Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Resumo

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Resumo

células B reativas com um antígeno específico geralmente ocorrem com uma frequência de <0,05% dos linfócitos. Durante décadas, os pesquisadores buscaram métodos para isolar e enriquecer essas células raras para estudos de seu fenótipo e biologia. As abordagens são inevitavelmente baseadas no princípio de que as células B reconhecem o antígeno nativo em virtude dos receptores de superfície celular que são representativos na especificidade dos anticorpos que eventualmente serão secretados por suas filhas diferenciadas. Talvez a abordagem mais óbvia para o problema envolva o uso de antígenos conjugados com fluorocromo em conjunto com a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). No entanto, a utilidade desses métodos é limitada pela frequência celular e pela taxa alcançável de análise e isolamento por classificação eletrônica. Um novo método para enriquecer células B raras específicas de antígenos usando nanopartículas magnéticas que resulta em enriquecimento de alto rendimento de células B reativas a antígenos de grandes populações de células iniciais é descrito. Este método permite um melhor monitoramento do fenótipo e da biologia das células reativas ao antígeno antes e após o encontro com o antígeno in vivo, como após a imunização ou durante o desenvolvimento da autoimunidade.

Introdução

Diluição limitante análise de frequência do precursor de células secretoras de anticorpos sugerem que as células B reactivas a um antigénio particular ocorre tipicamente a uma frequência de 0,05 a 0,005% no repertório normal, dependendo do estado de vacinação e tamanho / número de epítopos presentes no antigénio. A baixa frequência destas células tornou difícil para estudar alterações do seu estatuto durante o desenvolvimento de respostas imunitárias, tais como a seguir a vacinação ou a exposição a um antigénio estranho, ou durante o desenvolvimento da auto-imunidade. Anteriormente, os investigadores assumiram isolamento das células B de antigénio reactivo usando téc....

Protocolo

1. Isolamento de PBMC humanas

1. Colete de 30-50 ml de sangue, utilizando tubos de coleta de sangue heparinizado.
   NOTA: A quantidade de sangue usado depende da questão experimental particular e frequência no sangue de células B específicas para o antigénio de interesse. O sangue heparinizado podem ser processados ​​imediatamente ou agitadas suavemente durante a noite à temperatura ambiente, durante o processamento do dia seguinte. O atraso no processamento tem muito pouco efeito sobre a eficácia do enriquecimento e está associada com o mínimo de perda de viabilidade.
2. Misture sangue completo a 1: 1 com solução estéril, de magnésio e de cálcio ....

Resultados

Análise de pureza, rendimento, e dobre-o enriquecimento usando citometria de fluxo

Populações enriquecidas como descrito acima, inevitavelmente conter células contaminantes que não se ligaram corante estreptavidina far-vermelho-fluorescente, mas estão presos na matriz. Estas impurezas podem ser removidas a partir de populações enriquecidas por separação FACS. Para estimar a pureza das populações enriquecidas, portão em células vi.......

Discussão

Descrevemos aqui um novo método para realizar o isolamento e enriquecimento de células B de ligação ao antigénio a partir de sangue periférico humano. O método é facilmente aplicável a ratinhos e a outros tecidos, tais como o baço e nos nódulos linfáticos, e é compatível com a análise pós-enriquecimento de fenótipo e função (manuscrito em preparação) célula.

O utilizador deve ter conhecimento de um número de variáveis ​​que podem afectar o sucesso deste procedimento. A partir da experiência .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Variável de antígeno de interesse		variável	Pelo menos 100 μ g para biotinilar facilmente; se estiver usando proteína, tente usar proteína que tenha sido validada por ELISA. Deve ser transportadora  sem proteínas.
Biotina para rotulagem; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotina	Thermo Scientific	21335	A biotina está disponível em diferentes formulações, como as que contêm vários espaçadores de comprimento, portanto, o tipo usado deve ser determinado pelo pesquisador
Streptavidin-Alexa Fluor 647	Invitrogen	S21374	Pode ser obtido de outros fornecedores.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microesferas	Miltenyi Biotech	130-091-395
LS Colunas	Miltenyi Biotech	130-042-401
MACS separadores manuais	Miltenyi Biotech	variável
Formaldeído			Diluir a 2% com PBS; opcional se o ensaio a jusante exigir células
vivas PBS sem cálcio e magnésio
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Sangue total em tubos
Tampão FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azida sódica)
Tampão de separação (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)
Tubos cônicos de 50 ml Tubos
	cônicos de 15 ml
Tubos Eppendorf de 1,5 ml Anticorpos
reativos a marcadores de superfície, Fc Block, mancha discriminante viva/morta, se necessário
Suprimentos ELISPOT, se necessário

de coleta heparinizados