Summary
En enkel men effektiv metod som utnyttjar magnetiska nanopartiklar för att detektera och berika antigenreaktiva B-celler för funktionell och fenotypisk analys beskrivs.
Introduction
Begränsande utspädning analyser av antikropp-avsöndrande cell prekursor frekvens har föreslagit att B-celler reaktiva mot ett speciellt antigen uppträder typiskt vid en frekvens av 0,05 till 0,005% i det normala repertoaren, beroende på vaccinationsstatus och storlek / antal epitoper närvarande på antigenet. Den låga frekvensen av dessa celler har gjort det svårt att studera förändringar i deras status under utvecklingen av immunsvar, såsom efter vaccination eller exponering för en främmande antigen, eller under utveckling av autoimmunitet. Tidigare har forskare genomfört isolering av antigenreaktiva B-celler med användning av tekniker som sträcker sig från antigenbelagda plattor eller kolumn adsorbenter, till antigenbelagda röda blodkroppar återställning, till fluorescens-aktiverad cellsortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though dessa tekniker har varit framgångsrika i att identifiera och isolera antigenreaktiva B-celler, har resultaten varierat i termer av utbyte, renhet och skalbarhet. Nyligen har vi utvecklat en ny metod för att både upptäcka och berika sällsynta B lymfocytsubpopulationer hjälp av magnetiska nanopartiklar. Metoden möjliggör berikning med relativt högt utbyte och renhet från stora startpopulationer, och är kompatibel med analys av svar på antigen. Genom att berika från populationer av celler i suspension, eliminerar metoden begränsningar som är förknippade med geometrin hos antigenbelagda plattor eller kolumner, och begränsa genomströmning. Slutligen, eftersom anrikade celler förblir associerade med antigen och en fluorescerande reporter, kan de renas ytterligare genom FACS-sortering. Såsom beskrivs häri har vi använt denna metod för undersökning av perifert blod tetanus toxoid-reaktiva B-celler före och efter immunisering av mänskliga försökspersoner, samt autoantigenreaktiva B-celler från patienter med olika autoimmune störningar, inkluderande typ 1-diabetes, Graves sjukdom, och Hashimotos sjukdom 7. Förfarandet fungerar lika bra i mus och människa, och är kompatibel med analys av antigenreaktiva B-celler från en mängd olika vävnader (manuskript under utarbetande).
I sin grundläggande form, är perifera mononukleära blodkroppar först inkuberas med biotinylerat antigen tillsammans med antikroppar mot cell ytantigener som krävs för fenotypisk analys. Denna märkning steg följs av tvättning och fixering, och tillsats av streptavidin kopplat till långt-röd-fluorescerande färgämne för påvisande av det biotinylerade-antigenbindande celler (figur 1). Tidigare studier har identifierat antigenspecifika B-celler på ett liknande sätt men med användning av antigener direkt konjugerad till en fluorokrom 8, 9, 10, 11. Även om detta är en värdigtillvägagångssätt, användning av biotinylerade antigener i samband med streptavidin möjliggör större signalförstärkning (följaktligen bättre differentiering av bindande och icke-bindande celler), i synnerhet när antigener är små 12, 13, 14. En ytterligare faktor är användningen av streptavidin istället för avidin eftersom streptavidin deglykosylerad, minskar icke-specifik bindning. Vidare använder vi långt röda fluorescerande färgämne som fluorokromen på grund av dess foto, kvantutbyte (ljusstyrka) och dess ringa storlek (~ 1,3 kD). Protein fluorokromer såsom fykoerytrin (~ 250 kD) och allofykocyanin (~ 105 kD) 15 är inte optimalt eftersom de potentiellt innehåller många antigenepitoper. Användningen av en liten organisk fluorescerande färgämne sammansatt av en enda epitop, såsom långt-röd-fluorescerande färgämne, reducerar komplexiteten hos den isolerade cellpopulationen.
När celler är biotinylerade-antigen och långt röd-fluorescerande färgämne-streptavidin adsorberat, de berikade med användning av anti-far-röd-fluorescerande färgämne-konjugerad magnetiska nanopartiklar. Enstaka nanopartiklar inte upptäcks av de flesta flödescytometrar och därför inte behöver avlägsnas före rening genom FACS sortering och efterföljande analyser 16. Magnetisk selektion för antigen-specifika B-celler berikar den intressanta populationen, vilket eliminerar den tid och kostnad för sortering sällsynta händelser med användning av en flödescytometer.
Nedan visar representativa resultat från anrikning av tetanus-toxoid-specifika B-celler från en patient före och sju dagar efter tetanustoxoid booster-immunisering. Vi valde detta speciella tillämpning som ett exempel för att demonstrera förmågan hos denna metod för att berika antigenspecifika B-celler efter akut in vivo stimulering. När den kombineras med flödescytometri, är denna metod kan berikande och differentierande antigenspecifik naiv, minne, ochplasmablast B-celler och gör det möjligt för forskaren att följa förändringar i deras frekvens över tiden. Dessutom inkluderar vi en annan möjlig nedströms analys, t ex en ELISPOT-analys, som visar att celler bibehåller förmågan att utsöndra antikropp efter anrikning. En annan tillämpning av denna metod kan innebära adoptiv överföring av anrikade celler i en värd. Vi har tidigare visat celler bibehåller förmågan att verka som antigenpresenterande celler för antigenspecifika T-celler efter isolering och överföring (data visas ej). Därför finns det ett antal möjliga nedströms analyser som skulle kunna kopplas till den metod, som tillsammans informerar förståelsen av den antigenspecifika immunsvar. Vi har beskrivit den metod nedan, inklusive kontroller för att bestämma totala utbytet, renhet, cell specificitet, och vik-anrikning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av mänskliga PBMC
- Samla 30-50 ml blod med hjälp av hepariniserade blodprovsrör.
OBS: Den mängd blod som används beror på den särskilda experimentella frågan och frekvens i blod av antigenspecifika B-celler av intresse. Hepariniserat blod kan bearbetas omedelbart eller skakas försiktigt över natten vid rumstemperatur för att bearbeta följande dag. Förseningen i behandlingen har mycket liten effekt på effektiviteten av anrikningen och förknippas med minimal förlust av livsduglighet. - Blanda helblod 1: 1 med sterilt, magnesium rumstemperatur och kalcium fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- I en 50 ml steril koniska rör, tillsätt 10 ml rumstemperatur densitetsgradient lösning. Lagra de öppnade densitetsgradient flaskor i mörker vid 4 ° C, men varm till rumstemperatur före användning.
- Om det är möjligt ställa pipetten pistol mot den långsamma inställningen och / eller tillämpa mycket liten, men konsekvent, utlösa trycket långsamtskikt 30-35 ml av det utspädda blodet ovanpå densitetsgradienten, försiktigt så att inte blanda de två.
OBS: Genom att placera spetsen på pipetten mot kanten av de 50 ml koniska samtidigt lägga det utspädda blodet hjälper till att säkerställa en konsekvent jämn ström. - Centrifugera vid 400 xg under 30 min vid 20 ° C med bromsen avslagen.
- Ta bort det övre skiktet, som innehåller plasma och blodplättar, försiktigt så att inte störa det mononukleära cellskiktet nedan.
- Med hjälp av en steril pipett samla mononukleära cellskiktet (buffycoat) och placera i en separat steril 50 ml koniska rör.
- Lägg PBS till cellsuspensionen till en volym av 50 ml. Centrifugera vid 400 xg under 10 min vid 20 ° C med broms.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleterade cellerna i 10 ml PBS. Räkna celler och bestämma lönsamheten med hjälp av en hemocytometer eller automatisk cellräknare.
- Resuspendera celler vid 10 7 celler / ml och placera på is tills redo för ytterligare behandling.
2. Färgning av celler
- Ta 1-2 x 10 6 celler för varje fluorescenskompensering / FMO kontroll behövs, i förekommande fall. Centrifug återstoden av cellerna vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C med broms.
- Resuspendera cellerna i sterilfiltrerat, kall FACS-buffert (PBS + 1% bovint serumalbumin (BSA) + 0,01% natriumazid) vid 3-6 x 10 7 celler / ml (avlägsna i ett 1,5 ml centrifugrör). Säkerställa att FACS buffert är kallt och hålla den på is under hela färgningsproceduren.
- Dela upp cellpopulationen i fjärdedelar (AD) när optimera analysen. Använd fraktion A för att berika antigenspecifika B-celler av intresse, använda fraktioner B och C för att bestämma specificiteten anriknings / färgning (se 2.5 och 2.6 nedan), och användning fraktion D för att bestämma frekvensen och antalet antigenspecifika celler i den icke inredda befolkningen för att möjliggöra beräkning av avkastning och vik-anrikning.
- Lägga human FcyR blockerande reagent till fraktioner AD på is för att förhindra bindning av antikroppar mot Fc-receptorer.
OBS: Följ tillverkarens instruktioner för lämpliga förhållanden. - Lägg fluorokromkonjugerade antikroppar mot cellantigener av intresse yta till fraktioner AD under 30 minuter på is i mörker, var noga med att inte ta med fluorokromer som kan korsreagera med anti-far-röd-fluorescerande färgämne antikroppar kopplade till magnetiska nanopartiklar.
OBS: Dessa inkluderar antikroppskonjugat till nära-IR fluorescerande färgämne, Cy5, Cy5.5 och Cy7. Eventuella viabilitet fläckar som tillsätts bör vara förenliga med användningen av ett fixativ. Om en inte har för avsikt att analysera celler med användning av FACS, men bestämma antikropp-utsöndrande frekvens, till exempel, genom ELISPOT, är ytan färgning med antikroppar onödiga. - För att testa specificiteten hos analysen, inkubera Fraktion B med tillräcklig mängd av omärkt antigen under 30 min på is, så att huvuddelen av receptorerna med en affinitet av åtminstone10 -6 M är blockerade.
OBS: Vanligtvis är en bra utgångspunkt koncentration en 50-100-faldigt överskott av mängden antigen anses tillräckligt i 2.6 nedan (t.ex. 50-100 M). Detta bör blockera B-celler med hög affinitet för omärkt antigen att binda till den biotinylerade antigenet, som tillsätts i steg 2,6 nedan, vilket möjliggör bekräftelse av specificiteten av cellerna anrikade. Detta steg kan utföras i samband med steg 2,4 ovan. - Lägg biotinylerat antigen till fraktionerna A, B och D. Inkubera på is under 30 min.
OBS: Koncentration av biotinylerad antigen bör titreras för att bestämma den optimala mängden som behövs för att säkerställa tillräcklig detektering och separation av bindande celler från icke-specifika beredskaps celler. Typiskt en bra utgångspunkt koncentration att testa är 1-5 iM.
OBS: För fraktionerna A och D, detta steg kan göras samtidigt med steg 2.4 ovan. För Fraktion B, bör detta steg göras efter steg 2,5 (tvättning i between steg är onödigt). - Utelämna biotinylerad antigen från fraktion C för att bestämma någon bindning av B-celler till andra reagens i protokollet, såsom streptavidin- långt rött fluorescerande färgämne och de magnetiska pärlorna.
- Tvätta cellerna två gånger genom suspension av celler i en ml kall FACS-buffert per 5 x 10 7 celler och centrifugering vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Efter den slutliga tvätten, utspädd koncentrerad cellsuspension i 1 ml 2% formaldehyd per 5 x 10 7 celler och låt sitta i mörker på is under 5 min.
OBS: Fixering av cellerna vid denna punkt säkerställer att den biotinylerade antigenet är bundet till BCR för återstoden av förfarandet. För levande celler - för efterföljande analys, såsom i ELISPOTs eller adoptiv transfer, utelämna fixeringssteget. - Tvätta cellerna två gånger med 1 ml kall FACS-buffert per 5 x 10 7 celler och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. Resuspendera i 1 ml kall FACS-buffert per 5 x 107-celler.
- Lägg 1-2 ^ g streptavidin-far-röd-fluorescerande färgämne / ml och inkubera på is under 20 minuter i mörker. Titrera mängden streptavidin för varje applikation.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 ml kall FACS-buffert per 5 x 10 7 celler och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. Fraktion D förberedelse är klar på denna punkt eftersom det inte kommer att genomgå berikning med de magnetiska pärlorna.
OBS: Detta prov används för att bestämma frekvensen och antalet antigenspecifika B-celler i provet. Detta kommer att användas för att bestämma utbytet och vik-berikning uppnås genom anrikning.
3. Magnetisk nanopartiklar baserade Anrikning
- Resuspendera celler från prover AC i 1 ml kall buffert separation (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) per 5 x 10 7 celler och passera genom ett 40 pm filter för att eliminera eventuella klumpar som kan täppa till kolonnen.
- Lägg Anti-Cy5 / Anti-långt-röd-fluorescerande färgämne nanopartiklar. for optimala resultat, bör koncentrationen av nanopartiklar titreras för varje användning, men en bra utgångspunkt är 50 pl suspension per 5 x 10 7 celler / ml. Rotera i mörker vid 4 ° C under 10 min.
- Tvätta två gånger med 1 ml kall separationsbuffert vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 1 ml kallt separation buffert per 5 x 10 7 celler.
4. Magnet berikning med LS eller LD kolumner
- Placera tre LS eller LD kolumner i magnetfältet av en magnetisk separator och tillsätt 3 ml av separation buffert för att väta kolumner (se produktbeskrivning för att avgöra vilken typ av kolonn är bäst lämpad). Låt alla 3 ml att passera genom kolonnen och kassera efter insamling.
OBS! Även om separation av magnetiska nanopartiklar märkta celler kan åstadkommas med användning av någon en av de magnetiska separationsanordningar som är kommersiellt tillgängliga, har laboratoriet haft mest framgång med användning av LS kolonner, i terms av utbyte, renhet och effektivitet anrikning. - Placera tre 15 ml koniska rör märkta "Fraktion A / (B) / (C) negativ", för negativt utvalda celler, i kolumnen. Lägga den magnetiska partikeln märkta celler till deras respektive kolonnen och låt hela volymen för att passera igenom.
- Tillsätt 3 ml kall separation buffert på toppen, och låta detta passera genom kolonnen och upprepa med 2 ml. Samla negativt markerade cellerna och ställ åt sidan på is.
- Ta kolonnen från magnetfältet och placera ovanpå en 15 ml koniskt rör märkt "Fraktion A / (B) / (C) positiv", för att tvångsmässigt utvalda celler.
- Fyll kolonnen till toppen med ungefär 6 ml separationsbuffert och omedelbart störta denna volym genom kolonnen för att samla celler som hade bundits till det magnetiska fältet med den medföljande kolven.
- För att öka renheten, kan de positivt selekterade cellerna anrikas vidare med användning av en andra ren kolonn, att upprepa förfarande.
- Snurra både negativt och positivt utvalda fraktioner vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C och suspendera i önskade slutvolymen. Fortsätt med efterföljande analys, såsom FACS, ELISPOT eller adoptiv överföring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analys av renhet, utbyte och vik-berikning med flödescytometri
Populationer anrikade såsom beskrivits ovan oundvikligen innehålla kontaminerande celler som inte har bundit streptavidin- långt-röd-fluorescerande färgämne, men är fast i matrisen. Dessa föroreningar kan avlägsnas från anrikade populationer genom FACS-sortering. För att uppskatta renhet av anrikade populationer, grind på levande celler baserade på framåt och sidospridning och / eller Live / Dead fläcken och analysera långt röd-fluorescerande färgämne + cellfrekvens. Procentandelen inom denna sistnämnda grinden är indikativt för renhet. Ytterligare analys av specificiteten och antigen affinitet av dessa celler kräver FACS sortering av enskilda celler, följt av kloning och sekvensering av uttryckta immunoglobulingener och rekombinant antikroppsproduktion och analys.
Utbytet hänför sig till antalet av isolerad antigen-bindande B-celler som återvunnits i fraktion A i förhållande till antalet i startpopulationen (fraktion D). Eftersom samma antal celler var i Fraktion D såsom fraktion A, kan en direkt bestämma utbytet (# av antigenbindande B-celler i fraktion A ÷ # av antigenbindande B-celler i Fraktion D).
Vik-anrikning (E) reflekteras av andelen långt röda fluorescerande färgämne + B-celler i "positivt" berikat Fraktion A i förhållande till den i fraktion D. Detta värde anger den proportionella ökningen av antigenspecifika B-celler uppnås genom nanopartiklar anrikning. Värdet kan hittas med hjälp av följande ekvation:
För att demonstrera denna teknik, visar vi representativa resultat som erhållits med hjälp av tetanus-toxoid (Tet-Tox) som förebildantigen för att detektera och anrikning av Tet-Tox-reaktiva B-celler i det perifera blodet hos individer som har vaccinerats mot tetanus vid varierande tidpunkter. Figur 1 är en schematisk bild av förfarandet och det antigen adsorbenten. Figur 2a visar frekvensen av Tet-Tox-reaktiva B-celler från en individ som senast vaccinerade mot stelkramp mer än ett decennium sedan. Visas är det anrikade ( "positiv") och utarmat ( "negativ") populationer från fraktion A och baslinjen frekvensen av Tet-Tox-specifika B-celler från fraktion D. därmed i det här exemplet har vi möjlighet att berika bindande celler med cirka 7-faldig och uppnått en renhet av 4% i den anrikade fraktionen.
Figur 2b visar specificiteten för reaktionen med användning av blod från en patient som hade vaccinerats ~ 3 år tidigare. När vi lagt till en 50-faldigt överskott (50 ^ M) av omärkt tetanus-toxoid till cellerna före Additjonen av den biotinylerade antigenet (fraktion B) har vi möjlighet att blockera bindning av 83%, vilket visar specificiteten hos antigenbindning. När vi utelämnade biotinylerade antigen från förfarandet (fraktion C), ett litet antal (~ 0,2%) av B-celler fortfarande bundna; denna lilla fraktion av B-celler förmodligen återspeglar bindning till vissa icke-antigen i adsorberande, såsom streptavidin-far-röd-fluorescerande färgämne, anti-far-röd-fluorescerande färgämne antikropp eller de magnetiska pärlorna.
För att demonstrera användningen av metoden för att analysera förändringar i antigenbindande cellfenotyp efter immunisering vi visar i figur 3 frekvensen av Tet-Tox-specifika B-celler i naiva, minne och plasmablast populationer i blod dras innan och 7 dagar efter booster vaccinering av en frisk försöksperson. Medan andelen naiva B-celler bland de totala Tet-Tox-bindande B-celler minskade från 84% till 64% efter boost, den procentuella andelen av Memory och plasmablast populationer bland totalt Tet Tox-reaktiva celler ökade från 16% till 36% och 0% till 40%, respektive. Figur 3b visar representativa ELISPOT data från perifert blod från de 7 dagar efter boost friska ämne. Isolering av Tet-Tox-bindande B-celler ledde till 4-faldig anrikning i tetanustoxoid antikroppsutsöndrande-cellfrekvens.
Figur 1: Metod för detektion och anrikning av tetanustoxoid (Tet Tox) -bindande B-celler. (A) Protokoll för anrikning och isolering av Tet-Tox-bindande B-celler. (B) Diagram över adsorbent användas för att identifiera och berika Tet-Tox-bindande B-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
n-page = "1"> 
Figur 2: Representant cytogram visar anrikning av Tet Tox-bindande B-celler från humant perifert blod. (A) cytogram av anrikad och utarmade Tet Tox reaktiva B-celler från fraktion A och totalt Tet-Tox-reaktiva B-celler från Fraktion D från en normal individ sista vaccinerade> 10 år tidigare. (B) cytogram av PBMC från den "positiva" populationer från ett ämne vaccineras ~ 3 år tidigare och berikat som i A (fraktion A), efter förinkubering med över 50 iM omärkt Tet-tox (fraktion B), eller anrikad med Tet-Tox-biotin utelämnas under förfarandet (fraktion C). Alla analyser gated på CD19 + lymfocyter. Procentsatserna motsvarar den procent av Tet-Tox-bindande celler av alla B-celler (CD19 +) i den slutliga fraktionen.ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på post-anrikning analys av antigenbindande celler. (A) Representativa flödescytometrisk analys av cellfenotyp efter anrikning av Tet-Tox-bindande B-celler. Cytogram visar identifiering och analys av Tet-Tox-reaktivt naiva (CD27 -), minne (CD27 +), och plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++) i B-cells subpopulationer av ett ämne innan och 7 dagar efter boostervaccination mot stelkramp. Alla celler gated på CD19 + lymfocyter från de anrikade "positiva" populationer. (B) representant ELISPOT analys av antikroppsutsöndrande celler i anrikade, utarmat, och totala icke inredda B cellfraktioner från perifert blod från en frisk ämne 7 dagar efter boOST. För ELISPOT-analys, var brunnar i en platta med 96 brunnar beläggs först med en 10 | j, g / ml lösning av tetanus-toxoid. Tvåfaldiga serieutspädningar av cellsuspensioner gjordes i brunnar (över plattan) utgående från celler vid lika koncentration från de anrikade, utarmat och totala icke inredda fraktioner. Anti-tetanus antikroppsutsöndrande celler detekterades med biotinylerat anti-humant IgG (H & L), följt av streptavidin-AP. Plattan framkallades med ELISPOT utveckling buffert och reaktionen stoppades genom tvättning av plattan tre gånger med dubbeldestillerat H2O Antalet fläckar vid en cellspädning i det linjära området bestämdes, och antalet ASC: er beräknades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en ny metod för att åstadkomma isolering och anrikning av antigenbindande B-celler från humant perifert blod. Metoden är lätt tillämplig på möss och andra vävnader, såsom mjälten och lymfkörtlar, och är kompatibel med post-anrikning analys av cellfenotyp och funktion (manuskript under utarbetande).
Användaren bör vara medveten om ett antal variabler som kan påverka framgången av detta förfarande. Av erfarenhet döda celler tenderar att hålla sig till de magnetiska pärlorna och "ta upp" fluorescerande färgämnen, såsom streptavidin-far-röd-fluorescerande färgämne, vilket leder till icke-specifik ökad bakgrund. Det är viktigt att ta bort så många döda celler från prover som möjligt innan den här proceduren. Användning av fläckar som gör det möjligt Live / Dead diskriminering gate ut döda celler från analysen kan vara till hjälp, men förekomsten av döda celler kan äventyra tolkning av analyser av antikroppsutsöndrande cellfrekvens ochfunktion efter adoptiv överföring.
Dessutom har vi funnit att noggrann titrering av den biotinylerade antigenet tillsätts är viktigt att särskilja antigenspecifik och icke-specifik bindning. Användning av för lite antigen kommer att leda till en underskattning av frekvensen av antigenbindande celler, medan alltför mycket antigen kan förorsaka falskt positiva detektion / anrikning. Användning av antigenkoncentrationer som är för höga maj kan anges med uppenbara bindning till icke-B-celler i proven. Vidare skenbar detektion av en överdrivet hög frekvens (> 1%) av antigenreaktiva celler kan vara en indikation på bindningsspecificitet fråga. Det slutliga målet vid fastställandet optimala mängden antigen att använda är att lägga lite mer antigen än vad som är närvarande vid fysiologiska koncentrationer, så att majoriteten av B-cellsreceptorer med en affinitet av <10 -6 M, till exempel för antigenet är mättade. Detta säkerställer att antigenspecifika B-celler är bEing detekteras med en affinitet som har sjukdomsframkallande förmåga. Tillsats av för lite antigen, dvs vid eller under fysiologiska koncentrationer, kan leda till detektering av mycket få antigenspecifika B-celler på grund av minskade antigen ockupation av BCR-certifierade referens. Å andra sidan, tillsats av alltför mycket antigen, långt över fysiologiska koncentrationer, kan leda till ökad icke-specifik bindning som kommer att inkludera B-celler med en låg affinitet för antigenet (> 10 -6 M) och är faktiskt okunniga av antigenet in vivo. Därför är det viktigt att först titrera den biotinylerade antigen över några stockar för att vara säker på att endast riktiga antigenreaktiva B-celler detekteras. På liknande sätt har vi funnit att användningen av alltför mycket streptavidin-far-röd-fluorescerande färgämne kan öka bakgrund.
Det är också viktigt att notera att biotinylering av antigen kan påverka tillgängligheten av antigena epitoper. Därför, optimering med hjälp av olika biotinylering uppfylldatoder kan vara viktiga. Alternativt biotin kan kopplas till primära aminer, tertiära aminer, sulfhydryler eller karboxylgrupper. Användning av förlängda distansarmslängder kan förbättra epitop tillgänglighet genom att minska steriskt hinder.
En av begränsningarna till denna teknik är dess reducerade effektiviteten för anrikning av antigenbindande B-celler från frysförvarade jämfört med färska celler. Detta kan relatera till ökad celldöd och tillhörande "klibbighet" i frysta prover. Icke desto mindre kan metoden tillämpas på frysta prover men det är nog viktigt att inte direkt jämföra resultat från anrikning och analys av färska och frysta celler. En annan begränsning är renheten av antigenspecifika B-celler i den anrikade provet. Av erfarenhet, det finns alltid några celler som "tag along", som omfattar både icke-specifika B-celler och T-celler. Detta är att vänta med tanke på sällsynthet av cellpopulationen på försöker berika. Emellertid renheten av than celler kan vara ökad genom att se till att en enda cell suspension erhålls före tillsats av cellerna till kolumnen, berika en andra gång på en ny kolumn, eller genom FACS sortering antigenspecifika B-celler. Beroende på vilken typ av studie, är forskaren kan avgöra vilket alternativ som bäst och om det är nödvändigt.
Som vi optimerat denna teknik vi tänkt att det skulle vara mottagliga för diskriminering av hög affinitet kontra låg affinitet antigenreaktiva celler baserat på antigen titrering eller färgningsintensitet. Men i en tidigare studie visade vi antigenreaktiva B-celler med upp till 1000-faldig skillnad i affinitet till sin antigen var lika berikad med denna metod 7. Följaktligen är formell mätning av affiniteten hos anrikade celler med användning av ytplasmonresonans analys av uttryckta rekombinanta antigenreceptorer krävs om kunskap om affiniteten är relevant för studien.
Inneboende i denna teknik är den limitation att tillsats av det biotinylerade antigenet och streptavidin kan aktivera cellerna genom tvärbindning av BCR. Detta skulle kunna utgöra ett problem för vissa nedströms funktionella analyser, såsom de som syftar till att jämföra stimulerade celler till en vilande kontroll. Detta problem kan mildras genom att hålla kontrollprover kalla att förhindra transduktion av signaler. Det är också möjligt att BCR signaler kan påverka en pågående biologisk respons. Av erfarenhet antigen anrikade cellerna bibehåller sin förmåga att utsöndra antikropp, såsom indikeras av ELISPOT-analys (figur 3b) och fungera som antigenpresenterande celler för T-celler in vitro och efter adoptiv överföring in i möss (data ej visade). En slutlig begränsning till denna teknik är användningen av anti-fluorochome antikroppar för att åstadkomma nanopartikel-bindning till antigen som adsorberats celler. Anti- långt-röd-fluorescerande färgämne korsreagerar med vissa strukturellt besläktade fluorokromer, inklusive Cy7 och Cy5.5. Detta kan begränsa alternativen of antikroppskonjugat tillgängliga för mätning av fenotypiska markörer. Men med ökad tillgång till nya fluorokromer, detta blir ett mindre problem.
Med användning av denna upptäckt och anrikningsmetoden, är det möjligt att enkelt identifiera antigenbindande B-celler i ex vivo perifert blod, mjälte, eller andra vävnader. Denna metod är särskilt användbar för att studera immunsvaret hos antigenreaktiva celler efter immunisering eller exponering för främmande antigener och i inställningen av autoimmun sjukdom. Även om ingen metod för att detektera antigen-reaktiva B-celler har visat sig vara utan sina brister, är denna metod snabbt, enkelt, och bildar en relativt hög renhet, utbyte, och anrikning av antigenreaktiva celler som kan kopplas till en mängd olika nedströms analyser. Dessutom, på grund av de grundläggande principerna för metoden, detta förfarande skulle lätt kunna anpassas till en mängd olika experimentella behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
