznesini, kayan üst plakayı (daha küçük deliklerle) vidalayın, ancak alt plakayı (daha büyük deliklerle birlikte) toz eklenmesi için çıkartarak bir araya getirin.
- Her gerekli bakım odasını üst kısmı aşağı bakacak şekilde masanın üzerine koyun. Sinek giriş tarafı yüzü aşağı bakar.
- Tüp, istenen kuyunun üstündeki haznenin yüzeyine dokunarak her bölmeye 5 mg Brilliant Yellow boya alikuotu yükleyin. Tüm tozların kafesden üst plakaya düşmesini sağlamak için odacığa masanın üzerine dokunun.
- Alt plakayı, konik deliklerin daha geniş uçları dışarıya bakacak ve delikler oyukların üzerine oturmayacak şekilde her hazneye vidalayın. Botu güvende tutunPlakayı sıkıca kapatın, böylece kaymaz ve boya bırakmaz.
- Odanın üstünü çevirin ve bir masaya birkaç kez vurarak toz alt plakaya dayanıncaya kadar düşer.
- Küçük deliklerin, on beş kuyuya hizalanması için odanın üst plakasını "açık pozisyon" a kaydırın, böylelikle tek tek kuyulara sineklerin girmesine izin verin.
2. Uçucu tozlama ve bakım
- Bir saman kullanıyormuş gibi aspiratörün bir ucundan hafifçe emerek ağız aspiratörüne bir sinek yükleyin. Hafifçe üfleme ve ağzı hedefe yönlendirerek sinekleri yatırın.
- Deney için kullanılan her oyuğa bir sinek havalandırın. Bir kuyu yüklendikten sonra üst plakayı kaydırın, böylece sinek oda içine sıkıştırabilir ve diğer kuyuları yüklerken sineğin kaçışını önlemek için odanın tamamı yüklenirken bandın üzerine iyi yerleştirilir. Birden fazla sinek bir şarkının içine asılırsaE, yalnızca bir sinek kalana kadar açıklığı bırakın.
- Gerekli oyukların hepsi sineklerle doldurulduktan sonra, odanın alt plakasının yukarıya gelecek şekilde çevirin; böylece toz, sineklerin ağdan düşerek katını tutma potansiyeline sahiptir.
- Vidaları sıkarak üst ve alt plakları sıkıca sabitleyin ve 4 saniye süreyle sinekleri süpürerek odayı vorteksleyin.
- Boyayı diğer tarafa düştüğü şekilde odacığı (üst plaka aşağı bakacak şekilde) bir masaya iki kez vurun. Ardından, boyayı, üst bölmede tutulan sinekten uzaktaki alt bölmenin zeminde yerleştiğinden emin olmak için bölmeyi çevirin (üst plaka yukarı bakınız) ve bölmeyi iki kez vurun.
- Sinirlenmeye izin verilmeyen kontrol sinekleri için, hemen protokolün 3. Adımına geçin. Testi tamamlayacak sinekler için Adım 2.7'ye geçin.
- Sineklerin damat olmasını sağlamak için odayı bir masa veya tezgah üzerinde, üst plaka ile yukarı doğru otuz dakika yukarıya doğru yatırın. Bölmeyi yerleştirinTüm tımar etme deneyleri (aydınlatma seviyeleri, nem ve sıcaklık) için ortamınızı sabit tutmak için bir gürültüye ve titreşimsiz yere yerleştirin. Oda sıcaklığında veya 25 ° C'de nem kontrollü bir masa üstü kuluçka makinesi idealdir.
3. Numunelerin Hazırlanması ve Absorpsiyon Analizi
- Üst tabla ile hazne seviyesini yukarı tutarak, yavaşça taban plakasını sökün ve boyayı kaybetmemeye özenerek bölmeden çıkarın.
- Odaları, sinekler anestezi edilinceye kadar düşük hava akımı ile bir Fly CO 2 pedine yerleştirin.
- Bölmeden üst plakayı çıkarın. Bir bacak kapmak için dikkatli bir şekilde forseps kullanın ve her bir odadan bir toz püskürtün ve EtOH içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Her biri bir sinek içeren 15 odacık için transfer süresi yaklaşık 3-5 dakikadır. Deneycilerin, deneylerin verimli bir şekilde hazırlanmasını sağlamak için, birden fazla odayla deneyleri şaşırttığında / aktarma sürelerini dikkate almaları gerekir. Her mikro santrifüj tüpüne 1 sinek bulunduğunda kapağı kapatın ve tüpü çalkalamak için üç kez ters çevirin ve boya ve etanol çözeltisini karıştırın.
- Çözünürlüktaki sinekten boyanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için etanol ve sinekler içeren tüpleri oda sıcaklığında 5 saat inkübe edin. 5 saat sonra, sineklerden boyanın temizlenmesini sağlamak için her tüpü (2 saniye) vorteksleyin.
- Plakada bulunan her numunenin yerini not edin, mümkünse, 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 50 uL deneysel 1.5 mL tüp ekleyin. Numuneyi 5 kat seyreltmek için 200 μL EtOH ekleyin. Seyreltme, aşırı tozlanmış sineklerin tavan etkilerini veya büyük tımar kusurlarını önler.
- Her numuneyi 397 nm'de analiz etmek için bir plaka okuyucu kullanın. Alternatif olarak, plaka okuyucu yoksa, görünür spektrumdaki standart bir spektrofotometre üzerinde tek tek numuneler ve boşluklar için absorbansı ölçün.
- Numuneyi plak okuyucu ile okuyun ve kaydedin ve elektronik tabloyu recorde ile kaydedinD numuneleri alıyor.
4. Sonuçların Nicelleştirilmesi
- Tüm örnekler için sonuçları derleyin ve her bir genotip veya durum için varyansı ölçün.
NOT: 0 dakika ve 30 dakika sonra Boya birikimi, tek yönlü ANOVA ve Bonferroni düzeltme veya çoklu paralel karşılaştırmalar için diğer düzeltmeler ile istatistiksel analiz kullanılarak ayrı koşullar olarak kabul edilir. - Aşağıdaki denklemi kullanarak her genotipli / durum için tımar yüzdesi farkını hesaplayın: [(zaman 0'daki boya birikim ortalama değeri - 30'da boya birikim ortalama değeri] / boya biriktirme ortalama değeri 0] x 100.
- Çubuk grafiklerdeki her bir genotip ve durum yüzdesini ifade edin ve genotipler ve koşulları karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Damatlık tahlilinde, ayarlama için belirlenen bir süre boyunca (30 dakika) sineklerin bedenlerinde kalan biriken boyanın göreli geri kalanına dayanılarak davranış performansını değerlendirmek için niceliksel veriler elde edilir. Sürgülü damat odası tasarımının örnek görüntüleri ve tahlilin ana adımları Şekil 1'de vurgulanmaktadır. Sinekler, boya varlığında vorteks yaparak hemen tozlanma olayından önemli miktarda boya toplarlar ( Şekil 2d, 2e ). Tozlanmış sinekler, deney sonrasında bir dizi boya birikimi tutabilir ( Şekil 2f, 2g ). Bu nedenle, EtOH'da boya birikiminin çözünür hale getirilmesi ve tek tek numunelerin emiliminin ölçülmesi, damıtma kabiliyetinin tekrarlanabilir ve yüksek oranda kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.
Dişi renginde damatların düzenlenmesinde DopR'nin bu çalışmasında, güçlü bir hipomorfun bakım performansını (
Farklılıkları araştırmak içinForeleg vs hindleg tımarlama programlarının tuvalet kıvırcıklık yeteneklerini inceledik ve tımar sırasında ayrılabilir vücut parçalarında boya birikimini doğrudan değerlendirdik ( Şekil 4 ). Deney sonrası bireysel sineklerin başlarını, kanatlarını veya "vücudu" (karın / göğüs / bacaklar) parçalayarak, genotipler arasındaki farklılıkları ve benzerlikleri güvenilir bir şekilde nicelleştirmeyi başardık. Bulgular, WT V başkanları için önemli bir farklılık gözlenmediğinden, ön bakım programları için herhangi bir farklılık olmadığını gösteren bir yorumlamayı destekledi. DopR mutantları. Bununla birlikte, genotipler arasındaki kanat ve beden ölçümlerinde önemli farklılıklar gözlenmiştir. Bütün sinekler yerine vücut bölümleri üzerinde birincil testi gerçekleştirmek için bu ek teknik, başlangıçta öne eğdirici ile tırnak bakım programlarını ayırt etmek için basit bir yöntem sağlar. Bu sonuçlar, dikkatli davranışsal gözlemler ve ön kayıtların veya haçların bireysel bileşenlerinin video kaydı veya izlenmesi ile daha da genişletildi ve desteklendi.Uyuşuk davranışlar. Şekil 2-4'teki tüm sonuçlar, Genler, Beyin ve Davranış 15'in izniyle çoğaltılır.
Şekil 1: Drosophila Damıttır Deney İş Akışı. Bu basitleştirilmiş akış şeması, gerekli malzemelerin ve ekipmanların bazılarını vurgulayan tımar protokolündeki ana adımları özetlemektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Boya Birikimine Dayalı Tımarlanmanın Nicelleştirilmesi. ( A ) Tımarhane. Bireysel sinekler ve Parlak Sarı boya, bireysel kuyularda (1 sinek: 1 kuyu) yerleştirilir. boyutlarVe tamamlayıcı verilerde üretim için planlar. ( B, d, f ) WT erişkin erkek Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 erişkin erkek Drosophila. ( B, c ) Tozlamadan önce uçar. ( D, e ) Tozlamadan hemen sonra, tıraştan önce vorteks odasıyla (zaman: 0 dak.) Havalanır. ( F, g ) Bakımdan sonra uçar (zaman: 30 dakika). Ölçek çubuğu = 400 μm. Genler, Beyin ve Davranış 15'in izniyle basılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Dumana Alım Davranışının Modülasyonu için Dopamin Reseptörü ( DopR / dDA1 / aptal ) gereklidir . ( A, c, e ) GroominToz halinden 0 dakika veya 30 dakika sonra ölçülen yabani tip (mavi) ve mutant sinekler (kırmızı / turuncu). SEM, her genotip ve durum için ölçülür. ( A, b ) n = 43 sinek genotipi ve duruma göre. ( A ) WT ve DopR f02676 sineklerin her ikisi de + / + 0 '= p değeri <0.0001, DopR f02676 30' ile karşılaştırıldığında DopR f02676 0 '= p değeri <0.0001 ile karşılaştırıldığında bakım davranışı sergiler (+ / + 30'). DopR sinekleri, WT hayvanlarının yanı sıra damat yapmada başarısız olurlar ( DopR f02676 30 ', + / + 30' = p değeri < 0.001'e kıyasla). Her bir genotipin 0 'da akut tozlanması eşdeğer toz birikimi ile sonuçlanır (ns = önemli değil). ( B, d, f ) Bakım davranışlarını karşılaştırmak için göreli bir değer sunan her genotip için (% 0 'boya birikimi, 30' / boya birikimi, 0 'x 100) boya birikimi yüzdesi hesaplanır. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Şekil 4: Dopamin Reseptör Fonksiyonu, Hindularda Şekillendirmeyi Güçlendirir. ( A ) Tozlamadan sonra 30 dakika sonra WT'nin (mavi) ve DopR f02676 / DopR f02676'nın (kırmızı) ayrı ayrı bakımı ve ardından diseksiyon. Kanat bakım için p değeri = 0.0204. Vücut için p değeri = 0.0302. N = 33-35 sinekler her koşul için. SEM, her genotip ve durum için ölçülür. Tek Yönlü ANOVA ve Bonferonni Düzeltme ile istatistiksel analiz. Genler, Beyin ve Davranış 15'in izniyle basılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil: NIH Image J Pixel Yoğunluğu Yazılımını Kullanarak Damatlık Davranışının Görsel Nicelleştirilmesi için Alternatif Yöntem. ( A ) Wilkin'in GörselleştirilmesiDrosophila'yı diseksiyon kapsamına sokmak. Oval, dorsal abdomeni piksel yoğunluğu için analiz bölgesi olarak tanımlar. ( B ) Ultra Green V10 flüoresan boya pigmenti ile tozlamanın ardından dorsal abdomen görselleştirilmesi. Yeşil flüoresan için standart filtre, mavi-yeşil pigmenti yakalar. ( C ) WT hayvanı, UGV10 pigmenti ile kaplandıktan sonra (önceden bakım yapılır). ( E ) WT hayvanı UGV10 pigmenti ile kaplandıktan sonra (postgrooming). ( D ) UGV10 pigmenti ile kaplandıktan sonra DopRf02676 homozigot mutant (pregrooming). ( F ) UGV10 pigmenti ile kaplandıktan sonra DopRf02676 homozigot mutant (damat sonrası bakım). ( G ) Tüm koşullar için piksel yoğunluğunun nicelendirilmesi. Her genotip veya durum için n = 15 sinek. Tek Yönlü ANOVA ve Bonferonni Düzeltme ile İstatistiksel Analizler. Ns = anlamlı olmayan fark. ***, p <0.001'i temsil eder. plKolaylığı Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakım testi nispeten basittir, ancak deneyanları aşağıdaki hususlara özel dikkat etmeye özen göstereceğiz. Sinekler ve boyayı taktıktan sonra üst ve alt plakalardaki vidaları sıkarak sıkı bir sızdırmazlık korumak tekrarlanabilir sonuçlar için gereklidir. Parlak Sarı boya çok ince ve gevşek derzler odanın kenarlarından boya kaybına izin verecek. Her kuyu için boya içeriğindeki düzensizlik, tımar halindeki olaylar için varyasyon ve sahte pozitif oranları artıracak düzensiz tozlama gibi bakım kantifikasyonunu kolaylıkla atabilir. Buna ek olarak, denemecileri, bakım odasını 30 dakikalık bakımı döneminde tutmayı seçtikleri ortamın farkında olmaları konusunda teşvik ediyoruz. Drosophila davranış tahlilleri için tutarlı performans için sıcaklık, aydınlatma, günün saati ve nem için çevresel sabitlik esastır. Dikkat dağılımını en aza indirgemek için damat odalarını küçük bir inkübatör içerisinde tutunR değişken lab ortamları, sonuçların maksimum tekrarlanabilirliği için idealdir, ancak diğer mekansal düzenlemeler de başarılı olabilir.
Boya birikimi ölçümleri ile ilgili olarak, boyanın lateks eldivenlere geçirgen olduğu gözlemledik, bu nedenle nitril eldivenleri tozu tutmak ve tartmak için tercih edilir. Tozları kolayca lab yüzeylerine yaymamaya dikkat edin, çünkü giysilere kolaylıkla leke sürer ve muhtemelen yüzeyleri veya teçhizatı kirletir. Deneyler için bir alan ve bir uçma istasyonu / CO 2 pedi izole etmek boya maruziyeti içermek açısından tercih edilir. Deneycileri ayrıca UV-şeffaf 96 oyuklu plakalar kullandığınızdan emin olmaya teşvik ediyoruz. Brilliant Yellow boyası için 397nm absorbans piki UV spektrumunun yakınında ve standart 96 kuyucuklu plakalar boya seyreltmeleri için zayıf veya hatalı önlemler verebilir. Boya, EtOH'ya alternatif olarak suda da çözünebilir. Bununla birlikte, Drosophila önemli miktarda vorteksleme ve küçük hava kabarcıkları olmadan suda kolayca çökmezBoyalı hayvanların vücudu boyanın daha düşük kıvam ve çözünürlüğünü gösterir. Doğrudan karşılaştırmalarda etanol sürekli olarak daha iyi sonuçlar ve daha düşük varyans göstermektedir.
Tahlil ek teknikleri ve sinek vücut sonrası analiz ( Şekil 4 ) diseksiyonu gibi daha rafine çalışmalar için kolayca değiştirilebilir. Boya birikimi yalnızca temel biyolojik veya sinirsel nedene doğrudan değinmeden davranış değişmelerini genel olarak işaret ettiğinden, hangi takviye adımlarının etkilendiğini anlamak için bu tür takviyeleri gerektirebilir. Farklılıklar gözlemlenince, video kaydı veya doğrudan gözlem yöntemleri kullanan paralel deneyler damat veriminde herhangi bir farklılığın davranışsal kökünün anlaşılması için gereklidir. NIH ImageJ yazılım programı vasıtasıyla piksel yoğunluğu ölçümlerini kullanarak belirli vücut parçalarında toz partikül birikiminin görsel olarak kantifikasyonu ile birlikte, foreleg ve hindleg'un doğrudan izlenmesiyle de araştırılabilirVideo kayıtları skorlama davranışları. Floresan tozunun görsel olarak kantifikasyonu için alternatif yöntemler konusunda, laboratuardaki erken deneyler, Alkalen Nadir Toprak Metali Silikat-Alüminat Oksit Europium'dan türetilen flüoresan bir boya pigmenti kullandı. Sinekler floresan boya pigmenti ile toz haline getirildikten ve hayvanlara damlatıldıktan sonra anestezi veya kepek kesildikten sonra, vücutlar, bir diseksiyon kapsamındaki GFP için standart bir fluoresan filtre kullanarak dijital mikroskopi ile kaydedilebilir ve analiz edilebilir ( Ek Veri ). Bu yöntem, Brilliant Yellow boya kullanılarak gözlemlenen sonuçlarla paralellik gösteren piksel yoğunluğunun doğru bir şekilde ölçülmesine izin verirken, bu yöntemin işleyişinin nispeten yavaş olduğunu ve pigment parçacıklarının boyutu biraz değiştiğini ve Brilliant için gözlemlenen kaplamadan daha az üniform olduğunu bulduk Sarı boya. Bununla birlikte, bazı deneysel uygulamalar için bu alternatif yöntem uygundur ve mevcut fluo'da önemli çeşitlilik vardırdrosofıla ve nondrosophila uygulamalar veya ayrı olaylar ölçümü gereklidir iteratif tozlama deneyler için yararlı olabileceğini rescent renkler. Boya pigmentinin kendisinin suda çözünür olduğu ancak sudaki flüoresanını hızla kaybedip standart emilim önlemleri için bu pigmentin kullanımını ciddi şekilde sakladığı unutulmamalıdır.
Spesifik foreleg veya hindleg tımar etme olaylarını hedefleyen bu tür yöntemler, bir fenotipin kesin doğasını anlamak için gereklidir ve ileride araştırmak için potansiyel sinirsel devreler veya lokomotor programları vurgulayabilir. Buna ek olarak, paralel kontrol denemeleri için damadın etkileneceği potansiyel spesifik olmayan davranışsal nedenleri ortadan kaldırmak esastır. Hayvanlar geniş motor eksikliği veya anormallikleri gösteriyorsa, tımar açmalarının geniş lokomotif fenotiplere sekonder olması mümkündür. WT hayvanlarının mutant veya cir'e karşı basit video izlemeCuit manipüle edilmiş koşullar, hızdaki büyük kaymalarla veya dolaşımdaki toplam mesafe arasındaki farkları, damla açıklarından bağımsız olarak kolayca ayırabilir.
Bakım deneyi, bu karmaşık çok adımlu lokomotor programın hem küçük hem de büyük ölçekli çalışmaları için uygun çok yönlü bir yöntemdir; Tasarımlar, oda boyutunu veya sayı 15'i arttırmak için kolayca değiştirilir. Yöntem, sineklerin tımar etme becerilerinin karşılaştırmalı değerlendirilmesi için ideal olan sağlam kantitatif verileri verir. Odaların üretimi maliyet açısından verimli ve mevcut kaynaklara bağlı olarak birçok farklı makine (3B yazıcılar, lazer kesiciler, CNC fabrikaları) kullanılarak yapılabilir. Teknik, genetik ekranlar ve işlevsel devre haritalama çalışmaları için kolaylıkla genişletilebilen bireysel numunelerin ara verime izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu metodoloji ve oda tasarımlarını test etme ve tesis etme konusunda erken çalışmalar yapmak için Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon ve Rose Hedreen'e teşekkür etmek istiyoruz. Yazıyı okumak ve düzenlemek için Kelly Tellez ve Graham Buchan'a teşekkür ediyoruz. Andrew Toeds ve Julie Simpson'a öncü çalışmaları ve Brilliant Yellow Dye (Sigma) kullanımını önermek için verdikleri tavsiye ve destekleri nedeniyle teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Mary E. Groff Cerrahi ve Tıbbi Araştırma ve Eğitim Yardım Kuruluşu Güvenliği, Bronfman Bilim Merkezi ve Hellman Fellows Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
