Summary
기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.
Introduction
제한 희석하여 항체 - 분비 세포의 전구체 빈도 분석은 특정 항원에 대한 반응성 B 세포는 통상적으로 접종 상태 및 항원 상에 존재하는 항원의 크기 / 수에 따라, 통상의 레퍼토리 0.05 % 내지 0.005의 주파수에서 발생하는 것을 제안했다. 이러한 세포의 낮은 주파수는 어려운 등 외국 항원, 또는자가 면역의 개발 기간 동안 다음과 같은 예방 접종 또는 노출과 같은 면역 반응의 개발 기간 동안 자신의 상태 변화를 연구했다. 이전 연구자가 항원 - 코팅 된 적혈구 리셋 항원 코팅 된 플레이트 또는 열 흡착제로부터 레인 징 기술을 사용하여 항원 - 반응성 B 세포의 분리 맡은 1, 2, 3, 4, 5, 6 정렬 셀을 형광 - 활성화. Thoug이러한 기술은 항원 - 반응성 B 세포를 식별 분리에 성공했다 (H)는, 그 결과 수율, 순도 및 확장 성면에서 다양하다. 최근에 우리는 모두 감지하고 자기 나노 입자를 사용하여 희귀 한 B 림프구의 소집단을 풍부하게 할 수있는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법은 큰 시작 인구에서 상대적으로 높은 수율과 순도 농축 수, 항원에 대한 반응의 분석과 호환됩니다. 현탁액 중의 세포의 집단에서 농축함으로써, 상기 방법은 항원 - 코팅 된 플레이트 또는 열 및 제한 처리량의 구조와 관련된 제약을 제거한다. 농축 된 세포가 항원과 형광 리포터와 관련된 남아 보낸 마지막으로, 이들은 더 FACS 분류에 의해 정제 할 수있다. 여기에 설명 된 바와 같이 우리는 다양한 autoi와 과목에서이 전 말초 혈액 파상풍 톡소이드 반응성 B 세포의 연구와 인체의 다음과 같은 예방 접종에 대한 접근뿐만 아니라,자가 항원 반응 B 세포를 사용했다제 1 형 당뇨병, 그레이브스 병, 하시모토 병 (7)을 포함 mmune 장애. 상기 방법은 마우스 및 인간에서 동일하게 작동하며, 다양한 조직 (제조에서 원고)에서 항원 - 반응성 B 세포 분석과 호환된다.
기본적인 형태로, 말초 혈 단핵 세포를 제 표현형 분석에 필요한 표면 항원 셀하는 항체와 함께 비오틴 항원과 함께 배양된다. 이 라벨링 단계는 세척 및 고정을 한 세포를 결합 오티 닐화 항원 (도 1)의 검출 원적외선 형광 색소에 결합 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여된다. 이전 연구와 유사한 방식으로 항원 특이 적 B 세포를 확인했지만하여 항원 직접 형광 색소 8, 9, 10, 11에 접합. 이 가치이지만방법은 스트렙 타비 딘과 함께 오티 닐화 항원의 사용은 항원 12, 13, 14 작을 때 특히 큰 신호 증폭 (결합 및 비 결합 따라서 세포보다 분화)을 가능하게한다. 추가적인 고려는 스트렙 타비 딘 대신 스트렙 아비딘이 탈글 라이코 실화 때문에, 비특이적 결합을 감소의 사용이다. 또한, 우리는 때문에, 양자 수율 (밝기)의 광 안정성, 그리고 작은 크기 (~ 1.3 kD의)에 형광 색소까지 붉은 형광 염료를 사용합니다. 그들은 잠재적으로 많은 항원 에피토프를 포함하기 때문에 단백질 등의 피코 에리 트린과 같은 형광 색소 (~ 250 kD의)와 알로 (~ 105 kD의) (15)는 최적되지 않습니다. 이러한 원적외선 형광 염료 단일 에피토프로 구성된 작은 유기 형광 염료의 사용은 분리 된 세포 집단의 복잡성을 감소시킨다.
세포가되면 바이오틴-Antigen과 멀리 붉은 형광 염료 스트렙 타비 딘 흡착는, 그들은 안티 - 원적외선 형광 염료 복합 자성 나노 입자를 사용하여 농축된다. 단일 나노 입자는 대부분의 유동 세포 계측기에 의해 검출되지 않고, 따라서 정렬 하류 FACS 분석 (16)에 의해 정제하기 전에 제거 할 필요가 없다. 항원 특이 적 B 세포의 자기 선택은 시간 및 플로우 사이토 미터를 사용하여 희귀 이벤트를 분류 비용을 제거 관심 집단을 풍부.
우리는 이전과 칠일 파상풍 톡소이드 부스터 예방 접종 후 대상에서 파상풍 톡소이드 - 특정 B 세포의 농축 대표 결과를 보여 아래. 우리 생체 자극 급성 다음 항원 특이 적 B 세포 농축이 방법의 기능을 설명하기 위해 예로서, 특정 프로그램을 선택했다. 유동 세포 계측법에 결합하면,이 방법은 농후하고 분화 항원 특이 나이브 메모리 할 수 있고,plasmablast B 세포와는 연구자가 시간이 지남에 따라 빈도의 변화를 수행 할 수 있습니다. 또, 예를 들면 세포가 농축 다음 항체를 분비하는 능력을 유지하는 것을 보여주는 ELISPOT 분석, 다른 가능한 하류 분석을 포함한다. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 호스트에 풍부한 세포의 입양 전송을 포함 할 수있다. 우리는 이전에 세포를 분리 및 전송 다음 항원 특이 적 T 세포에 항원 제시 세포로 역할을 할 수있는 능력을 유지 보였다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 함께 항원 특이 적 면역 반응의 이해를 알리는 방법으로 결합 될 수있는 가능한 하류 분석법 수있다. 우리는 전체 수율, 순도, 세포의 특이성을 결정하고, 배 농축을하는 컨트롤을 포함하는 방법을 설명했다.
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Protocol
인간 PBMC를 1. 분리
- 헤파린 혈액 수집 튜브를 사용하여 혈액의 30 ~ 50 ml를 수집.
주 : 사용 된 혈액의 양이 관심 항원 특이 적 B 세포의 혈액에서 특정 실험 질문 빈도에 의존한다. 헤파린 혈액은 즉시 처리 또는 처리 다음날, 실온에서 밤새 부드럽게 흔들 수있다. 처리 지연 농축 효율에 거의 영향을 미치지과 생존을 최소의 손실과 관련된다. - 전혈 1 믹스 : 1 무균 실온 마그네슘과 칼슘없는 인산 완충 식염수 (PBS)로.
- 50 mL의 멸균 원추형 튜브에 실온 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 4 ℃에서 어둠 속에서 개방 밀도 구배 병을 저장하지만, 사용 전 실온이.
- 가능하면 느린 설정으로 피펫 총을 설정 및 / 또는 천천히에 아주 작은, 그러나 일관성, 트리거 압력을가두 가지를 혼합하지 않도록주의, 밀도 구배의 상단에 희석 된 혈액의 30 ~ 35 ml의 레이어.
참고 : 희석 된 혈액을 추가하는 것은 일관성있는 꾸준한 흐름을 보장 도움이 될 것입니다 동안 50 ㎖의 가장자리에 피펫의 팁을 배치는 원뿔. - 브레이크와 20 ° C에서 30 분 동안 400 XG에 원심 분리기이 꺼져.
- 아래의 단핵 세포층을 방해하지 않도록주의, 혈장과 혈소판을 포함하는 상위 계층을 제거합니다.
- 멸균 피펫을 사용하여 단핵 세포 층 (버피 코트)를 수집하고 별도 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치했다.
- 50 ㎖의 부피로 세포 현탁액을 PBS를 추가한다. 브레이크와 20 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 PBS 10ml에 펠렛 세포를 재현 탁. 세포를 카운트하고, 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 생존을 결정합니다.
- 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 10 7 세포 / ㎖와 얼음에 장소를 Resuspend 세포.
세포의 2. 염색
- 각 형광 보상 / 해당하는 경우, 필요 FMO 제어 1-2 × 10 6 세포를 제거합니다. 브레이크와 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 나머지.
- 3-6 X 107 세포 / ml의 무균 여과 차가운 FACS 완충액 (PBS + 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.01 %의 아 지드 화 나트륨)에 재현 탁 된 세포 (1.5 mL의 원심 분리 튜브에서 제거). FACS 버퍼가 찬 것을 확인하고 염색 과정을 통해 얼음에 보관하십시오.
- 분석을 최적화 할 때 사분로 세포 인구 (AD)를 나눕니다. 농축 / 염색의 특이성을 결정하는데 관심을 이용 분획 B 및 C의 항원 특이 적 B 세포를 풍부 분획 A를 사용하여 항원 특이 적 세포의 빈도 수를 결정하고, 사용 분획 D (2.5 이하 2.6 참조) 농축되지 않은 인구는 수익률의 계산을 가능하게하고 배 농축을합니다.
- 인간 FcγR 차단 다시 추가얼음 분수 AD에 에이전트는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 방지합니다.
주 : 적절한 조건에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. - 교차 자성 나노 입자에 결합 된 항 멀리 붉은 형광 염료 항체와 반응 형광 색소를 포함하지 않도록주의, 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 분수의 AD 관심의 표면 항원을 세포에 형광 색소 - 복합 항체를 추가합니다.
참고 :이 근적외선 형광 염료, Cy5에, Cy5.5 및 Cy7 항체 복합체를 포함한다. 추가 된 생존의 얼룩은 고정액의 사용과 호환되어야합니다. 하나 ELISPOT에 의해, 예를 들어, FACS를 이용하여 세포를 분석하고 있지만, 항체 분비 주파수를 결정하고자하지 않는 경우, 항체 표면 염색은 불필요하다. - 상기 분석의 특이성을 시험 얼음에 30 분 동안 표지 된 항원의 충분한 양 분획 B를 배양 등 그 친 화성을 가진 수용체의 대부분은 적어도10 -6 M이 차단됩니다.
주 : 일반적으로 좋은 출발 농도는 항원의 양의 50 내지 100 배 과량 (예 50-100 μM) 2.6 이하로 충분하다고 판단된다. 비 표지 항원 따라서 풍부한 세포 특이성의 확인을 가능하게하기 단계 2.6에 첨가되는 비오틴 항원에 결합하는이 높은 친화력 모든 B 세포를 차단한다. 이 단계는 상기 단계 2.4과 함께 완료 될 수있다. - 30 분 동안 얼음 분수 A, B, 및 D 품어에 바이오틴 항원을 추가합니다.
주 : 비 오티 닐화 항원의 농도는 충분한 검출 및 비특이적 와키 세포로부터 세포를 결합 분리를 보장하기 위해 필요한 최적 량을 결정하기 위해 적정한다. 일반적으로 시험에 좋은 시작 농도는 1-5 μM이다.
참고 : 분획 A와 D의 경우,이 단계는 상기 단계 2.4와 동시에 수행 될 수있다. 분수 B의 경우,이 단계는 betw 단계 2.5 (세탁 후 수행해야EEN 단계)는 불필요하다. - 그러한 streptavidin- 원적외선 형광 염료 및 자성 비드 프로토콜 다른 시약으로 B 세포의 결합을 측정하기 위해 분획 C에서 비 오티 닐화 항원을 생략합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리의 1 ml의 세포 현탁액에 의해 두 번 세포를 씻으십시오.
- 최종 세척 후, 5 × 10 7 세포 당 1 ml의 2 % 포름 알데히드에 집중 세포 현탁액을 희석하고 5 분 동안 얼음에 어둠 속에서 앉아 보자.
주 :이 시점에서 세포의 고정은 비 오티 닐화 항원이 절차의 나머지를 위해 BCR 바인딩 유지되도록. 생존 세포 - 예컨대 ELISPOTs 또는 대체 전송에서와 같이 하류 분석을 위해, 정착 단계를 생략. - 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 두 번 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기 1 ml의 세포를 씻으십시오. 1 용액에 재현 탁 차가운 FACS는 5 × 10 당 버퍼7 세포.
- 1-2 μg의 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료 / ㎖ 추가 어둠 속에서 20 분 동안 얼음에 품어. 각 애플리케이션에 대한 스트렙 타비 딘의 양을 적정한다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기로 두 번 세포를 씻으십시오. 는 자성 비드를 이용하여 농축을 일으키지 않음으로 분획 D 제제는이 시점에서 종료된다.
주 :이 표본은 샘플의 주파수 및 항원 특이 적 B 세포의 수를 결정하는 데 사용된다. 이는 농축에 의해 달성 농축 배 수율을 결정하는 데 사용됩니다.
3. 자기 나노 입자 기반 심화
- 40 μm의 필터를 통해 차가운 분리 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA + 2mM의 EDTA) 5 × 10 7 세포 당 패스 1 ㎖의 샘플 AC에서 재현 탁 세포는 열을 방해 할 수있는 덩어리를 제거합니다.
- 안티 Cy5에 / 안티 멀리 붉은 형광 염료 나노 입자를 추가합니다. FO최적의 결과를 R, 나노 입자의 농도를 각각 사용 적정되어야하지만 좋은 출발점이 5 × 107 세포 / ㎖ 당 50 μl의 현탁액이다. 10 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 회전합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 분리 버퍼로 두 번 씻으십시오. 5 × 107 세포 당 냉 분리 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포.
LS 또는 LD 열을 사용하여 4. 자기 심화
- 자기 분리기의 자기장에 세 LS 또는 LD 열을 놓고 열을 적시하는 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가 (열 유형이 가장 적합한 결정하기 위해 제품 설명을 참조). 3 ml의 컬럼을 통과하여 수집 한 후 폐기 할 수 있습니다.
주의 : 자성 나노 입자 표지 된 세포의 분리는 시판되는 자기 분리 장치의 어느 하나에 이용하여 달성 될 수 있지만, 기관은 TE에서 LS 컬럼의 사용에 가장 성공했다수율, 순도 및 농축 효율의 실효. - 열 아래에 부정적인 선택 세포 표지 세 15 ML 원뿔 튜브 "분수 A / (B) / (C) 음"을 놓습니다. 각각의 컬럼에 자성 입자를 표지 세포를 추가하고 전체 볼륨이 통과 할 수 있습니다.
- 위에 차가운 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가하고이 컬럼을 통과하여 2 ㎖로 반복 할 수 있습니다. 음으로 선택된 세포를 수집하고 얼음에 따로 설정합니다.
- 자기장에서 열을 제거하고 긍정적으로 선택한 셀에 대해 "분수 A / (B) / (C) 긍정적"표시 15 ML 원뿔 튜브의 상단에 배치합니다.
- 제공된 플런저를 사용하여 자기장에 결합 된 세포를 수집하는 컬럼을 통해이 체적을 뛰어 즉시 분리 완충액 약 6 ㎖의 상단에 열을 채우고.
- 순도를 높이기 위해 적극적으로 선택된 셀은 상기 proce을 반복하는 초 청정 컬럼을 사용하여 농축 될 수있다틀리면.
- 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 음과 양으로 선택 분수를 모두 스핀 원하는 최종 부피에서 일시 중지합니다. 이러한 FACS, ELISPOT 또는 입양 전송 등 다운 스트림 분석을 진행합니다.
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Representative Results
순도, 수율 분석 및 배 농축 유동 세포 계측법을 사용하여
필연적으로 streptavidin- 멀리 붉은 형광 염료를 결합하지 않은하지만 매트릭스에 갇혀있다 오염 세포를 포함하는 전술 한 바와 같이 풍부한 인구. 이러한 불순물은 FACS 정렬하여 풍부한 인구에서 제거 할 수 있습니다. 풍부한 인구의 순도를 평가하기 위해, 살아있는 세포에 게이트 앞으로 기반 및 측면 분산 및 / 또는 라이브 / 죽은 얼룩과 멀리 붉은 형광 염료 + 세포 주파수를 분석 할 수 있습니다. 후자의 게이트 내의 비율이 순도를 나타낸다. 이러한 세포의 특이성 항원 친화 추가 분석 클로닝 및 발현 된 면역 글로불린 유전자 서열의 재조합 항체 생산을 분석 하였다 단셀 FACS 정렬을 필요로한다.
수율 격리 antige의 개수를 나타낸다출발 인구 (분획 D)의 수에 대하여 분획에서 회수 된 B 세포를 N 결합. 동일한 수의 셀이 분획 A에는 분획 D에 있었던 이후 하나 직접 수율 (분획 항원 결합 B 세포 분획 D에서 항원 - 결합 B 셀 ÷ 번호 중 #)를 결정할 수있다.
접어 농축 (E)는 "양"풍부한 분획 원적외선 형광 염료 + B 세포의 비율이 값에 의해 달성 항원 특이 적 B 세포의 비례 증가를 나타내는 분획 D.있는 것과 대하여 반사되고 나노 입자 농축. 이 값은 다음 식을 이용하여 구할 수있다 :
이 기술을 보여주기 위해, 우리는 모델로 파상풍 톡소이드 (테트 - 독극물)을 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여항원을 감지하고 변화하는 시점에서 파상풍 예방 접종을 한 환자의 말초 혈액에서 테트 - 독극물 반응 B 세포에 대한 풍부합니다. 도 1에있어서, 상기 항원 흡착제의 개략도이다. 도 2a는 10 년 전보다 더 파상풍 예방 접종을 마지막으로 개인의 테트 - 독극물 반응 B 세포의 빈도를 보여줍니다. 도시 우리가 주위에서 결합 세포를 풍부하게 할 수있는이 예에서, 분수 A 및 따라서 분수 D.에서 테트 - 독극물 특정 B 세포의 기본 주파수에서 인구 ( "음")이 풍부 ( "긍정적") 및 고갈 7 배와는 농축 비율 4 %의 순도를 달성했다.
그림 2B 3 년 전 ~ 예방 접종을했다 주제의 혈액을 사용하여 반응의 특이성을 보여줍니다. 우리는 되어온 전에 셀에 레이블이없는 파상풍 톡소이드의 50 배 초과 (50 μM)를 추가 할 때비오틴 항원 (분수 B)의 이온은 우리가 결합 항원의 특이성을 보여, 83 %가 결합 차단할 수 있습니다. 우리는 절차 (분수 C)에서 바이오틴 항원, B 세포 여전히 바인딩의 작은 숫자 (~ 0.2 %)을 생략하는 경우; B 세포의 작은 부분이 아마도 예컨대 스트렙 타비 딘 원적외선 형광 염료, 항 원적외선 형광 염료 항체 또는 자성 비드, 흡착제에 일부 비 - 항원 결합 반영한다.
부스터 후 우리는 그림 3 순진, 메모리 테트 - 독극물 특정 B 세포의 주파수에 표시 항원 결합 세포 표현형 다음과 같은 예방 접종의 변화, 그리고 전에 그린 혈액 plasmablast 인구 7 일을 분석하는 방법의 사용을 설명하기 위해 건강한 환자의 예방 접종. 총 테트 - 톡스 바인딩 B 세포 중에서 나이브 B 세포의 비율은 과급 후 64 %로 84 %로 감소하는 동안의 비율 memor총 구정 독극물 반응 세포 사이에 y를 plasmablast 인구는 각각 40 % 36 % 0 % 16 % 증가. 도 3b는 7 일 후 부스트 건강한 대상에서 말초 혈액 대표 ELISPOT 데이터를 보여줍니다. 테트 - 독극물 결합 B 세포의 분리는 파상풍 톡소이드 항체를 분비하는 세포 주파수의 4 배 농축되었다.
그림 1 : 탐지 및 B 세포 - 결합 파상풍 톡소이드 (구정 독극물)의 농축을위한 방법. 테트 - 독극물 결합 B 세포의 농축 및 분리를위한 (A) 프로토콜. 테트 - 톡스 바인딩 B 세포를 식별하고 풍부하게 사용될 흡착제 (B) 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : 구정 인간의 말초 혈액에서 B 세포를 독극물이 결합의 농축을 보여주는 대표적인 cytograms. 농축의 (A) Cytograms 및 분수 A와 마지막 예방 접종> 십년 이전에 정상적인 주제에서 분수 D에서 총 테트 - 독극물 반응 B 세포로부터 고갈 구정 독극물 반응 B 세포. 50 μM의 초과와 미리 배양 한 후 A (분수 A) 3 년 전 ~ 예방 접종과 같은 풍부한 주제에서 "긍정적 인"인구에서 PBMC를의 (B) Cytograms는 구정-TOX (분수 B)를 레이블이 지정되지 않은, 또는 농축 절차 (분수 C) 동안 생략 테트 - 독극물 비오틴과 함께. 모든 분석은 CD19 + 림프구에 문이 있었다. 백분율은 마지막 부분에있는 모든 B 세포 (CD19 +)의 테트 - 독극물이 결합 세포의 비율을 나타냅니다.ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 항원 결합 세포의 후 농축 분석의 예. 테트 - 톡스 바인딩 B 세포 농축 다음 세포 표현형 (A) 주제 유세포 분석. 메모리 (CD27의 +)와 B 세포 전에 피사체의 소집단 및 파상풍에 대한 부스터 접종 후 7 일 plasmablasts (CD27 + CD38 ++) - Cytograms은 (CD27) 테트 - 독극물 반응 순진한의 식별 및 분석을 묘사한다. 모든 세포는 풍부한 "긍정적 인"인구에서 CD19 + 림프구에 문이 있었다. (B) 칠일 보 후의 건강한 환자의 말초 혈액으로부터 농축 고갈, 총 농축되지 않은 B 세포 분획의 세포 분비 된 항체의 대표적인 ELISPOT 분석OST. ELISPOT 분석을 위해, 96- 웰 플레이트의 웰 제 파상풍 톡소이드로 10 μg의 / ㎖의 용액으로 코팅 하였다. 세포 현탁액의 두 배 연속 희석는, 농축 고갈, 총 농축되지 않은 분수에서 동일 농도에서 세포로 시작 (접시에서) 우물에서 만들어졌다. 항 파상풍 항체를 분비하는 세포는 스트렙 타비 딘-AP 다음 바이오틴 안티 - 인간 IgG (H & L)로 검출되었다. 플레이트를 ELISPOT 개발 완충액으로 개발되었으며 반응물 O. 선형 범위의 셀 희석 스폿의 수가 결정되었다 이중 증류 H 2 플레이트를 세 번 세척하여 정지시키고,의 ASC의 수를 계산 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 고립과 인간의 말초 혈액에서 항원 결합 B 세포의 농축을 달성하기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생쥐 비장 및 림프절과 같은 다른 조직을 용이하게 적용 가능하며, 세포의 표현형 및 기능 (준비 원고)의 후 농축 분석과 호환된다.
사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수있는 변수의 수를 인식해야한다. 경험에서 죽은 세포가 아닌 특정 증가 배경을 선도, 자기 구슬에 충실하고 같은 스트렙 타비 딘 - 원적외선 형광 염료 형광 염료를, "차지"하는 경향이있다. 이 절차를 시작하기 전에 가능한 한 샘플에서 많은 죽은 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 분석에서 게이트 밖으로 사균 라이브 / 죽은 차별 활성화 얼룩의 사용은 유용 할 수 있지만, 사균의 존재가 셀에 주파수를 분비하는 항체 분석법 해석을 손상 할 수 있고입양 전송 다음 함수.
또, 추가 된 비 오티 닐화 항원에주의 적정 항원 특이 및 비 - 특이 적 결합의 구별에 필수적인 것을 발견 하였다. 너무 많은 항원이 거짓 긍정적 인 탐지 / 농축을 일으킬 수있는 반면 너무 적은 항원의 사용은, 항원 결합 세포의 주파수의 과소 평가로 이어질 것입니다. 너무 높은 일이다 항원 농도의 사용은 샘플 비 B 세포에 결합 명백 의해 표시 될 수있다. 또한, 과도하게 높은 주파수 항원 (> 1 %)의 겉보기 검출 반응성 세포 특이성 문제를 결합하는 표시 일 수있다. 사용하는 항원의 최적 량을 결정하는 궁극적 인 목적은, 생리 학적 농도에서 이러한 본 것보다 조금 더 항원을 추가하는 것을 <10-6 M의 친 화성, 예를 들면, 대와 B 세포 수용체의 대부분 항원 포화된다. 이 항원 특이 적 B 세포 (B)임을 보장병원성 잠재력을 가지고 친 화성 검출 eing입니다. BCRS의 항원 직업 감소에 또는 생리 학적 농도 이하, 즉 너무 적은 항원의 첨가로 인해 거의 항원 특이적인 B 세포의 검출 될 수 있습니다. 한편, 지금까지 생리 학적 농도를 초과 너무 항원의 첨가는 항원 (> 10-6 M)에 대한 낮은 친 화성 B 세포를 포함하고 실제로 항원 무지되는 증가 된 비 - 특이 적 결합을 초래할 수 생체있다. 따라서, 먼저 유일하고 진정한 항원 반응 B 세포가 검출되고 있음을 확신하기 위해 몇 로그에 걸쳐 바이오틴 항원을 적정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 우리는 배경을 증가시킬 수 있습니다 너무 많은 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료의 사용을 발견했다.
이 항원의 바이오 틸는 항원 에피토프의 가용성에 영향을 미칠 수있는 유의하는 것도 중요합니다. 따라서, 다른 바이오 틸를 사용하여 최적화 충족hods은 중요 할 수있다. 대안 비오틴 차 아민, 삼차 아민, sulfhydryls 또는 카르복실기에 커플 링 될 수있다. 확장 된 스페이서 아암 길이의 사용은 입체 장애를 감소시킴으로써 에피토프의 유용성을 향상시킬 수있다.
이 기술의 한계 중 하나는 새로운 세포에 비해 냉동 보존에서 항원 - B 세포 농축에 대한 감소 된 효과이다. 이것은 큰 세포 사멸 및 냉동 샘플 연관된 "끈적임"관련 있었다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 고정 된 샘플들에 적용 할 수 있지만, 직접 신선한 냉동 세포 농축 및 분석 결과를 비교할 수없는 가능성 중요하다. 또 다른 한계는 농축 된 시료 중의 항원 특이 적 B 세포의 순도이다. 경험에서, 일부 셀들은 항상 존재하는 "함께 태그"되는 비특이적 B 세포와 T 세포를 모두 포함한다. 이 풍부하게하려고에 셀 인구의 희귀 주어진 예상한다. t의 그러나, 순도그 세포 또는 항원 특이 적 B 세포를 FACS 분류하여 단일 세포 현탁액은 새로운 열의 두 번째 농축, 컬럼에 셀을 추가하기 전에 얻어지는 것을 보장함으로써 증가 될 수있다. 조사의 유형에 따라 옵션을 결정할 수 연구원 최선인지 것이 필요하다.
우리는이 기술을 최적화 된 바와 같이 우리는 항원의 적정 또는 염색 강도에 따라 선호도가 낮은 항원 반응 세포에 비해 높은 친화력의 차별 의무가 될 것이라고 상상. 항원에 대한 친화도의 1000 배의 차이까지 동일하게이 방법을 사용하여 7로 농축 하였다 그러나, 이전의 연구에서, 우리는 항원 - 반응성 B 세포를 나타내었다. 선호도의 지식이 연구에 적절한 경우에 따라서 발현 재조합 항원 수용체의 표면 플라스 몬 공명 분석을 이용하여 농축 된 세포의 친화도의 형식적 측정이 요구된다.
이 기술에 내재 리터입니다비오틴 스트렙 항원의 첨가는 BCR 가교하여 세포를 활성화 할 수있는 모조. 이는 휴식 제어 자극 세포를 비교하기 위해 노력하는 것과 같은 특정 하류 기능 분석에 대한 문제를 제기 할 수있다. 이 문제는 신호의 전달을 방지하는 저온 제어 샘플들을 유지함으로써 완화 될 수있다. BCR 신호가 지속적 생물학적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 것도 가능하다. 시험 관내에서 세포를 T로 제시 세포 항원 및 마우스에 대체 전송 후에 ELISPOT 분석 (도 3b) 및 기능에 의해 표시된 바와 같이 환경에서 항원 - 농후 셀 (데이터는 도시하지 않음) 항체를 분비하는 능력을 유지한다. 이 기술에 대한 최종 제약 안티 fluorochome 항체의 사용은 항원 흡착 세포에 결합 된 나노 입자를 달성하는 것이다. 안티 멀리 붉은 형광 염료는 Cy7 및 Cy5.5 포함하여 특정 구조적으로 관련 형광 색소와 상호 반응한다. 이 O 옵션을 제한 할 수 있습니다표현형 마커의 측정에 사용할 수 F 항체 접합체. 그러나, 새로운 형광 색소의 증가 가용성,이 문제가 덜되고있다.
이러한 검출 및 농축 방법을 사용하여 용이하게 생체 외 말초 혈, 비장, 또는 다른 조직에 항원 - 결합 B 세포를 식별 할 수있다. 이 방법은 외부 항원에 대한자가 면역 질환의 설정에서 예방 접종 또는 노출 된 후 항원 반응 세포의 면역 반응을 연구에 특히 유용하다. 항원 반응성 B 세포를 검출 할 수있는 방법은 결점이없는 것으로 증명되지 않았지만, 이러한 방법은 빠르고 간단하고, 하류의 다양한 결합 될 수 항원 반응성 세포의 비교적 높은 순도, 수율 및 농축을 생산 분석. 또한,이 방법의 기본 원리로 인해이 절차에 쉽게 실험의 다양한 요구에 맞추어 질 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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