Summary
Eine einfache aber wirksame Methode, die magnetischen Nanopartikel verwendet antigen-reaktiven B-Zellen für die funktionale und phänotypische Analyse zu erfassen und zu bereichern beschrieben.
Introduction
bei einer Frequenz von 0,05 bis 0,005% in dem normalen Repertoire Analysen von Antikörper-sezernierenden Zellvorläuferfrequenz limitierende Verdünnung haben vorgeschlagen, dass B-Zellen reaktive typischerweise auf ein bestimmtes Antigen auftreten, je nach der Impfung Status und Größe / Anzahl der Epitope auf dem Antigen vorhanden. Die geringe Häufigkeit dieser Zellen hat es schwierig gemacht, Veränderungen in ihren Status während der Entwicklung von Immunantworten zu untersuchen, beispielsweise nach der Impfung oder der Exposition gegenüber einem fremden Antigen oder während der Entwicklung der Autoimmunität. Früher haben Forscher Isolierung von Antigen-reaktiven B - Zellen im Bereich von Adsorbentien Antigen beschichteten Platten oder Säule unter Verwendung von Techniken durchgeführt, um Antigen-beschichteten Rücksetzen der roten Blutkörperchen, um fluoreszenzaktivierte Zellsortierung 1, 2, 3, 4, 5, 6. though Diese Techniken wurden erfolgreich bei der Identifizierung und Isolierung von Antigen-reaktiven B-Zellen, wurden die Ergebnisse hinsichtlich der Ausbeute, Reinheit und Skalierbarkeit variiert. Kürzlich haben wir ein neues Verfahren, um sowohl zu erkennen und seltenen B-Lymphozyten-Subpopulationen mittels magnetischer Nanopartikel anreichern. Das Verfahren ermöglicht mit relativ hoher Ausbeute und Reinheit aus großen Populationen Ausgangs Anreicherung und ist mit der Analyse von Antworten auf Antigen-kompatibel. Durch die Anreicherung von Populationen von Zellen in Suspension, beseitigt das Verfahren Einschränkungen, die mit der Geometrie von Antigen-beschichteten Platten oder Säulen und Grenzdurchsatz verbunden sind. Da schließlich angereicherten Zellen mit Antigen und einem fluoreszierenden Reporter verbunden bleiben, können sie weiter durch FACS-Sortierung gereinigt werden. Wie hierin beschrieben, haben wir diesen Ansatz für die Untersuchung von peripheren Blut-Tetanustoxoid-reaktiven B-Zellen vor und nach der Immunisierung von menschlichen Subjekten, sowie Autoantigen-reaktiven B-Zellen von Patienten mit verschiedenen autoi verwendetmmune Störungen, einschließlich Typ - 1 - Diabetes, Morbus Basedow und Hashimoto-Krankheit 7. Das Verfahren arbeitet gleichermaßen gut in Maus und Mensch, und ist kompatibel mit der Analyse von Antigen-reaktiven B-Zellen aus einer Vielzahl von Geweben (Manuskript in Vorbereitung).
In ihrem Grundformat, peripheren mononukleären Blutzellen zuerst mit biotinyliertem Antigen mit Antikörpern inkubiert Oberflächenantigene für die phänotypische Analyse erforderlich zu Zelle. Dieser Markierungsschritt wird durch Waschen und Fixierung , gefolgt, und die Zugabe von zu fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff zum Nachweis des biotinylierten Antigen gekoppeltem Streptavidin bindenden Zellen (Abbildung 1). Frühere Studien haben antigenspezifischen B - Zellen in ähnlicher Weise identifiziert , aber unter Verwendung von Antigenen direkt konjugiert an ein Fluorochrom 8, 9, 10, 11. Obwohl dies ein würdigerAnsatz, die Verwendung von biotinylierten Antigenen in Verbindung mit Streptavidin ermöglicht eine größere Signalverstärkung ( und somit eine bessere Differenzierung von bindenden und nicht-bindenden Zellen), insbesondere , wenn Antigene sind kleiner 12, 13, 14. Eine weitere Überlegung ist die Verwendung von anstelle von Avidin Streptavidin da Streptavidin deglycosyliert wird, abnehmend unspezifische Bindung. Des weiteren verwenden wir Quantenausbeute (Helligkeit), und die geringe Größe (~ 1,3 kD) fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff als Fluorochrom aufgrund ihrer Photostabilität. Protein Fluorochrome wie Phycoerythrin (~ 250 kD) und Allophycocyanin (~ 105 kD) 15 sind nicht optimal , weil sie möglicherweise viele antigene Epitope enthalten. Die Verwendung eines kleinen organischen Fluoreszenzfarbstoff aus einem einzigen Epitop zusammengesetzt, wie weit Rot-Fluoreszenzfarbstoff, verringert die Komplexität der isolierten Zellpopulation.
Sobald Zellen biotinyliert-antigen und fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Streptavidin adsorbiert, werden sie angereichert mit Anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte magnetische Nanopartikel. Single - Nanopartikel werden von den meisten Durchflusszytometer detektiert und daher nicht vor der Reinigung durch FACS entfernt werden müssen Sortier- und Downstream - Assays 16. Magnetauswahl für antigen-spezifische B Zellen bereichert die Population von Interesse, wodurch die Zeit und Kosten für seltene Ereignisse Sortier eines Durchflusszytometers verwenden.
Im Folgenden zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus der Anreicherung von Tetanus-Toxoid-spezifischen B-Zellen aus einem Subjekt vor und sieben Tage nach der Booster-Immunisierung Tetanustoxoid. Wir haben uns für diese spezielle Anwendung als Beispiel , um die Fähigkeit dieser Methode zu demonstrieren , Antigen-spezifische B - Zellen nach einer akuten in vivo Stimulation zu bereichern. Wenn Cytometrie mit Strömungs gekoppelt ist dieses Verfahren anreichern können und differenzierantigenspezifischen naiven, Speicher undPlasmablasten B-Zellen und ermöglicht es dem Forscher Änderungen in ihrer Frequenz über die Zeit zu verfolgen. Zusätzlich umfassen wir eine weitere mögliche Downstream - Assay, beispielsweise einem ELISPOT - Assay, was zeigt , dass die Zellen die Fähigkeit zur Sekretion von Antikörper folgenden Anreicherungs beibehalten. Eine weitere Anwendung dieses Verfahrens könnte beinhalten adoptiven Transfer von angereicherten Zellen in einen Wirt. Wir haben zuvor gezeigt Zellen aufrechtzuerhalten, die Fähigkeit als Antigen zu wirken Zellen zu Antigen-spezifischen T-Zellen nach der Isolierung und Übertragung präsentiert (Daten nicht gezeigt). Daher gibt es eine Anzahl von möglichen stromabwärts Assays, die mit dem Verfahren verbunden werden könnten, die zusammen das Verständnis der antigenspezifischen Immunantwort informiert. Wir haben das nachfolgend beschriebene Verfahren, einschließlich der Kontrollen Gesamtausbeute, Reinheit, Zellspezifität zu bestimmen und zerlegbare Bereicherung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolierung von humanen PBMCs
- Sammeln Sie 30 bis 50 ml Blut mit heparinisierten Blutentnahmeröhrchen.
HINWEIS: Die Menge Blut verwendet wird, hängt von der speziellen Versuchs Frage und Frequenz in Blut von antigenspezifischen B-Zellen von Interesse. Heparinisiertem Blut kann sofort weiterverarbeitet werden oder geschaukelt bei Raumtemperatur über Nacht leicht am nächsten Tag für die Verarbeitung. Die Verzögerung bei der Verarbeitung hat eine sehr geringe Wirkung auf die Effizienz der Anreicherung und mit minimalem Verlust der Lebensfähigkeit verbunden. - Mischungsvollblut 1: 1 mit sterilem, Raumtemperatur Magnesium und Calcium freie Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
- In einem 50 ml sterilen konischen Röhrchen, 10 ml Dichtegradientenlösung Raumtemperatur. Speichern der geöffneten Dichtegradienten Flaschen im Dunkeln bei 4 ° C, aber auf Raumtemperatur erwärmt vor dem Gebrauch.
- Wenn möglich, stellen Sie die Pipettenpistole auf die langsame Einstellung und / oder gelten nur sehr wenig, aber konsequent, Druck Trigger langsam30-35 ml des verdünnten Blutes auf der Oberseite des Dichtegradienten Schicht, darauf achten, daß die beiden zu mischen.
HINWEIS: Wenn sich die Spitze der Pipette gegen die Kante der konischen 50 ml, während das verdünnte Blut Zugabe wird eine konsistente stetigen Strom sicherzustellen. - Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei 20 ° C mit der Bremse ausgeschaltet.
- Entfernen Sie die obere Schicht, die Plasma und Blutplättchen enthält, darauf achten, daß die Schicht aus einkernigen Zellen unter nicht zu stören.
- Mit einer sterilen Pipette, sammeln die mononukleäre Zellschicht (Buffy-Coat) und in einen separaten sterilen 50 ml konischen Röhrchen.
- Hinzufügen PBS zu der Zellsuspension auf ein Volumen von 50 ml. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 20 ° C mit Bremse.
- Überstand entfernen und resuspendieren pelletierten Zellen in 10 ml PBS. Zählen von Zellen und bestimmen die Lebensfähigkeit einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler verwendet wird.
- Die Zellen bei 10 7 Zellen / ml und auf Eis bis zur Weiterverarbeitung bereit.
2. Färbung von Zellen
- Entfernen Sie 1-2 x 10 6 Zellen für jede Fluoreszenzkompensation / FMO Steuerung benötigt, falls zutreffend. Zentrifuge Rest der Zellen bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C mit Bremse.
- Die Zellen in steril filtriert, kaltem FACS - Puffer (PBS + 1% Rinderserumalbumin (BSA) + 0,01% Natriumazid) bei 3-6 x 10 7 Zellen / ml (Entfernen in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen). Stellen Sie sicher, dass der FACS-Puffer ist kalt und halten sie auf dem Eis in der gesamten Färbeverfahren.
- Teilen Sie die Zellpopulation in Quarten (AD), wenn der Test zu optimieren. Verwenden Fraktion A antigen-spezifische B Zellen von Interesse, die Verwendung Fraktionen B und C zu bestimmen, um die Spezifität der Anreicherung / Färbung (siehe 2.5 und 2.6 unten), und die Verwendung Fraktion D zu bestimmen, um die Frequenz und die Anzahl der Antigen-spezifischen Zellen zu bereichern in die unenriched Bevölkerung Berechnung der Ausbeute zu ermöglichen und fold Bereicherung.
- Human FcyR blockiert reAgenten Fraktionen AD auf Eis Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren zu verhindern.
Hinweis: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für geeignete Bedingungen. - In fluorochromkonjugierten Antikörper gegen Oberflächenantigene von Interesse Fraktionen AD für 30 Minuten auf Eis in der dunklen Zelle, man aufpassen, nicht zu schließen Fluorochrome, die mit den anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Antikörper gekoppelt an magnetische Nanopartikel reagieren überqueren können.
HINWEIS: Diese umfassen Antikörper-Konjugate zu nahen IR-Fluoreszenzfarbstoff, Cy5, Cy5.5 und Cy7. Jegliche Lebensfähigkeit Flecken, die hinzugefügt werden, sollten mit der Verwendung eines Fixiermittels kompatibel sein. Wenn man die Zellen nicht beabsichtigen Verwendung von FACS, zu analysieren, sondern die Antikörper-sezernierenden Frequenz, beispielsweise durch ELISPOT, Oberflächenfärbung mit Antikörpern ist unnötig festzustellen. - Um zu testen, um die Spezifität des Assays, Fraktion B mit einer ausreichenden Menge an unmarkiertem Antigen für 30 min auf Eis inkubiert, so dass die Mehrheit der Rezeptoren mit einer Affinität von zumindest10 -6 M blockiert.
HINWEIS: In der Regel eine gute Ausgangskonzentration ist ein 50-100 - fachen Überschuß der Menge an Antigen ausreichend angesehen in 2,6 unterhalb (zB 50-100 uM). Dies sollte keine B-Zellen mit hoher Affinität Block für das unmarkierte Antigen an das biotinylierte Antigen zu binden, das 2.6 unten in Schritt hinzugefügt wird, wodurch eine Bestätigung der Spezifität der angereicherten Zellen ermöglicht. Dieser Schritt kann in Verbindung mit Schritt 2.4 oben abgeschlossen werden. - Hinzufügen biotinyliertem Antigen Fraktionen A, B und D. Inkubieren auf Eis für 30 min.
HINWEIS: Die Konzentration des biotinylierten Antigens sollte die optimale Menge an Bindungs Zellen aus unspezifischen Bystander-Zellen für eine ausreichende Erkennung und Trennung erforderlich, um festzustellen, titriert werden. Typischerweise zum Test eine gute Ausgangskonzentration ist 1-5 um.
HINWEIS: Die Fraktionen A und D, kann dieser Schritt gleichzeitig mit Schritt 2.4 oben erfolgen. Für Fraktion B, sollte dieser Schritt nach dem Schritt 2.5 (Waschen in betw erfolgeneen Schritte ist nicht erforderlich). - Wegzulassen biotinyliertem Antigen aus Fraktion C, um jegliche Bindung von B-Zellen gegenüber anderen Reagenzien in dem Protokoll, wie Streptavidin- fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff und die magnetischen Kügelchen zu bestimmen.
- Wasche die Zellen zweimal durch Suspendieren der Zellen in 1 ml kaltem FACS - Puffer pro 5 x 10 7 Zellen und Zentrifugation bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Nach dem letzten Waschen verdünnen pro 5 x 10 7 Zellen in 1 ml 2% Formaldehyd konzentrierten Zellsuspension und lassen für 5 min in der Dunkelheit auf Eis setzen.
HINWEIS: Die Fixierung der Zellen an diesem Punkt stellt sicher, dass das biotinylierte Antigen mit dem BCR für das verbleibende des Verfahrens gebunden bleibt. Für lebende Zellen - für Downstream-Analyse, wie in Elispots oder Adoptiv Transfers, lassen Sie den Fixierungsschritt. - Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem FACS - Puffer pro 5 x 10 7 Zellen und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren in 1 ml Puffer kalt FACS pro 5 x 107 - Zellen.
- In 1-2 ug Streptavidin-weit-rot-fluoreszierenden Farbstoff / ml und Inkubation auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Daraufhin wird die Menge für jede Anwendung von Streptavidin.
- Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem FACS - Puffer pro 5 x 10 7 Zellen und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Fraktion D Präparat wird an dieser Stelle beendet, da es die Anreicherung nicht unterzogen werden, die magnetischen Kügelchen verwendet wird.
Hinweis: Dieses Beispiel wird verwendet, um die Frequenz und die Anzahl von Antigen-spezifischen B-Zellen in der Probe zu bestimmen. Dies wird verwendet, um die Ausbeute zu bestimmen und Fold Anreicherung durch Anreicherung erreicht.
3. Magnetische Nanopartikel-basierte Anreicherung
- Die Zellen aus Proben AC in 1 ml kaltem Trennpuffer (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) pro 5 x 10 7 Zellen und durch ein 40 um - Filter jegliche Klumpen zu beseitigen , die die Säule verstopfen könnte.
- In Anti-Cy5 / Anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Nanopartikel. for optimale Ergebnisse sollte die Konzentration von Nanopartikeln für jede Verwendung titriert werden, aber ein guter Ausgangspunkt ist 50 & mgr; l Suspension pro 5 x 10 7 Zellen / ml. Drehen im Dunkeln bei 4 ° C für 10 min.
- Wasche zweimal mit 1 ml kaltem Trennpuffer bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Zellen in 1 ml kaltem Trennpuffer pro 5 x 10 7 Zellen.
4. Magnetische Anreicherung LS oder LD von Spalten mithilfe von
- Platzieren Sie drei LS oder LD Spalten im Magnetfeld eines Magnetscheider und 3 ml Trennpuffer die Spalten zu benetzen (siehe Produktbeschreibung, um zu bestimmen, welche Art von Säule ist am besten geeignet). Lassen Sie alle 3 ml durch die Säule passieren und nach der Entnahme zu verwerfen.
Hinweis: Obwohl Trennung von magnetischen Nanopartikeln markierten Zellen erreicht werden kann, eine der magnetischen Trennvorrichtungen verwenden, die im Handel erhältlich sind, hat das Labor den meisten Erfolg mit der Verwendung von LS Säulen hatten, in terms Ausbeute, Reinheit und Effizienz der Anreicherung. - Platzieren drei 15 ml konische Röhrchen mit "Fraktion A / (B) / (C) negativ", für Zellen negativ selektierten, unter der Spalte. Hinzufügen das magnetische Teilchen markierten Zellen an ihre jeweiligen Spalten- und damit das gesamte Volumen durch.
- In 3 ml kaltem Trennpuffer auf und lassen diese durch die Säule passieren und wiederholen Sie mit 2 ml. Sammeln Sie die negativ selektierten Zellen und beiseite stellen auf dem Eis.
- Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie auf einem 15 ml konischen Röhrchen mit "Fraktion A / (B) / (C) positiv", für positiv markierten Zellen.
- Füllen Sie die Spalte an die Spitze mit etwa 6 ml Trennpuffer und sofort stürzen dieses Volumen durch die Säule Zellen zu sammeln, die auf das Magnetfeld mit dem mitgelieferten Kolben gebunden hatte.
- Um Reinheit zu erhöhen, können die positiv markierten Zellen weiterhin eine zweite saubere Säule angereichert werden unter Verwendung der proce Wiederholungdure.
- Spin sowohl die negativ und positiv ausgewählten Fraktionen bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C und suspendieren in gewünschte Endvolumen. Fahren Sie mit dem Downstream-Analyse, wie FACS, ELISPOT oder Adoptivtransfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Analyse der Reinheit, Ausbeute und Fold-Anreicherung unter Verwendung von Durchflusszytometrie
Populationen angereichert, wie oben beschrieben zwangsläufig kontaminierenden Zellen enthalten, die nicht Streptavidin- fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff gebunden haben, sind aber in der Matrix gefangen. Diese Verunreinigungen können aus angereicherter Populationen durch FACS-Sortierung entfernt werden. Zur Abschätzung Reinheit der angereicherten Populationen, Tor auf lebenden Zellen auf Basis von Vorwärts- und Seitenstreuung und / oder Live / Dead-Fleck und analysieren fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Zellfrequenz. Der Prozentsatz innerhalb dieser letzteren Tor ist von Reinheit indikativ. Eine weitere Analyse der Spezifität und die Antigenaffinität dieser Zellen erfordert FACS-Sortierung von einzelnen Zellen, gefolgt von Klonierung und Sequenzierung der exprimierten Immunoglobulin-Gene und rekombinanten Antikörperherstellung und -analyse.
Ausbeute bezieht sich auf die Anzahl der isolierten antigen-Bindung B in Fraktion gewonnen Zellen A relativ zu der Anzahl in der Ausgangspopulation (Fraktion D). Da die gleiche Anzahl von Zellen in der Fraktion D als Fraktion A waren, kann man die Ausbeute (# of antigen-bindende B-Zellen in Fraktion A ÷ Anzahl der Antigen-bindende B-Zellen in der Fraktion D) bestimmen.
Fold-Anreicherung (E) wird durch den Prozentsatz der fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff + B-Zellen in der "positiv" angereicherte Fraktion A relativ zu der in der Fraktion D. Dieser Wert gibt die proportionale Erhöhung der Antigen-spezifischen B-Zellen erreicht reflektiert durch Nanopartikel-Anreicherung. Der Wert kann mit der folgenden Gleichung gefunden werden:
Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir repräsentative Ergebnisse erhalten mit Tetanus-Toxoid (Tet-Tox) als ModellAntigen zu erkennen und für Tet-Tox-reaktiven B-Zellen im peripheren Blut der Patienten anreichern, die gegen Tetanus zu unterschiedlichen Zeitpunkten geimpft wurden. Figur 1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens und der Antigen - Adsorbens. 2a zeigt die Häufigkeit der Tet-Tox-reaktiven B - Zellen von einer Person , die gegen Tetanus geimpft letzte war mehr als vor einem Jahrzehnt. Dargestellt sind die angereicherte ( "positiv") und abgereichertes ( "negativ") Populationen aus Fraktion A und der Basisfrequenz des Tet-Tox-spezifischen B-Zellen aus Fraktion D. Daher wird in diesem Beispiel können wir Bindungs Zellen anzureichern um rund 7-fach und erreichte eine Reinheit von 4% in der angereicherten Fraktion.
Figur 2b zeigt die Spezifität der Reaktion unter Verwendung von Blut von einem Patienten, der ca. 3 Jahre zuvor geimpft worden waren. Wenn wir zugegeben, um einen 50-fachen Überschusses (50 & mgr; M) von unmarkiertem Tetanus-Toxoid zu den Zellen vor additIon des biotinylierten Antigen (Fraktion B) sind wir in der Lage, um 83% Bindung zu blockieren, die Bindung die Spezifität des Antigens zu demonstrieren. Wenn wir biotinyliertem Antigen aus dem Verfahren (Fraktion C), eine kleine Anzahl (~ 0,2%) von B-Zellen gebunden noch weggelassen sind; vermutlich dieser kleine Anteil von B-Zellen widerspiegelt, um einige nicht-Antigen in dem Adsorbens, beispielsweise Streptavidin-far-rot-fluoreszierenden Farbstoffbindung, die anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Antikörper oder die magnetischen Kügelchen.
Um die Verwendung des Verfahrens zu analysieren , Änderungen in Antigen-bindenden Zell - Phänotyp nach der Immunisierung zeigen wir in Abbildung 3 die Häufigkeit der Tet-Tox-spezifische B - Zellen in der naiven, Gedächtnis und Plasmablastenpopulationen in Blut entnommen vor und 7 Tage nach der Booster demonstrieren Impfung eines gesunden Probanden. Während der Anteil von naiven B-Zellen unter insgesamt Tet-Tox-bindende B-Zellen verringerte sich von 84% auf 64% nach der Auffrischung der Anteil der memory und Plasmablasten Populationen unter Gesamt Tet Tox-reaktiven Zellen von 16% auf 36% und 0% bis 40% erhöht, respectively. 3b zeigt repräsentative ELISPOT Daten aus dem peripheren Blut aus der 7 Tage nach Boost gesunden Probanden. Die Isolierung der Tet-Tox-bindenden B-Zellen führte zu 4-fache Anreicherung in Antikörper Tetanustoxoid sezer-Zell-Frequenz.
Abbildung 1: Verfahren zum Nachweis und zur Anreicherung von Tetanustoxoid (Tet Tox) -Bindung B - Zellen. (A) Protokoll zur Anreicherung und Isolierung von Tet-Tox-bindenden B - Zellen. (B) Schematische Darstellung des Adsorbens eingesetzt zu identifizieren und zu bereichern Tet-Tox-Bindung B - Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
n-page = "1"> 
Abbildung 2: Repräsentative Zytogrammen demonstrieren Anreicherung von Tet Tox-bindenden B - Zellen aus menschlichen peripheren Blut. (A) Zytogrammen von angereichertem oder abgereichertem Tet Tox-reaktiven B - Zellen aus Fraktion A und Gesamt Tet-Tox-reaktiven B - Zellen aus der Fraktion D von einem normalen Subjekt zuletzt geimpft> 10 Jahre zuvor. (B) Zytogrammen von PBMCs von den "positiven" Populationen von einem Patienten geimpft bis 3 Jahre zuvor und angereichert wie in A (Fraktion A) nach Vorinkubation mit mehr als 50 & mgr ; M unmarkiertem Tet-tox (Fraktion B) oder angereichert mit Tet-Tox-Biotin während des Verfahrens (Fraktion C) weggelassen. Alle Analysen wurden auf CD19 + Lymphozyten gated. Prozentangaben stellen die Prozent der Tet-Tox-bindenden Zellen aller B - Zellen (CD19 +) in der letzten Fraktion.ank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Beispiele für post-Anreicherung Analyse von Antigen-bindenden Zellen. (A) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Zell - Phänotyp folgende Anreicherung von Tet-Tox-bindenden B - Zellen. Zytogrammen zeigen Identifizierung und Analyse von Tet-Tox-reaktiven naiven (CD27 -), Speicher (CD27 +) und Plasmablasten (CD27 ++ CD38 ++) in B - Zell - Subpopulationen eines Subjekts vor und 7 Tage nach der Booster - Impfung gegen Tetanus. Alle Zellen wurden gated auf CD19 + Lymphozyten aus den angereicherten "positiv" Populationen. (B) Repräsentative ELISPOT Analyse von Antikörper - Zellen angereichert, aufgebraucht, und insgesamt nicht ausgestalteten B - Zell - Fraktionen aus dem peripheren Blut eines gesunden Probanden 7 Tage nach bo sezerost. Für den ELISPOT-Assay Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden zuerst mit einer 10 & mgr; g / ml Lösung von Tetanus-Toxoid beschichtet. Zweifache serielle Verdünnungen von Zellsuspensionen wurden in Vertiefungen (über die Platte), beginnend mit Zellen bei gleicher Konzentration der angereicherten, aufgebraucht, und die Gesamt unenriched Fraktionen hergestellt. Anti-Tetanus-Antikörper-sezernierenden Zellen wurden mit biotinyliertem anti-Human-IgG (H & L) detektiert, gefolgt von Streptavidin-AP. Die Platte wurde mit ELISPOT Entwicklungspuffer entwickelt , und die Reaktion wurde gestoppt wurde , wurde durch Waschen der Platte dreimal mit bidestilliertem H 2 O. Die Anzahl von Punkten bei einer Zellverdünnung im linearen Bereich bestimmt, und die Anzahl von ASCs berechnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir eine neuartige Methode Isolierung und Anreicherung von Antigen-bindenden B-Zellen aus menschlichen peripheren Blut zu erreichen. Das Verfahren ist ohne weiteres auf Mäuse und zu anderen Geweben, wie die Milz und Lymphknoten, und ist kompatibel mit Nachanreicherung Analyse der Zell-Phänotyp und die Funktion (Manuskript in Vorbereitung).
Der Benutzer sollte in einer Anzahl von Variablen sein, die cognizant Erfolg dieses Verfahrens beeinflussen kann. Aus Erfahrung neigen toten Zellen an die magnetischen Kügelchen zu bleiben und "nehmen" Fluoreszenzfarbstoffe, wie die Streptavidin-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff, unspezifischer erhöhten Hintergrund führt. Es ist entscheidend, wie viele tote Zellen aus Proben wie möglich zu entfernen, bevor mit diesem Verfahren beginnen. Die Verwendung von Flecken, die Live / Dead Diskriminierung Tor aus toten Zellen aus der Analyse ermöglichen kann hilfreich sein, aber Vorhandensein von toten Zellen beeinträchtigen Interpretation von Assays von Antikörper sezernierenden Zellfrequenz undFunktion nach adoptiven Transfer.
Darüber hinaus haben wir, dass eine sorgfältige Titration des biotinylierten Antigens gefunden hinzugefügt Unterscheiden antigen-spezifische und nicht-spezifische Bindung essentiell ist. Die Verwendung von zu wenig Antigen wird zu einer Unterschätzung der Häufigkeit von Antigen-bindenden Zellen führen, während zu viel Antigen falsch positive Erkennung / Anreicherung führen kann. Verwendung von Antigenkonzentrationen, die zu hoch sind, können durch Mai scheinbare Bindung an non-B-Zellen in den Proben angegeben. Ferner scheinbare Detektion einer zu hohen Frequenz (> 1%) an Antigen reaktiven Zellen kann ein Hinweis auf Bindungsspezifität Problem sein. Das ultimative Ziel , wenn die optimale Menge an Antigen - Bestimmung zu verwenden , ist ein wenig mehr Antigen hinzuzufügen , als bei physiologischen Konzentrationen vorhanden ist, so dass die Mehrheit der B - Zell - Rezeptoren mit einer Affinität von <10 -6 M, beispielsweise für das Antigen gesättigt sind. Dies stellt sicher, dass Antigen-spezifische B-Zellen bEing mit einer Affinität erkannt, dass pathogene Potential hat. Die Zugabe von zu wenig Antigen, dh bei oder unter physiologischen Konzentrationen kann auf die Detektion von sehr wenigen antigenspezifischen B - Zellen führen aufgrund von Antigen Besetzung der BCR verringert. Auf der anderen Seite, die Zugabe von zu viel Antigen kann weit über physiologischen Konzentrationen führen unspezifische Bindung zu einer erhöhten , die B - Zellen mit geringer Affinität für das Antigen (> 10 -6 M) und sind eigentlich nichts von der Antigen einschließt in vivo. Daher ist es wichtig, zuerst das biotinylierte Antigen über ein paar logs, um sicher zu sein, dass nur titrieren wahre antigen-reaktiven B-Zellen nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise haben wir, dass die Verwendung von zu viel Streptavidin-weit-rot-fluoreszierende Farbstoff kann erhöhen Hintergrund gefunden.
Es ist auch wichtig, dass die Biotinylierung von Antigen zu beachten Verfügbarkeit von antigenen Epitopen beeinflussen können. Daher Optimierung verschiedener Biotinylierung unter Verwendung erfülltHods kann wichtig sein. Alternativ kann Biotin an primären Aminen gekoppelt sein, tertiäre Amine, Sulfhydrylgruppen oder Carboxylgruppen. Die Verwendung von erweiterten Spacer Armlängen können Epitop Verfügbarkeit verbessern durch sterische Hinderung zu reduzieren.
Eine der Einschränkungen dieser Technik ist ihre verringerte Wirksamkeit zur Anreicherung von Antigen-bindende B-Zellen aus kryokonservierten Vergleich zu frischen Zellen. Dies könnte zu einer größeren Zelltod beziehen und die damit verbundenen "Klebrigkeit" in gefrorenen Proben. Dennoch kann das Verfahren auf gefrorenen Proben angewendet werden, aber es ist wahrscheinlich wichtig, nicht direkt Ergebnisse aus der Anreicherung und Analyse von frischen und gefrorenen Zellen zu vergleichen. Eine weitere Einschränkung ist die Reinheit von antigenspezifischen B-Zellen in der angereicherten Probe. Aus Erfahrung gibt es immer einige Zellen, die "Tag-along", die beide nicht-spezifische B-Zellen und T-Zellen enthält. Dies ist zu erwarten, die Seltenheit der Zellpopulation gegeben werden, auf zu bereichern versucht. Jedoch ist die Reinheit von ter Zellen können Anstieg sein, indem sichergestellt wird, dass eine Einzelzellsuspension vor der Zugabe der Zellen zu der Säule erhalten wird, ein zweites Mal auf einer neuen Spalte Anreichern oder durch FACS die antigen-spezifische B-Zellen zu sortieren. Je nach Art der Studie, kann der Forscher entscheiden, welche Option am besten ist und ob es notwendig ist.
Als wir diese Technik optimiert vorgesehen wir, dass es zu einer Diskriminierung von hoher Affinität gegenüber niedriger Affinität Antigen-reaktiven Zellen basierend auf Antigen-Titration oder Färbeintensität zugänglich wäre. Jedoch in einer früheren Studie haben wir gezeigt , antigen-reaktiven B - Zellen mit bis zu 1000-facher Unterschied in der Affinität zu ihrem Antigen gleichmäßig angereichert wurden mit dieser Methode 7. Daher wird formal Messung der Affinität von angereicherten Zellen unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz-Analyse des exprimierten rekombinanten Antigenrezeptoren erforderlich, wenn Kenntnis der Affinität der Studie relevant ist.
Inherent in dieser Technik ist die lNachahmung, dass die Zugabe des biotinylierten Antigens und Streptavidin, die Zellen durch Vernetzung des BCR aktivieren kann. Dies könnte ein Problem für bestimmte nachgeschaltete funktionelle Assays, wie jene darstellen, die stimulierten Zellen in einen Ruhesteuerung vergleichen versuchen zu. Dieses Problem kann durch Halten Kontrollproben kalt zu verhindern Transduktion der Signale abgeschwächt werden. Es ist auch möglich, dass BCR-Signale eine laufende biologische Antwort beeinflussen könnten. Aus Erfahrung antigen-angereicherten Zellen behalten ihre Fähigkeit , Antikörper zu sezernieren, wie durch ELISPOT - Analyse (Abbildung 3b) und die Funktion als Antigen - präsentierende Zellen angegeben Zellen in vitro und nach dem adoptiven Transfer in Mäuse zu T (Daten nicht gezeigt). Eine letzte Einschränkung dieser Technik ist die Verwendung von Anti-Antikörpern fluorochome Nanopartikel zu erreichen, um Antigen adsorbiert Zellen binden. Anti- fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff kreuzreagiert mit bestimmten strukturell verwandten Fluorochrome, einschließlich Cy7 und Cy5.5. Dies kann die Optionen begrenzen of Antikörper verfügbar Konjugate zur Messung von phänotypischen Markern. Jedoch mit einer erhöhten Verfügbarkeit neuer Fluorochrome, dies ist immer weniger ein Problem.
Unter Verwendung dieser Detektions- und Anreicherungsverfahren ist es möglich , das Antigen-bindende B - Zellen in ex vivo peripherem Blut, Milz oder anderen Geweben leicht zu identifizieren. Dieses Verfahren ist besonders nützlich bei der Immunreaktion von Antigen reaktiven Zellen nach Immunisierung oder Exposition gegenüber fremden Antigenen und bei der Festlegung der Autoimmunerkrankung zu studieren. Obwohl kein Verfahren antigen-reaktiven B-Zellen zu erkennen ist, ohne ihre Fehler erwiesen ist dieses Verfahren einfach, schnell und erzeugt eine relativ hohe Reinheit, Ausbeute und Anreicherung von antigen-reaktiven Zellen, die an eine Vielzahl von stromabwärts angekoppelt werden kann Assays. Darüber hinaus aufgrund der grundlegenden Prinzipien des Verfahrens, könnte dieses Verfahren leicht auf eine Vielzahl von experimentellen Bedürfnisse zugeschnitten werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
