Summary
ووصف وهناك طريقة بسيطة لكنها فعالة التي توظف النانوية المغناطيسية للكشف عن وإثراء خلايا B-مستضد رد الفعل لتحليل وظيفي والمظهرية.
Introduction
الحد تخفيف تحليلات تردد خلية السلائف إفراز الأجسام المضادة قد اقترح أن الخلايا B رد الفعل لمستضد معين يحدث عادة على تردد 0.05 إلى 0.005٪ في جعبته العادي، وهذا يتوقف على حالة التلقيح وحجم / عدد الحواتم موجودة على المستضد. جعلت التردد المنخفض من هذه الخلايا من الصعب دراسة التغيرات في وضعهم خلال تطوير الاستجابات المناعية، مثل بعد التطعيم أو التعرض لمستضد أجنبي، أو خلال تطوير المناعة الذاتية. سابقا، وقد الباحثون إجراء عزل خلايا B-مستضد رد الفعل باستخدام تقنيات تتراوح بين لوحات مستضد المغلفة أو الماصة العمود، لالمغلفة مستضد الدم الحمراء خلية إعادة تعيين، إلى خلية الفرز 1، 2، 3، 4، 5، 6 مضان تنشيط. بالرغم من ذلكح كانت هذه التقنيات ناجحة في تحديد وعزل الخلايا مستضد رد الفعل B، وقد اختلفت النتائج من حيث العائد والنقاء وتطويره. مؤخرا قمنا بتطوير طريقة جديدة لكلا كشف وإثراء نادرة القطعان ب اللمفاويات استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية. طريقة تمكن التخصيب مع ارتفاع العائد نسبيا، ونقاء من السكان انطلاق كبيرة، ومتوافق مع تحليل الردود على مستضد. من خلال إثراء من السكان من الخلايا في تعليق، والأسلوب يلغي القيود التي ترتبط مع هندسة لوحات أو الأعمدة المغلفة مستضد، والحد من الإنتاجية. وأخيرا، منذ تبقى الخلايا المخصبة المرتبطة مستضد ومراسل الفلورسنت، ويمكن زيادة تنقيته بواسطة FACS الفرز. كما هو موضح هنا استخدمنا هذا النهج لدراسة الطرفية الكزاز الدم توكسيد رد الفعل الخلايا البائية قبل وبعد التحصين من الموضوعات الإنسان، وكذلك الخلايا مستضد ذاتي رد الفعل B من الموضوعات مع مختلف autoiاضطرابات مناعية، بما في ذلك داء السكري من النوع 1، مرض جريفز، ومرض هاشيموتو 7. والطريقة تعمل ايضا على قدم المساواة في الماوس والبشرية، ومتوافق مع تحليل الخلايا مستضد رد الفعل B من مجموعة متنوعة من الأنسجة (مخطوطة قيد الإعداد).
في الشكل الأساسي لها، يتم تحضين الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي لأول مرة مع مستضد المعقدة البيروكسيديز جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة إلى الخلية المستضدات السطحية اللازمة لتحليل المظهري. ويتبع هذه الخطوة وضع العلامات من قبل الغسيل والتثبيت، وإضافة streptavidin بالإضافة إلى صبغ بعيدة الحمراء فلوري للكشف عن الخلايا ملزمة المعقدة البيروكسيديز مستضد (الشكل 1). وقد حددت الدراسات السابقة خلايا مستضد معين B بطريقة مماثلة ولكن باستخدام مستضدات مترافق مباشرة إلى تألقي 8، 9، 10، 11. على الرغم من أن هذا هو جديرالنهج، واستخدام المضادات المعقدة البيروكسيديز بالتزامن مع streptavidin يتيح أكبر تضخيم إشارة (التمايز بالتالي أفضل من الربط والخلايا غير ملزمة)، لا سيما عندما المستضدات صغيرة 12 و 13 و 14. وهناك اعتبار آخر هو استخدام streptavidin بدلا من أفيدين لأن deglycosylated streptavidin، وخفض غير محددة وملزمة. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت كما تألقي بسبب صمود لها، والغلة الكم (السطوع)، وحجمها الصغير (~ 1.3 دينار كويتي). fluorochromes البروتين مثل فيكوإيريترين (~ 250 دينار كويتي) وallophycocyanin (~ 105 دينار كويتي) 15 ليست هي الأمثل لأنها يحتمل أن تحتوي على العديد من الحواتم مستضدي. استخدام صبغة الفلورسنت العضوية صغيرة تتألف من حاتمة واحدة، مثل صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت، ويقلل من تعقيد السكان خلية معزولة.
بمجرد خلايا البيروكسيديز واحدntigen وصبغ streptavidin كثف بعيدة الحمراء الفلورسنت، وإثراء أنها تستخدم لمكافحة بعيدا الحمراء الفلورسنت النانوية المغناطيسية صبغ مترافق. لم يتم الكشف عن الجسيمات النانوية واحدة من قبل معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي، وبالتالي ليس من الضروري إزالتها قبل تنقية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز والمقايسات المصب 16. اختيار المغناطيسي للخلايا مستضد معين B إثراء السكان من الاهتمام، والقضاء على الوقت والتكلفة اللازمين لفرز الأحداث النادرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.
فيما يلي نعرض نتائج ممثلة من تخصيب الخلايا الكزاز وتوكسويد الخاصة ب من الموضوع بعد قبل وسبعة أيام التطعيم ضد التيتانوس معززة. لقد اخترنا هذا تطبيق معين على سبيل المثال من أجل إثبات قدرة هذه الطريقة لتخصيب خلايا B-مستضد معين التالية الحاد في تحفيز الجسم الحي. عندما يقترن مع التدفق الخلوي، وهذه الطريقة هي قادرة على إثراء والتمييز مستضد معين ساذجة، والذاكرة، وخلايا أرومة البلازماوية باء وتسمح للباحث لمتابعة التغيرات في وتيرتها مع مرور الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، ندرج الممكن فحص آخر المصب، مثل مقايسة ELISPOT، والذي يدل على أن الخلايا تحتفظ القدرة على إفراز الأجسام المضادة بعد التخصيب. تطبيق آخر من هذه الطريقة يمكن أن تشمل نقل بالتبني من الخلايا المخصب إلى المضيف. لقد أظهرنا سابقا خلايا الحفاظ على القدرة على التصرف كما مستضد الخلايا إلى خلايا T مستضد معين بعد عزل ونقل (لا تظهر البيانات). وبالتالي، هناك عدد من المقايسات المصب المحتملة التي يمكن أن يقترن إلى الطريقة التي تبلغ معا فهم الاستجابة المناعية مستضد معين. وصفناها الأسلوب أدناه، بما في ذلك الضوابط لتحديد العائد الكلي، والنقاء، والنوعية الخلية، وأضعاف اليورانيوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل PBMCs البشرية
- جمع 30-50 مل من الدم باستخدام heparinized أنابيب جمع الدم.
ملاحظة: كمية الدم المستخدمة تعتمد على السؤال تجريبي معين، وتردد في الدم من خلايا B-مستضد معين من الاهتمام. الدم Heparinized يمكن معالجتها على الفور أو هز بلطف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لتجهيز في اليوم التالي. التأخير في معالجة له تأثير ضئيل جدا على كفاءة تخصيب ويترافق مع فقدان الحد الادنى من قدرتها على البقاء. - خلط الدم الكامل 1: 1 مع معقم، والمغنيسيوم والكالسيوم درجة حرارة الغرفة خالية الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- في 50 مل أنبوب مخروطي العقيمة، وإضافة 10 مل من درجة حرارة الغرفة حل التدرج الكثافة. تخزين الزجاجات الكثافة التدرج فتح في الظلام في 4 درجات مئوية، ولكن الحار إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- إذا كان ذلك ممكنا تعيين بندقية ماصة إلى الإعداد بطيئة و / أو تطبيق القليل جدا، ولكن بما يتفق وضغط الزناد لببطءطبقة 30-35 مل من الدم المخفف على أعلى درجة الكثافة، والحرص على عدم خلط اثنين.
ملاحظة: وضع غيض من ماصة على حافة ال 50 مل شطبة في حين اضاف الدم المخفف سوف تساعد على ضمان تدفق مستمر ثابت. - تحولت أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع قبالة الفرامل.
- إزالة الطبقة العليا، والذي يحتوي على البلازما والصفائح الدموية، والحرص على عدم تعكير صفو طبقة الخلايا وحيدة النواة أدناه.
- باستخدام ماصة معقمة، وجمع طبقة الخلايا وحيدة النواة (معطف الشهباء) والمكان الى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي منفصل.
- إضافة برنامج تلفزيوني للتعليق الخلية إلى حجم 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع الفرامل.
- إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في 10 مل من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا وتحديد الجدوى باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا.
- Resuspend الخلايا في 10 7 خلية / مل ومكان على الجليد حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.
2. تلطيخ الخلايا
- إزالة 1-2 × 10 6 خلايا لكل تعويض مضان / تحكم FMO المطلوبة، إن وجدت. تبقى الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
- Resuspend الخلايا في العقيمة التي تمت تصفيتها، عازلة الباردة FACS (PBS + 1٪ زلال المصل البقري (BSA) + 0.01٪ أزيد الصوديوم) في 3-6 × 10 7 خلية / مل (إزالة في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي). تأكد من أن FACS العازلة بارد والحفاظ على الجليد في جميع أنحاء الداخلي تلطيخ.
- تقسيم السكان الخلية إلى أرباع (م) عند تحسين الفحص. استخدام جزء من ألف إلى إثراء خلايا B-مستضد معين من الفائدة، واستخدام الكسور B و C لتحديد خصوصية تخصيب / تلطيخ (انظر 2.5 و 2.6 أدناه)، واستخدام جزء D لتحديد وتيرة وعدد الخلايا مستضد معين في السكان غير المخصب لتمكين حساب العائد وأمثالها اليورانيوم.
- إضافة FcγR الإنسان عرقلة إعادةوكيل لكسور م على الجليد لمنع ملزم من الأجسام المضادة لمستقبلات لكرة القدم.
ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة الصانعة للظروف ملائمة. - إضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى الخلية المستضدات السطحية التي تهم كسور م لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام، والحرص على عدم إدراج fluorochromes قد تعبر تتفاعل مع الأجسام المضادة صبغ مكافحة بعيدا الحمراء الفلورسنت بالإضافة إلى الجسيمات النانوية المغناطيسية.
ملاحظة: وتشمل تقارن الأجسام المضادة لتقترب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت، Cy5، Cy5.5، وCy7. وينبغي لأي بقع الجدوى التي تمت إضافتها تكون متوافقة مع استخدام مثبت. إذا لم يقصد لتحليل الخلايا باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، ولكن تحديد وتيرة إفراز الأجسام المضادة، على سبيل المثال، من خلال ELISPOT، وتلطيخ السطح مع الأجسام المضادة غير ضروري. - لاختبار خصوصية للمقايسة، احتضان جزء (ب) مع كمية كافية من المستضد الخالي من الملصقات لمدة 30 دقيقة على الجليد، مثل أن غالبية المستقبلات مع تقارب على الأقليتم حظر 10 -6 م.
ملاحظة: عادة، وتركيز بداية جيدة هو 50-100 تتجاوز أضعاف كمية المستضد تعتبر كافية في 2.6 أدناه (على سبيل المثال 50-100 ميكرون). وهذا ينبغي منع أي الخلايا البائية مع قابلية عالية للمستضد الخالي من الملصقات لربط مستضد المعقدة البيروكسيديز، والذي يضاف في الخطوة 2.6 أدناه، مما يسمح لتأكيد خصوصية الخلايا المخصب. يمكن أن تكتمل هذه الخطوة بالتزامن مع خطوة 2.4 أعلاه. - إضافة مستضد المعقدة البيروكسيديز إلى الكسور A، B، و D. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تركيز المستضد المعقدة البيروكسيديز يجب معاير لتحديد القيمة المثلى اللازمة لضمان الكشف الكافي وفصل ملزمة الخلايا من الخلايا المارة غير محددة. عادة ما يكون تركيز انطلاق جيدة لاختبار 1-5 ميكرومتر.
ملاحظة: للحصول على الكسور A و D، هذه الخطوة يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة 2.4 أعلاه. لكسر B، يجب أن تتم هذه الخطوة بعد الخطوة 2.5 (الغسيل في betwخطوات التابعين غير ضرورية). - حذف مستضد المعقدة البيروكسيديز من الكسر C من أجل تحديد أي ربط الخلايا البائية إلى الكواشف الأخرى في البروتوكول، مثل streptavidin- صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت وحبات مغناطيسية.
- غسل الخلايا مرتين من قبل تعليق من الخلايا في 1 مل من العازلة FACS الباردة في 5 × 10 7 خلايا والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- بعد غسل النهائي، وتمييع تعليق خلية تتركز في 1 مل 2٪ الفورمالديهايد في 5 × 10 7 خلايا وترك الجلوس في الظلام على الجليد لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: التثبيت من الخلايا في هذه المرحلة يضمن أن مستضد المعقدة البيروكسيديز لا تزال ملزمة لBCR للمدة المتبقية من هذا الإجراء. لخلايا قابلة للحياة - لتحليل المصب، كما هو الحال في ELISPOTs أو نقل بالتبني، حذف الخطوة التثبيت. - غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من العازلة FACS الباردة في 5 × 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend في 1 مل FACS الباردة العازلة في 5 × 107 خلايا.
- إضافة صبغة 1-2 ميكروغرام streptavidin بعيدة الحمراء الفلورسنت / مل واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. عاير كمية streptavidin لكل تطبيق.
- غسل الخلايا مرتين مع 1 مل العازلة FACS الباردة في 5 × 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. اكتمال إعداد جزء D في هذه المرحلة لأنها لن تخضع لتخصيب باستخدام حبات مغناطيسية.
ملاحظة: سيتم استخدام هذا النموذج لتحديد وتيرة وعدد الخلايا مستضد معين B في العينة. وسوف تستخدم هذه لتحديد العائد واضعاف التخصيب بحلول تخصيب تحقيقه.
3. المغناطيسي التخصيب القائم على جسيمات متناهية الصغر
- Resuspend الخلايا من عينات AC في 1 مل من العازلة الباردة فصل (PBS + 0.5٪ BSA + 2mm و EDTA) في 5 × 10 7 خلايا ويمر عبر فلتر 40 ميكرون للقضاء على أي كتل التي يمكن أن تسد العمود.
- إضافة مكافحة Cy5 / نظام مضاد للبعيدا الحمراء الفلورسنت النانوية صبغ. فوص أفضل النتائج، ينبغي معاير تركيز الجسيمات النانوية لكل استخدام، ولكن نقطة انطلاق جيدة 50 تعليق ميكرولتر لكل 5 × 10 7 خلية / مل. تدوير في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- يغسل مرتين مع 1 مل العازلة الفصل البارد في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. Resuspend الخلايا في 1 مل من العازلة الفصل البارد في 5 × 10 7 الخلايا.
4. إثراء المغناطيسي عن طريق LS أو أعمدة LD
- وضع ثلاثة ليرة سورية أو الأعمدة LD في المجال المغناطيسي للفاصل المغناطيسي وإضافة 3 مل من العازلة الفصل الرطب الأعمدة (انظر وصف المنتج لتحديد أي نوع من العمود هو الانسب). السماح لجميع 3 مل لتمرير من خلال عمود وتجاهل بعد جمع.
ملاحظة: على الرغم من أن فصل الخلايا جسيمات متناهية الصغر المسمى المغناطيسية يمكن إنجازه باستخدام أي من أجهزة الفصل المغناطيسية المتوفرة تجاريا، تمت زيارتها المختبر أكثر نجاحا مع استخدام الأعمدة ليرة سورية، في الشركة المصرية للاتصالاتالتربيعي من العائد، والنقاء، وكفاءة تخصيب اليورانيوم. - ضع الأنابيب الثلاثة 15 مل المخروطية المسمى "جزء A / (B) / (C) سلبي"، على الخلايا المحددة سلبا، تحت العمود. إضافة الجسيمات المغناطيسية الخلايا المسمى إلى العمود كل منهما وتسمح وحدة التخزين بالكامل بالمرور.
- إضافة 3 مل من العازلة الفصل البارد على القمة، ونسمح لهذا أن تمر عبر عمود ونكرر مع 2 مل. جمع الخلايا المحددة سلبا ويوضع جانبا على الجليد.
- إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للأرض ووضع على رأس أنبوب مخروطي 15 مل المسمى "جزء A / (B) / (C) الإيجابي"، لالخلايا المحددة بشكل إيجابي.
- ملء العمود إلى أعلى مع ما يقرب من 6 مل من العازلة الفصل وعلى الفور يغرق هذا الصوت من خلال العمود لجمع الخلايا التي كانت متجهة إلى المجال المغناطيسي باستخدام المكبس المقدمة.
- لزيادة نقاء، الخلايا المحددة بشكل إيجابي يمكن زيادة إثراء باستخدام عمود نظيفة في الثانية، وتكرار صناعة تجDURE.
- تدور كل من الكسور مختارة سلبا وإيجابا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ووقف في الحجم النهائي المطلوب. المضي قدما في تحليل المصب، مثل نظام مراقبة الأصول الميدانية، ELISPOT أو نقل بالتبني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل النقاء، والغلة، وأضعاف لتخصيب باستخدام التدفق الخلوي
السكان المخصب على النحو المبين أعلاه تتضمن حتما تلويث الخلايا التي ليست ملزمة صبغ streptavidin- بعيدة الحمراء الفلورسنت لكن محاصرون في المصفوفة. ويمكن إزالة هذه الشوائب من السكان المخصب بنسبة FACS الفرز. لتقدير نقاء السكان المخصب، بوابة على الخلايا الحية على أساس الأمام والجانب مبعثر و / أو العيش / وصمة عار الميتة وتحليل صبغ + خلية تردد بعيدة الحمراء الفلورسنت. النسبة المئوية ضمن هذه البوابة الأخيرة هي مؤشر على نقاء. مزيد من التحليل لخصوصية والمستضد تقارب هذه الخلايا يتطلب FACS الفرز من الخلايا واحدة، تليها استنساخ وتسلسل الجينات المناعي أعرب وإنتاج الأجسام المضادة المؤتلف والتحليل.
ويشير العائد إلى عدد من antige معزولةالخلايا البائية المستردة في جزء ن ملزم وبالنسبة لعدد السكان في البداية (الكسر D). منذ نفس العدد من الخلايا كان في جزء D كما الكسر A، يمكن للمرء أن يحدد بشكل مباشر على الغلة (# خلايا B-ملزمة مستضد في الكسر و÷ # الخلايا ملزم المستضد B في جزء D).
وينعكس أضعاف تخصيب (E) من خلال النسبة المئوية للخلايا الصبغة + B بعيدة الحمراء الفلورسنت في جزء "إيجابيا" التخصيب وقال قريب لأنه في جزء D. تشير هذه القيمة إلى زيادة نسبية في الخلايا B-مستضد معين عن طريق تحقيقه تخصيب جسيمات متناهية الصغر. يمكن العثور على القيمة باستخدام المعادلة التالية:
وللتدليل على هذه التقنية، وتبين لنا نتائج ممثل الحصول عليها باستخدام الكزاز وتوكسويد (تيت-توكس) نموذجامستضد لكشف وإثراء للخلايا B تيت-توكس-رد الفعل في الدم المحيطي من الاشخاص الذين تم تطعيمهم ضد التيتانوس عند نقاط زمنية مختلفة. الرقم 1 هو التخطيطي لطريقة ومكثف المستضد. ويبين الشكل 2A تردد من الخلايا البائية تيت-توكس-رد الفعل من شخص كان آخر تطعيم ضد التيتانوس قبل أكثر من عقد من الزمان. أظهرت هي السكان من كسر ألف وتردد الأساس من الخلايا البائية تيت-توكس محددة من الكسر D. ومن هنا المخصب ( "ايجابية") والمنضب ( "سلبية")، في هذا المثال ونحن قادرون على إثراء خلايا ملزمة بنحو حقق 7 أضعاف ونقاء من 4٪ في جزء المخصب.
ويبين الشكل 2B خصوصية رد فعل باستخدام الدم من الموضوع الذي كان قد تم تطعيمهم ~ في وقت سابق من 3 سنوات. عندما أضفنا تتجاوز 50 أضعاف (50 ميكرون) من الخالي من الملصقات الكزاز وتوكسويد إلى الخلايا قبل المضافاتأيون للمستضد المعقدة البيروكسيديز (جزء B) ونحن قادرون على منع ملزمة بنسبة 83٪، مما يدل على خصوصية المستضد ملزمة. عندما كنا حذف مستضد المعقدة البيروكسيديز من الإجراء (جزء C)، وعدد قليل (~ 0.2٪) من الخلايا البائية لا تزال ملزمة. هذا جزء صغير من الخلايا البائية يفترض يعكس ملزمة لبعض المنظمات غير مستضد في adsorbant، مثل صبغ streptavidin بعيدة الحمراء الفلورسنت، والأجسام المضادة صبغ مكافحة بعيدة الحمراء الفلورسنت أو حبات مغناطيسية.
وللتدليل على استخدام طريقة لتحليل التغيرات في ملزم مستضد الخلايا النمط الظاهري التحصين التالي نقدم لك في الشكل 3 تردد من الخلايا البائية تيت-توكس محددة في ساذجة، والذاكرة، والسكان أرومة البلازماوية في الدم المسحوبة قبل وبعد 7 أيام معززة تطعيم موضوع صحي. بينما انخفضت النسبة المئوية للخلايا B ساذجة بين مجموع الخلايا B-ملزمة تيت-توكس من 84٪ إلى 64٪ بعد دفعة، فإن النسبة المئوية من الذاكرة السكان ذ وأرومة البلازماوية بين مجموع الخلايا تيت توكس-رد الفعل ارتفعت من 16٪ إلى 36٪ و 0٪ إلى 40٪، على التوالي. ويبين الشكل 3B البيانات ELISPOT تمثيلية من الدم المحيطي من 7 أيام بعد دفعة، موضوع صحي. أدى عزل خلايا B-ملزمة تيت-توكس لتخصيب 4 أضعاف في الكزاز الأجسام المضادة تردد إفراز خلايا.
الشكل 1: طريقة للكشف عن وإثراء التيتانوس (تيت توكس) -binding الخلايا البائية. (أ) بروتوكول لتخصيب اليورانيوم وعزل الخلايا B-ملزمة تيت-توكس. (ب) رسم تخطيطي مكثف تستخدم لتحديد وإثراء خلايا B-ملزمة تيت-توكس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ن الصفحات = "1"> 
الشكل 2: cytograms الممثل يدل على إثراء تيت توكس ملزم الخلايا البائية من الدم المحيطي البشري. (A) Cytograms من تخصيبه واستنزاف الخلايا البائية تيت توكس-رد الفعل من الكسر وومجموع الخلايا البائية تيت-توكس-رد الفعل من الكسر D من موضوع عادي مشاركة تطعيم> 10 عاما سابقا. (ب) Cytograms من PBMCs من السكان "ايجابية" من موضوع تطعيم ~ 3 سنوات سابقا والتخصيب كما في ألف (جزء أ)، بعد مرحلة ما قبل الحضانة مع اكثر من 50 أم تحمل اسما تيت-توكس (جزء B)، أو التخصيب مع تيت-توكس البيوتين حذف أثناء إجراء (جزء C). تم بوابات كل التحليلات على الخلايا الليمفاوية CD19 +. وتمثل النسب في المئة من الخلايا توكس ملزم تيت جميع الخلايا البائية (CD19 +) في جزء النهائي.عنخ "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): أمثلة على التحليل بعد التخصيب من الخلايا ملزم المستضد. (أ) الممثل تحليل cytometric تدفق النمط الظاهري الخلية التالية تخصيب خلايا B-ملزمة تيت-توكس. Cytograms تصوير وتحديد وتحليل ساذج تيت-توكس-رد الفعل (CD27 -)، الذاكرة (CD27 +)، وplasmablasts (CD27 + CD38 + +) فى فئة الخلايا البائية للموضوع قبل و 7 أيام بعد التطعيم معززة ضد الكزاز. تم بوابات كل الخلايا على CD19 + الخلايا الليمفاوية من السكان "إيجابي" المخصب. (ب) تحليل الممثل ELISPOT من الأجسام المضادة إفراز الخلايا في التخصيب، المنضب، ومجموع كسور الخلايا البائية غير المخصب من الدم المحيطي من موضوع صحي بعد 7 أيام بومعاهدة الفضاء الخارجي. للمقايسة ELISPOT، والمغلفة الآبار من 96 لوحة جيدا أولا مع 10 ميكروغرام حل / مل من الكزاز وتوكسويد. وقدمت شقين التخفيفات المسلسل من تعليق خلية في الآبار (عبر لوحة) بدءا من الخلايا في التركيز على قدم المساواة من الكسور غير المخصب المخصب، المنضب، والكلية. تم الكشف المضاد للكزاز خلايا الجسم المضاد إفراز مع المعقدة البيروكسيديز المضادة للالبشري مفتش (H & L)، تليها Streptavidin-AP. وقد تم تطوير لوحة مع العازلة تطوير ELISPOT وتوقف رد الفعل من قبل غسل لوحة ثلاث مرات مع المقطر المزدوج-H 2 O. تم تحديد عدد من النقاط في التخفيف خلية في النطاق الخطي، وحساب عدد مخولا لصيانة طائرات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا تصف طريقة رواية لتحقيق العزلة والإثراء من خلايا B-ملزمة مستضد من الدم المحيطي البشري. طريقة قابلة للتطبيق بسهولة على الفئران والأنسجة الأخرى، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، ومتوافق مع تحليل آخر لتخصيب النمط الظاهري خلية وظيفة (مخطوطة قيد الإعداد).
يجب أن يكون المستخدم مدركا لعدد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على نجاح هذا الإجراء. من تجربة تميل الخلايا الميتة التمسك حبات مغناطيسية و"تولي" الأصباغ الفلورية، مثل صبغ Streptavidin بعيدة الحمراء الفلورسنت، مما يؤدي إلى زيادة الخلفية غير محددة. فمن الأهمية بمكان لإزالة العديد من الخلايا الميتة من عينات ممكن قبل بداية هذا الإجراء. استخدام البقع التي تمكن الحية / التمييز القتلى إلى بوابة الخروج الخلايا الميتة من التحليل قد تكون مفيدة، ولكن وجود الخلايا الميتة قد تعرض تفسير المقايسات من الأجسام المضادة إفراز تردد الخلية والدالة التالية نقل بالتبني.
وبالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا أن المعايرة الدقيقة للمستضد المعقدة البيروكسيديز المضافة هي ضرورية لتمييز مستضد معين وغير محددة وملزمة. واستخدام مستضد القليل جدا يؤدي إلى التقليل من وتيرة خلايا ملزم مستضد، في حين أن الكثير من المستضد يمكن أن يسبب كاذبة إيجابي كشف / تخصيب اليورانيوم. استخدام تركيزات المستضد التي يجوز مرتفعة جدا يمكن المشار إليها واضحة ملزمة لخلايا غير B-في العينات. وعلاوة على ذلك، كشف واضح لارتفاع وتيرة بشكل مفرط (> 1٪) من مستضد قد تكون الخلايا المتفاعلة مؤشرا ملزمة قضية خصوصية. الهدف النهائي عند تحديد مبلغ الأمثل للمستضد لاستخدام لإضافة أكثر قليلا المستضد مما هو موجود في تركيزات الفسيولوجية، مثل أن الغالبية العظمى من مستقبلات الخلايا البائية مع تقارب من <10 -6 M، على سبيل المثال، ل ومشبعة للمستضد. وهذا يضمن أن الخلايا مستضد معين B هي بالأبيضeing الكشف مع تقارب أن لديها امكانات المسببة للأمراض. إضافة مستضد القليل جدا، أي عند أو أقل من تركيزات الفسيولوجية، قد يؤدي إلى الكشف عن عدد قليل جدا من الخلايا البائية مستضد معين بسبب انخفاض الاحتلال مستضد من BCRs. من جهة أخرى، إضافة الكثير من المستضد، وهو ما يتجاوز بكثير تركيزات الفسيولوجية، يمكن أن يؤدي إلى زيادة غير محددة وملزمة والتي سوف تشمل الخلايا البائية مع تقارب منخفضة للمستضد (> 10 -6 م) وفعلا جاهل للمستضد في الجسم الحي. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن يعاير أولا مستضد المعقدة البيروكسيديز عبر عدد قليل من السجلات من أجل أن تكون على ثقة من أن يتم الكشف عن الحقيقية فقط خلايا مستضد رد الفعل B. وبالمثل، فقد وجدنا أن استخدام الكثير صبغ streptavidin بعيدة الحمراء الفلورسنت يمكن أن تزيد الخلفية.
ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن biotinylation المستضد يمكن أن تؤثر على توافر الحواتم مستضدي. وبالتالي، وتحسين استخدام biotinylation مختلفة التقىقد يكون hods المهم. بدلا من البيوتين يمكن أن يقترن إلى الأمينات الأولية، الأمينات الثلاثية، sulfhydryls، أو مجموعات الكربوكسيل. استخدام طويلة أطوال الذراع هل يمكن تحسين توافر حاتمة عن طريق الحد من الإعاقة الفراغية.
واحدة من القيود المفروضة على هذه التقنية هو انخفاض فعاليته لتخصيب خلايا B-ملزمة مستضد من cryopreserved مقارنة مع خلايا جديدة. هذا يمكن أن تتصل أكبر موت الخلايا وما يرتبط بها من "الحساسية" في العينات المجمدة. ومع ذلك، يمكن تطبيق الطريقة لالعينات المجمدة ولكن ربما هو المهم عدم مقارنة النتائج مباشرة من التخصيب وتحليل خلايا الطازجة والمجمدة. الحد الآخر هو نقاء خلايا B-مستضد معين في عينة المخصب. من التجربة، وهناك دائما بعض الخلايا التي "علامة على طول"، الذي يشمل كلا من الخلايا البائية غير محددة وخلايا تي. هذا أمر متوقع نظرا لندرة السكان الخلية على تحاول تخصيب. ومع ذلك، ونقاء رانه الخلايا يمكن أن تكون الزيادة عن طريق ضمان أن يتم الحصول على تعليق خلية واحدة قبل أن يضيف الخلايا إلى العمود، وإثراء للمرة الثانية على عمود جديد، أو عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا مستضد معين B. اعتمادا على نوع الدراسة، ويمكن للباحث أن تقرر أي خيار هو أفضل وما إذا كان ذلك ضروريا.
ونحن الأمثل هذه التقنية تصورنا أنه سيكون قابلا للتمييز من قابلية عالية مقابل انخفاض تقارب خلايا مستضد رد الفعل على أساس المعايرة المستضد أو شدة تلطيخ. ومع ذلك، في دراسة سابقة، وأظهرت الخلايا مستضد رد الفعل B مع ما يصل إلى اختلاف 1000 أضعاف في التقارب إلى المستضد بهم وقد أثرى بالتساوي باستخدام هذه الطريقة 7. وبالتالي، لا بد من قياس الرسمي للتقارب من خلايا التخصيب باستخدام سطح تحليل مأكل صدى مستقبلات المستضد المؤتلف وأعرب إذا كانت المعرفة للتقارب هي ذات الصلة لدراسة.
المتأصلة في هذه التقنية هو لالتقليد أن إضافة مستضد المعقدة البيروكسيديز وstreptavidin يمكن تنشيط الخلايا عن طريق عبر ربط BCR. وهذا يمكن أن يشكل مشكلة بالنسبة معينة المقايسات الفنية المصب، مثل تلك التي تسعى للمقارنة بين الخلايا حفز إلى عنصر تحكم يستريح. ويمكن التخفيف من هذه المشكلة عن طريق الحفاظ على عينات السيطرة الباردة لمنع تنبيغ إشارات. ومن الممكن أيضا أن الإشارات BCR يمكن أن يؤثر على استجابة بيولوجية الجارية. من تجربة خلايا التخصيب مستضد الحفاظ على قدرتها على إفراز الأجسام المضادة، كما يتضح من تحليل ELISPOT (الشكل 3B) وظيفة كما مستضد الخلايا إلى الخلايا التائية في المختبر، وبعد نقل بالتبني في الفئران (لا تظهر البيانات). وجود قيود النهائي لهذه التقنية هو استخدام أضداد fluorochome لإنجاز جسيمات متناهية الصغر ملزمة لخلايا مستضد كثف. مكافحة صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت عبر يتفاعل مع بعض fluorochromes المرتبطة هيكليا، بما في ذلك Cy7 وCy5.5. هذا يمكن أن تحد من خيارات ستقارن الأجسام المضادة و المتاحة لقياس العلامات المظهرية. ومع ذلك، مع زيادة توافر fluorochromes جديدة، وهذا أصبح أقل من قضية.
استخدام هذا الكشف وطريقة تخصيب اليورانيوم، فمن الممكن التعرف بسهولة خلايا B-ملزمة مستضد في الجسم الحي السابقين الطرفية الدم والطحال، أو الأنسجة الأخرى. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في دراسة الاستجابة المناعية للخلايا رد الفعل مستضد التالية التحصين أو التعرض لمستضدات الخارجية وفي تحديد أمراض المناعة الذاتية. على الرغم من أن توجد طريقة للكشف عن خلايا مستضد رد الفعل B وقد ثبت أن تكون من دون أخطاء، وهذا الأسلوب هو سريعة وبسيطة، وتنتج نقاء عالية نسبيا، والغلة، وإثراء خلايا مستضد رد الفعل الذي يمكن أن يقترن إلى مجموعة متنوعة من المصب المقاييس. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى المبادئ الأساسية للأسلوب، ويمكن بسهولة أن يكون متلائما هذا الإجراء لمجموعة متنوعة من الاحتياجات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
