Summary
Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.
Introduction
Diluição limitante análise de frequência do precursor de células secretoras de anticorpos sugerem que as células B reactivas a um antigénio particular ocorre tipicamente a uma frequência de 0,05 a 0,005% no repertório normal, dependendo do estado de vacinação e tamanho / número de epítopos presentes no antigénio. A baixa frequência destas células tornou difícil para estudar alterações do seu estatuto durante o desenvolvimento de respostas imunitárias, tais como a seguir a vacinação ou a exposição a um antigénio estranho, ou durante o desenvolvimento da auto-imunidade. Anteriormente, os investigadores assumiram isolamento das células B de antigénio reactivo usando técnicas que vão desde a placas revestidas com antigénio ou adsorventes de coluna, para reajuste de glóbulos vermelhos revestidos com o antigénio, a célula de triagem 1, 2, 3, 4, 5, 6 fluorescência-activado. though estas técnicas têm tido êxito na identificação e isolamento de células de antigénio-reactivo B, os resultados variaram em termos de rendimento, pureza e escalabilidade. Recentemente, desenvolveram um novo método para detectar e enriquecer subpopulações de linfócitos B raros usando nanopartículas magnéticas. O método permite o enriquecimento com um rendimento relativamente elevado e pureza a partir de grandes populações de partida, e é compatível com a análise das respostas ao antigénio. Por enriquecimento de populações de células em suspensão, o método elimina restrições que estão associadas com a geometria de placas ou colunas revestidas com antigénio, e o rendimento limite. Finalmente, uma vez que as células enriquecidas permanecem associadas com o antigénio e um repórter fluorescente, que pode ser adicionalmente purificado por separação por FACS. Tal como aqui descrito, temos usado esta abordagem para o estudo de células B de sangue tétano toxóide-reactivo periféricos antes e após a imunização de seres humanos, assim como células B auto-antigénio de reactivo de pacientes com diversas autoidistúrbios mmune, incluindo diabetes do tipo 1, doença de Graves e doença de Hashimoto 7. O método funciona igualmente bem no ratinho e humano, e é compatível com a análise de células de antigénio-reactivo B a partir de uma variedade de tecidos (manuscrito em preparação).
No seu formato básico, células mononucleares de sangue periférico são primeiro incubadas com o antigénio biotinilado, juntamente com anticorpos para antigénios de superfície celular necessárias para a análise fenotípica. Esta etapa de rotulagem é seguida pela lavagem e fixação, e adição de estreptavidina acoplada a medida de corante-vermelho fluorescente para a detecção das células de ligação biotinilado-antigénio (Figura 1). Estudos anteriores identificaram as células B específicas do antigénio de um modo semelhante, mas utilizando antigénios directamente conjugado com um fluorocromo 8, 9, 10, 11. Embora esta seja uma dignaabordagem, a utilização de antigénios biotinilados em conjugação com estreptavidina permite uma maior amplificação de sinal (por conseguinte, uma melhor diferenciação de células não-ligação e de ligação), em particular quando os antigénios são pequenos 12, 13, 14. Uma consideração adicional é a utilização de estreptavidina em vez de avidina desglicosilada devido estreptavidina é, diminuir a ligação não específica. Além disso, usamos corante vermelho-distante-fluorescente como fluorocromo, devido à sua fotoestabilidade, rendimento quântico (brilho), e seu pequeno tamanho (~ 1,3 kDa). Fluorocromos proteínas, como ficoeritrina (~ 250 kDa) e aloficocianina (~ 105 kD) 15 não são ideais porque eles potencialmente conter muitos epítopos antigênicos. A utilização de um pequeno composto orgânico corante fluorescente de um único epítopo, tal como corante vermelho-distante-fluorescente, reduz a complexidade da população de células isoladas.
Uma vez que as células são biotinilados-Antigen e adsorvido dye-estreptavidina far-vermelho-fluorescente, eles são enriquecidos usando nanopartículas magnéticas corante conjugado anti-far-vermelho-fluorescente. Nanopartículas individuais não são detectados pela maior parte dos citómetros de fluxo e, portanto, não necessitam de ser removidos antes da purificação por separação por FACS e ensaios a jusante 16. selecção magnética para células B específicas do antigénio enriquece a população de interesse, eliminando o tempo e custo da triagem eventos raros usando um citómetro de fluxo.
Abaixo, mostramos resultados representativos de enriquecimento de células tétano-específicas do toxóide B de um assunto antes e sete dias após a imunização com toxóide tetânico reforço. Nós escolhemos esta aplicação particular como um exemplo para demonstrar a capacidade do presente método para o enriquecimento de células B específicas de antigénio seguintes aguda na estimulação in vivo. Quando acoplada com citometria de fluxo, este método é capaz de enriquecer e diferenciação específica de antigénio naïve, memória, ecélulas plasmablast B e permite ao pesquisador acompanhar as mudanças em sua freqüência ao longo do tempo. Além disso, incluir um outro ensaio a jusante possível, por exemplo, um ensaio ELISPOT, o que demonstra que as células conservam a capacidade de segregar anticorpos após o enriquecimento. Outra aplicação do presente método pode envolver a transferência adoptiva de células enriquecidas em um hospedeiro. Nós mostramos anteriormente células de manter a capacidade para actuar como antigénios das células para as células T específicas de antigénio seguintes isolamento e transferência apresentando (dados não mostrados). Assim, há uma série de ensaios a jusante possíveis que podem ser acopladas com o método, que em conjunto informa a compreensão da resposta imunitária específica do antigénio. Nós descrevemos o método abaixo, incluindo controles para determinar o rendimento global, pureza, especificidade celular, e dobre-enriquecimento.
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Protocol
1. Isolamento de PBMC humanas
- Colete de 30-50 ml de sangue, utilizando tubos de coleta de sangue heparinizado.
NOTA: A quantidade de sangue usado depende da questão experimental particular e frequência no sangue de células B específicas para o antigénio de interesse. O sangue heparinizado podem ser processados imediatamente ou agitadas suavemente durante a noite à temperatura ambiente, durante o processamento do dia seguinte. O atraso no processamento tem muito pouco efeito sobre a eficácia do enriquecimento e está associada com o mínimo de perda de viabilidade. - Misture sangue completo a 1: 1 com solução estéril, de magnésio e de cálcio temperatura ambiente livre de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
- Num tubo de 50 ml estéril, adicionar 10 ml de solução de gradiente de densidade temperatura ambiente. Armazene as garrafas de gradiente de densidade abertos no escuro a 4 ° C, mas quente à temperatura ambiente antes do uso.
- Se possível definir a arma pipeta para o ajuste lento e / ou aplicar muito pouco, mas consistente, a pressão de gatilho para lentamentecamada de 30-35 ml de sangue diluído em cima do gradiente de densidade, tendo cuidado para não misturar os dois.
NOTA: Colocar a ponta da pipeta contra o bordo das 50 ml cónica, enquanto a adição do sangue diluído irá ajudar a assegurar um fluxo constante consistente. - Centrifuga-se a 400 xg durante 30 min a 20 ° C, com o travão de desligado.
- Retirar a camada superior, que contém plasma e plaquetas, tendo o cuidado de não perturbar a camada de células mononucleares abaixo.
- Usando uma pipeta estéril, recolher a camada de células mononucleares (buffy coat) e coloque em um tubo de 50 ml estéreis diferentes.
- Adicionar PBS à suspensão de células até um volume de 50 ml. Centrifuga-se a 400 xg durante 10 min a 20 ° C, com travão.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 10 ml de PBS. Contagem de células e determinar a viabilidade utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado.
- Ressuspender as células em 10 7 células / ml e colocar em gelo até estar pronta para posterior processamento.
2. Coloração de células
- Remover 1-2 x 10 6 células para cada compensação de fluorescência / controle FMO necessário, se for o caso. Centrifugar restante das células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio.
- Ressuspender as células em tampão estéril filtrada, frio FACS (PBS + 1% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,01% de azida de sódio) a 3-6 x 10 7 células / ml (em remover um tubo de centrífuga de 1,5 ml). Certifique-se de que o tampão FACS é frio e mantê-lo em gelo durante todo o processo de coloração.
- Dividir a população de células em quartos (AD) quando optimizar o ensaio. Use fracção A para enriquecer as células B específicas do antigénio de interesse, usa frações B e C para determinar a especificidade do enriquecimento / coloração (ver 2.5 e 2.6 abaixo), e fração de uso D para determinar a frequência eo número de células antígeno-específicas em a população não enriquecido para permitir o cálculo de rendimento e dobre-enriquecimento.
- Adicionar re bloqueando FcyR humanaagente de fracções AD em gelo para evitar a ligação de anticorpos aos receptores de Fc.
NOTA: Siga as instruções do fabricante para as condições adequadas. - Adicionar anticorpos fluorocromo-conjugados com antigénios de superfície celular de interesse para AD fracções durante 30 minutos em gelo no escuro, tendo cuidado para não incluir fluorocromos que podem reagem de forma cruzada com os anticorpos anti-corante vermelho-distante-fluorescente acopladas a nanopartículas magnéticas.
NOTA: Estes incluem anticorpos conjugados a corantes fluorescentes infravermelho próximo, Cy5, Cy5.5, e Cy7. Qualquer mancha de viabilidade que são adicionados deve ser compatível com o uso de um fixador. Se não se pretende analisar as células que utilizam FACS, mas determinar a frequência secretoras de anticorpo, por exemplo, por ELISPOT, a coloração da superfície com anticorpos é desnecessária. - Para testar a especificidade do ensaio, incubar Fracção B com uma quantidade suficiente de antigénio não marcado durante 30 min em gelo, de tal modo que a maioria dos receptores, com uma afinidade de pelo menos10 -6 M estão bloqueadas.
NOTA: Tipicamente, uma boa concentração de partida de um excesso de 50-100 vezes a quantidade de antigénio considerado suficiente no ponto 2.6 abaixo (por exemplo 50-100 mM). Isto deve bloquear as células B com uma elevada afinidade para o antigénio não marcado para se ligar ao antigénio biotinilado, que é adicionado no passo 2.6 abaixo, permitindo, assim, a confirmação da especificidade das células enriquecidas. Esta etapa pode ser completada em conjunto com o passo 2.4 acima. - Adicionar antigénio biotinilado para as Fracções A, B e D. Incubar em gelo durante 30 min.
NOTA: A concentração de antigénio biotinilado deve ser titulado para determinar a quantidade óptima necessária para assegurar a detecção e a separação de células a partir de células espectadoras ligação não-específica adequada. Tipicamente, uma boa concentração de partida de teste é 1-5 uM.
NOTA: Para as Fracções A e D, este passo pode ser realizado simultaneamente com a etapa 2.4 acima. Para Fracção B, esta etapa deve ser feito após o passo 2.5 (lavagem em betwpassos een é desnecessária). - Omitir antigénio biotinilado de Fracção C, a fim de determinar qualquer ligação de células B a outros reagentes no protocolo, tais como estreptavidina corante vermelho-distante-fluorescente e as esferas magnéticas.
- Lavar as células duas vezes por suspensão das células em 1 ml de tampão FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Após a lavagem final, dilui-se suspensão de células de concentrado em 1 ml de 2% de formaldeído por 5 x 10 7 células e deixar assentar no escuro em gelo durante 5 min.
NOTA: A fixação das células neste ponto assegura que o antigénio biotinilado permanece ligado ao BCR para o restante do processo. Para as células viáveis - para análise a jusante, como em ELISPOTs ou transferências adoptivas, omitir o passo de fixação. - Lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender em 1 ml FACS frio tampão por 5 x 107 células.
- Adicionar corante 1-2 ug de estreptavidina-far-vermelho fluorescente / ml e incubar em gelo durante 20 min no escuro. Titula-se a quantidade de estreptavidina para cada aplicação.
- Lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão de FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. preparação Fracção D é completado neste ponto, uma vez que não irá sofrer enriquecimento utilizando as esferas magnéticas.
NOTA: Este exemplo vai ser utilizada para determinar a frequência e o número de células B específicas do antigénio na amostra. Isto irá ser utilizado para determinar o rendimento e dobra-enriquecimento alcançado por enriquecimento.
3. Magnetic Enriquecimento à base de nanopartículas
- Ressuspender as células a partir de amostras de CA em 1 ml de tampão frio de separação (PBS + BSA a 0,5% + EDTA a 2 mM) por 5 x 10 7 células e passar através de um filtro de 40 um para eliminar quaisquer aglomerados que podem obstruir a coluna.
- Adicionar Anti-Cy5 / nanopartículas de corante Anti-far-vermelho-fluorescente. for resultados óptimos, a concentração de nanopartículas deve ser titulada para cada utilização, mas um bom ponto de partida é de 50 ul por suspensão de 5 x 10 7 células / ml. Girar no escuro a 4 ° C durante 10 min.
- Lavar duas vezes com 1 ml de tampão de separação a frio a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 1 ml de tampão frio separação por 5 x 10 7 células.
4. Enriquecimento Magnetic Usando LS ou colunas LD
- Coloque três LS ou colunas LD no campo magnético de um separador magnético e adicionar 3 ml de tampão de separação para molhar as colunas (ver descrição do produto para determinar qual o tipo de coluna é o mais adequado). Permitir que todos os 3 ml de passar através da coluna e descartar após a sua recolha.
Nota: Embora a separação de células de nanopartículas magnéticas marcado pode ser realizada utilizando qualquer um dos dispositivos de separação magnéticos que estão comercialmente disponíveis, o laboratório teve o maior sucesso com a utilização de colunas LS, em Terms de rendimento, pureza e eficiência do enriquecimento. - Colocar os tubos três cónicos de 15 ml etiquetados "Fracção A / (B) / (C) negativo", para células seleccionadas negativamente, sob a coluna. Adicionar a partícula magnética células marcadas com a respectiva coluna e permitir que todo o volume para passar através.
- Adicionar 3 ml de tampão de separação a frio na parte superior, e permitir que esta passe através da coluna e repetir com 2 ml. Coletar as células selecionadas negativamente e reserve em gelo.
- Retirar a coluna do campo magnético e colocar na parte superior de um tubo cónico de 15 ml rotulados "Fracção A / (B) / (C) positivas", para células seleccionadas positivamente.
- Encher a coluna ao topo com cerca de 6 ml de tampão de separação e imediatamente mergulhar este volume através da coluna para recolher as células que tinham ligado ao campo magnético utilizando o êmbolo fornecida.
- Para aumentar a pureza, as células positivamente seleccionadas pode ser ainda mais enriquecido utilizando uma segunda coluna limpo, repetindo o procedidure.
- Girar ambas as fracções negativamente e positivamente seleccionadas a 400 xg durante 10 min a 4 ° C e suspender em volume final desejado. Prosseguir com a análise a jusante, tais como FACS, ELISPOT ou transferência adoptiva.
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Representative Results
Análise de pureza, rendimento, e dobre-o enriquecimento usando citometria de fluxo
Populações enriquecidas como descrito acima, inevitavelmente conter células contaminantes que não se ligaram corante estreptavidina far-vermelho-fluorescente, mas estão presos na matriz. Estas impurezas podem ser removidas a partir de populações enriquecidas por separação FACS. Para estimar a pureza das populações enriquecidas, portão em células vivas com base na dispersão frontal e lateral e / ou mancha vivo / morto e analisar frequência dye + celular far-vermelho-fluorescente. A percentagem dentro deste último portão é indicativo da pureza. A análise adicional da especificidade e afinidade de antigénio destas células requer separação por FACS de células individuais, seguido de clonagem e sequenciação dos genes de imunoglobulina expressos e produção de anticorpo recombinante e análise.
Rendimento refere-se ao número de antige isoladoAs células B recuperados na fracção N-se ligar a um relativo ao número da população de partida (Fracção D). Uma vez que o mesmo número de células foram em Fracção D como Fracção A, pode-se determinar directamente o rendimento (# de células B de ligação ao antigénio na Fracção A ÷ # de células B de ligação ao antigénio na Fracção D).
Dobra-enriquecimento (E) é reflectida pela percentagem de células B + corante vermelho-distante-fluorescente na fracção "positiva" enriquecido um parente para que na fracção D. Este valor indica o aumento proporcional em células B específicas para o antigénio alcançados pela enriquecimento de nanopartículas. O valor pode ser encontrado utilizando a seguinte equação:
Para demonstrar esta técnica, mostramos resultados representativos obtidos com toxóide tetânico (Tet-Tox) como um modeloantígeno para detectar e enriquecimento em células B-Tox Tet-reactivas no sangue periférico de indivíduos que foram vacinados contra o tétano, a vários pontos de tempo. A Figura 1 é uma representação esquemática do método e do adsorvente antigénio. A Figura 2a mostra a frequência de células B Tet-Tox reactivos de um indivíduo que foi vacinado contra o tétano mais de uma década atrás. São mostrados a populações de Fracção A e a frequência basal de células B Tet-Tox-específicas de Fraction D. Daí enriquecido ( "positiva") e empobrecido ( "negativos"), neste exemplo, somos capazes de enriquecer células de ligação em cerca de 7 vezes e obteve um grau de pureza de 4% na fracção enriquecida.
A Figura 2b mostra a especificidade da reacção usando sangue de um indivíduo que tinha sido vacinada ~ 3 anos antes. Quando se adicionou um excesso de 50 vezes (50 | iM) não marcado de toxóide tetânico às células antes additião do antigénio biotinilado (Fracção B) que são capazes de bloquear a ligação em 83%, demonstrando a especificidade da ligação ao antigénio. Quando omitido antigénio biotinilado do procedimento (Fracção C), de um pequeno número (~ 0,2%) das células B ainda ligados; esta pequena fracção de células B reflecte presumivelmente a ligação a alguns não-antigénio no adsorvente, tal como o corante de estreptavidina-far-vermelho fluorescente, o anticorpo anti-corante vermelho-distante-fluorescente ou as esferas magnéticas.
Para demonstrar o uso do método para analisar mudanças no fenótipo celular após a imunização de ligação a antigénio que mostramos na Figura 3 a frequência de células B Tet-Tox específicos-no naïve, memória e populações plasmablast no sangue tiradas antes e 7 dias após reforço vacinação de um indivíduo saudável. Embora a percentagem de células B virgens entre células totais Tet-Tox de ligação B diminuiu de 84% para 64% após o impulso, a percentagem de memorpopulações y e plasmablast entre células Tox Tet-reactivos total aumentou de 16% para 36% e 0% a 40%, respectivamente. A Figura 3b mostra dados de ELISPOT representativos de sangue periférico a partir de 7 dias pós-impulso indivíduo saudável. O isolamento das células B de Tet-Tox-ligação levaram ao enriquecimento de 4 vezes na frequência de células secretoras de anticorpo toxóide do tétano.
Figura 1: Método para a detecção e enriquecimento de toxóide do tétano (Tet Tox) liga�o ao células B. (A) Protocolo para o enriquecimento e isolamento de células B Tet-Tox vinculativos. (B) Diagrama de adsorvente utilizado para identificar e enriquecer as células B Tet-Tox vinculativos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: citogramas representativos que demonstram o enriquecimento de Tox Tet de ligação a células B de sangue periférico humano. (A) citogramas da enriquecido e empobrecido células B Tet Tox reactivos de células B Tet-Tox-reativa total de Fracção D de um indivíduo normal últimos vacinados> 10 anos antes Fracção A e. (B) citogramas de PBMCs a partir das populações "positivos" de um sujeito vacinado ~ 3 anos anteriormente e enriquecido como em A (fracção A), após pré-incubação com um excesso de 50 uM não marcado Tet-tox (fracção B), ou enriquecido com Tet-Tox-biotina omitida durante o procedimento (Fracção C). Todas as análises foram delimitação de linfócitos CD19 +. As percentagens representam a percentagem de células Tet-Tox de ligação de todas as células B (CD19 +) na fracção final.ank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplos de análise pós-enriquecimento das células de ligação ao antigénio. (A) Análise de citometria de fluxo representativas de fenótipo de células após o enriquecimento de células B-Tox Tet-ligação. Citogramas retratam identificação e análise de naïve Tet-Tox-reativa (CD27 -), memória (CD27 +) e plasmablasts (++ CD38 CD27 ++) em subpopulações de células B de um assunto antes e 7 dias após a vacinação de reforço contra o tétano. Todas as células foram fechado em CD19 +, de linfócitos as populações enriquecidas "positivos". (B) análise ELISPOT representativas de células secretoras de anticorpo, em fracções enriquecidas, empobrecido e não aperfeiçoados totais de células B do sangue periférico de um indivíduo saudável 7 dias após Boost. Para o ensaio ELISPOT, os poços de uma placa de 96 poços foram primeiro revestidos com uma solução / ml de 10 ug de toxóide tetânico. diluições em série de duas vezes de suspensões de células foram feitos em poços (ao longo da placa) a partir de células em igual concentração das fracções enriquecidas não aperfeiçoados, esgotadas, e no total. células secretoras de anticorpos anti-tétano foram detectados com biotinilado anti-IgG humana (H & L), seguido por Estreptavidina-AP. A placa foi desenvolvida com tampão de desenvolvimento de ELISPOT e a reacção foi interrompida por lavagem da placa três vezes com bidestilada H 2 O. Foi determinado o número de pontos, a uma diluição de células na gama linear, e foi calculado o número de ASC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrevemos aqui um novo método para realizar o isolamento e enriquecimento de células B de ligação ao antigénio a partir de sangue periférico humano. O método é facilmente aplicável a ratinhos e a outros tecidos, tais como o baço e nos nódulos linfáticos, e é compatível com a análise pós-enriquecimento de fenótipo e função (manuscrito em preparação) célula.
O utilizador deve ter conhecimento de um número de variáveis que podem afectar o sucesso deste procedimento. A partir da experiência células mortas tendem a ficar com as esferas magnéticas e "pegar" corantes fluorescentes, como o corante Estreptavidina-far-vermelho-fluorescente, levando ao aumento do fundo não específico. É crítico para remover o maior número de células mortas a partir de amostras quanto possível antes de iniciar este procedimento. Uso de colorações que permitem a discriminação ao vivo / morto para deixar de fora as células mortas da análise pode ser útil, mas a presença de células mortas pode comprometer a interpretação dos ensaios de anticorpos secretores de frequência celular eseguinte função de transferência adoptiva.
Além disso, verificou-se que uma titulação cuidadosa do antigénio biotinilado adicionado é essencial para distinguir específica do antigénio e ligação não-específica. Uso de muito pouco antígeno vai levar a subestimação da frequência de células de ligação ao antígeno, enquanto demasiado antígeno pode causar falso positivo de detecção / enriquecimento. A utilização de concentrações de antigénio que são muito alto pode pode ser indicado por aparente de ligação de células não-B nas amostras. Além disso, resulta da detecção de uma frequência excessivamente elevado (> 1%) de antigénio de células reactivas pode ser uma indicação de se ligar questão especificidade. O objectivo final para determinar a quantidade óptima de antigénio para usar é a de adicionar um pouco mais do que o antigénio está presente em concentrações fisiológicas, de modo a que a maioria dos receptores de células B com uma afinidade de <10 -6 M, por exemplo, para o antigénio são saturados. Isto assegura que as células B específicas do antigénio são being detectado com uma afinidade que tem potencial patogênico. A adição de pouco antigénio, isto é, a ou abaixo de concentrações fisiológicas, pode conduzir à detecção de muito poucas células B específicas do antigénio devido à redução da ocupação antigénio dos BCRs. Por outro lado, a adição de excesso de antigénio, excedendo em muito as concentrações fisiológicas, pode conduzir a uma maior ligação não específica que irá incluir células B com uma baixa afinidade para o antigénio (> 10 -6 M) e são, na verdade, ignorantes do antigénio in vivo. Por isso, é vital para o primeiro titular o antígeno biotinilado através de alguns registros, a fim de ter a certeza de que só os verdadeiros células antígeno-reativa B estão sendo detectados. Do mesmo modo, verificou-se que o uso de excesso de corante-estreptavidina vermelha distante-fluorescente pode aumentar fundo.
É também importante notar que a biotinilação do antigénio pode afectar a disponibilidade de epitopos antigénicos. Assim, otimização usando biotinilação diferente conhecicochos pode ser importante. Alternativamente biotina pode ser acoplado a aminas primárias, aminas terciárias, sulfidrilos, ou grupos carboxilo. A utilização de comprimentos de braço espaçador estendido pode melhorar a disponibilidade do epitopo ao reduzir o impedimento estérico.
Uma das limitações para esta técnica é a sua eficácia reduzida para o enriquecimento de células B de ligação ao antigénio de criopreservadas em comparação com células frescas. Isso poderia se relacionar a uma maior morte celular e associado "rigidez" em amostras congeladas. No entanto, o método pode ser aplicado a amostras congeladas mas é provavelmente importante não comparar directamente os resultados de enriquecimento e análise de células frescas e congeladas. Outra limitação é a pureza das células B específicas para o antigénio na amostra enriquecida. A partir da experiência, há sempre algumas células que "tag along", que inclui tanto as células B não específicas e células T. Isto é para ser esperado, dada a raridade da população de células em está tentando enriquecer. No entanto, a pureza do tele pode ser aumento células, garantindo que uma suspensão de célula única é obtido antes de adicionar as células para a coluna, enriquecendo uma segunda vez sobre uma nova coluna, ou por separação por FACS as células B específicas do antigénio. Dependendo do tipo de estudo, o pesquisador pode decidir qual é a melhor opção e se é necessário.
À medida que esta técnica optimizada visionado que seria passível de discriminação de elevada afinidade contra células antigénio-reactivo de baixa afinidade baseada em titulação de antigénio ou a intensidade da coloração. No entanto, num estudo anterior, mostrou células antigénio-B reactivo com até uma diferença de 1000 vezes na afinidade para o seu antigénio foram igualmente enriquecida utilizando este método 7. Portanto, a medição formal da afinidade de células enriquecidas utilizando análise de ressonância de plasma de superfície de receptores de antigénios recombinantes expressas é necessário se o conhecimento da afinidade é pertinente para o estudo.
Inerente a esta técnica é a Limitação que a adição do antigénio biotinilado e estreptavidina pode activar as células por ligação cruzada do BCR. Isso poderia representar um problema para determinados ensaios funcionais a jusante, tais como aqueles que procuram para comparar células estimuladas a um controle descansando. Este problema pode ser mitigado, mantendo as amostras de controlo a frio para evitar a transdução de sinais. É também possível que os sinais de BCR poderia afectar uma resposta biológica em curso. A partir da experiência as células enriquecidas para o antigénio manter a sua capacidade para segregar o anticorpo, tal como indicado por análise de ELISPOT (Figura 3b) e funcionam como células que apresentam antigénios às células T in vitro e após a transferência adoptiva para ratinhos (dados não mostrados). A última limitação desta técnica é o uso de anticorpos anti-fluorochome nanopartículas para realizar a ligação a células de antigénio adsorvido. Anti- corante vermelho-distante-fluorescente reage de forma cruzada com determinados fluorocromos estruturalmente relacionados, incluindo Cy7 e Cy5.5. Isso pode limitar as opções oconjugados de anticorpos f disponíveis para medição de marcadores fenotípicos. No entanto, com o aumento da disponibilidade de novas fluorocromos, isso está se tornando um problema menor.
Usando este método de detecção e de enriquecimento, é possível identificar facilmente as células B de ligação ao antigénio em ex vivo de sangue periférico, baço ou outros tecidos. Este método é particularmente útil para estudar a resposta imune de células reactivas de antigénio após imunização ou exposição a antigénios estranhos e no contexto da doença auto-imune. Embora nenhum método para detectar células antigénio-reactivo B tem provado ser, sem os seus defeitos, este método é rápido, simples, e produz um relativamente elevado grau de pureza, rendimento, e o enriquecimento de células de antigénio-reactivos que podem ser acoplados a uma variedade de jusante ensaios. Além disso, devido aos princípios básicos do método, este procedimento podia ser facilmente adaptado para uma variedade de necessidades experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
