Summary
Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.
Introduction
Beperkende verdunning analyses van antilichaam uitscheidende cellen precursorfrequentie suggereren dat B-cellen reactief voor een bepaald antigeen kenmerkend optreden met een frequentie van 0,05-0,005% in de normale repertoire, afhankelijk van de status vaccinatie en grootte / het aantal aanwezige epitopen op het antigeen. De lage frequentie van deze cellen is het moeilijk om veranderingen in de status tijdens de ontwikkeling van immuunresponsen, zoals na vaccinatie en blootstelling aan een vreemd antigeen, of tijdens de ontwikkeling van auto-immuniteit te bestuderen. Eerder hebben onderzoekers isolatie van antigeen-reactieve B-cellen met behulp van technieken variërend van antigeen beklede platen of kolom adsorptiemiddelen, op met antigeen beklede rode bloedcellen resetten om uitgevoerd fluorescentie-geactiveerde celsortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though deze technieken zijn succesvol bij het identificeren en isoleren van antigeen-reactieve B-cellen zijn, zijn de resultaten variëren qua opbrengst, zuiverheid en schaalbaarheid. Onlangs hebben we een nieuwe methode om zowel te detecteren en te verrijken zeldzame B lymfocytensubpopulaties met magnetische nanodeeltjes. De methode kan verrijken met een relatief hoge opbrengst en zuiverheid van grote populaties starten, en is compatibel met de analyse van de reacties op antigeen. Door verrijken van populaties van cellen in suspensie, waarbij de werkwijze elimineert beperkingen die samenhangen met de geometrie van de met antigeen beklede platen of kolommen, en beperken doorvoer. Tenslotte, aangezien verrijkte cellen geassocieerd blijven met antigeen en een fluorescerende reporter, kunnen verder worden gezuiverd door FACS-sortering. Zoals hierin beschreven hebben we deze benadering voor onderzoek van perifeer bloed tetanustoxoïde-reactieve B-cellen voor en na immunisatie van menselijke patiënten, evenals autoantigeen-reactieve B-cellen van patiënten met verschillende autoi gebruiktmmune aandoeningen, waaronder type 1 diabetes, de ziekte van Graves, en de ziekte van 7 Hashimoto. De werkwijze werkt evengoed bij muis en mens, en is compatibel met de analyse van antigeen-reactieve B-cellen van verschillende weefsels (manuscript in voorbereiding).
In de basisopstelling weergave worden perifeer bloed mononucleaire cellen eerst geïncubeerd met gebiotinyleerd antigeen met antilichamen tegen oppervlakteantigenen vereist voor fenotypische analyse cel. Deze etikettering wordt gevolgd door wassen en fixatie, en toevoeging van streptavidine gekoppeld met ver-rood-fluorescerende kleurstof voor detectie van het gebiotinyleerde antigeen bindende cellen (Figuur 1). Eerdere studies hebben antigeenspecifieke B-cellen die in een vergelijkbare wijze maar met gebruik van antigenen rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom 8, 9, 10, 11. Hoewel dit is een waardigebenadering, gebruik van gebiotinyleerde antigenen in combinatie met streptavidine maakt grotere signaalversterking (dus betere differentiatie van bindende en niet-bindende cellen), met name wanneer antigenen kleine 12, 13, 14. Een aanvullende overweging is het gebruik van streptavidine in plaats van avidine omdat streptavidine gedeglycosyleerde, afneemt aspecifieke binding. Verder gebruiken we ver-rood-fluorescerende kleurstof als fluorochroom vanwege de fotostabiliteit, kwantumopbrengst (helderheid) en de kleine afmetingen (~ 1,3 kD). Eiwit fluorochromen zoals phycoerythrine (~ 250 kD) en allofycocyanine (~ 105 kD) 15 niet optimaal omdat veel potentieel antigene epitopen bevatten. Toepassing van een kleine organische fluorescente kleurstof uit één epitoop, zoals ver-rood-fluorescerende kleurstof, vermindert de complexiteit van de geïsoleerde celpopulatie.
Zodra cellen gebiotinyleerd-antigen en ver-rood-fluorescerende kleurstof-streptavidine geadsorbeerd, worden ze verrijkt met behulp van anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerde magnetische nanodeeltjes. Één nanodeeltjes worden niet herkend door de meeste flowcytometers en derhalve niet behoeven te worden verwijderd vóór zuivering door FACS sortering en downstream assays 16. Magnetische selectie van antigeenspecifieke B-cellen verrijkt de populatie van belang, waardoor de tijd en kosten van sortering zeldzame gebeurtenissen met een flow cytometer.
Hieronder tonen we representatieve resultaten van de verrijking van tetanus-toxoïde-specifieke B-cellen van een patiënt vóór en zeven dagen na tetanustoxoïd booster immunisatie. We kozen deze specifieke toepassing als bijvoorbeeld om het vermogen van deze methode om antigeenspecifieke B-cellen in vivo na acute stimulatie verrijking tonen. In combinatie met flowcytometrie is deze methode geschikt voor het verrijken en differentiëren antigeenspecifieke naïeve, geheugen, enplasmablast B-cellen en kan de onderzoeker aan veranderingen in de frequentie in de tijd te volgen. Bovendien nemen we een andere mogelijke downstream assay, zoals een ELISPOT assay, hetgeen aantoont dat cellen behouden het vermogen om antilichaam uitscheiden na verrijking. Een andere toepassing van deze werkwijze adoptieve overdracht van verrijkte cellen in een gastheer kunnen inhouden. We hebben eerder aangetoond cellen behouden het vermogen om als antigeenpresenterende cellen om antigenspecifieke T-cellen na isolatie en overdracht (gegevens niet getoond). Daarom zijn er een aantal mogelijke downstream assays die kunnen worden gekoppeld met de methode, die tezamen het begrip van de antigeen-specifieke immuunrespons informeert. We hebben de hieronder beschreven methode, met inbegrip van de controles aan de totale opbrengst, zuiverheid, cel specificiteit te bepalen, en vouw-verrijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van menselijke PBMCs
- Verzamel 30-50 ml bloed met behulp van heparine bloedafnamebuisjes.
OPMERKING: De hoeveelheid bloed hangt af van de specifieke experimentele vraag alsmede frequentie bloed van antigeenspecifieke B-cellen van belang. Gehepariniseerd bloed kunnen direct worden verwerkt of zachtjes geschud gedurende de nacht bij kamertemperatuur verwerken van de volgende dag. De vertraging in de verwerking heeft zeer weinig invloed op de efficiëntie van verrijking en is geassocieerd met een minimaal verlies van levensvatbaarheid. - Meng volbloed 1: 1 met een steriele, kamertemperatuur magnesium en calcium vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- In een 50 ml steriele conische buis, voeg 10 ml kamertemperatuur dichtheidsgradiënt oplossing. Bewaar de geopende dichtheidsgradiënt flessen in het donker bij 4 ° C, maar opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Indien mogelijk zet de pipet pistool aan de trage instelling en / of zeer weinig, maar toch consistent, trekker druk uit te oefenen om langzaamlaag 30-35 ml van het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt, zorg dat de twee niet te mengen.
Opmerking: Het plaatsen van de punt van de pipet tegen de rand van de 50 ml conische het geven van het verdunde bloed zal zorgen voor een constante stabiele stroom. - Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij 20 ° C met de rem uitgeschakeld.
- Verwijder de bovenste laag, die plasma en bloedplaatjes bevat, let de mononucleaire cellaag hieronder niet te verstoren.
- Met een steriele pipet, verzamel de mononucleaire cellaag (buffy coat) en plaats in een afzonderlijke steriele 50 ml conische buis.
- Voeg PBS aan de celsuspensie tot een volume van 50 ml. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 20 ° C met rem.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet cellen in 10 ml PBS. Tellen cellen en het bepalen van de levensvatbaarheid van het gebruik van een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan.
- Resuspendeer cellen bij 10 7 cellen / ml en plaats op ijs tot klaar voor verdere verwerking.
2. Kleuring van cellen
- Verwijder 1-2 x 10 6 cellen per fluorescentie compensatie / FMO controle nodig is, indien van toepassing. Centrifuge resterende cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem.
- Resuspendeer cellen in steriel gefiltreerd koude FACS-buffer (PBS + 1% runderserumalbumine (BSA) + 0,01% natriumazide) en 3-6 x 10 7 cellen / ml (verwijderen in een 1,5 ml centrifugebuis). Zorg ervoor dat de FACS buffer is koud en te houden op het ijs gedurende de kleuring procedure.
- Verdeel de celpopulatie in vieren (AD) bij het optimaliseren van de test. Gebruik fractie A antigeen-specifieke B-cellen plaats, gebruik fracties B en C te verrijken om de specificiteit van de verrijking / kleuring bepalen (zie 2.5 en 2.6) en het gebruik fractie D de frequentie en aantal antigeenspecifieke cellen vast te de niet aangepaste bevolking berekening van het rendement mogelijk te maken en vouw-verrijking.
- Voeg menselijk FcyR blokkeren reagent fracties AD op ijs voorkomen binding van antilichamen aan Fc-receptoren.
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor de juiste omstandigheden. - Add fluorochroom geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakteantigenen plaats cel fracties AD 30 min op ijs in het donker, dat evenwel niet tot fluorochromen die kunnen kruisreageren met het anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof antilichamen gekoppeld aan magnetische nanodeeltjes omvatten.
LET OP: Deze omvatten antilichaamconjugaten tot bijna-infrarood fluorescerende kleurstof, Cy5, Cy5.5 en Cy7. Elke levensvatbaarheid vlekken die toegevoegd moet verenigbaar zijn met het gebruik van een fixeermiddel zijn. Als men niet van plan de cellen met behulp van FACS analyse, maar bepalen de antilichaamsecreterende frequentie, bijvoorbeeld door ELISPOT, oppervlakte kleuring met antilichamen overbodig. - Om de specificiteit van de assay, incubeer fractie B met een voldoende hoeveelheid niet-gemerkt antigeen voor 30 min op ijs, zodat de meerderheid van de receptoren met een affiniteit van ten minste10 -6 M geblokkeerd.
OPMERKING: Meestal een goede uitgangsconcentratie een 50-100-voudige overmaat van de hoeveelheid antigeen voldoende geacht 2.6 hieronder (bijvoorbeeld 50-100 pM). Dit zou een L-cellen met hoge affiniteit te blokkeren voor de ongelabelde antigen te binden aan het gebiotinyleerde antigeen, dat wordt toegevoegd in stap 2.6 hieronder, waardoor bevestiging van de specificiteit van de verrijkte cellen. Deze stap kan in combinatie met stap 2.4 worden voltooid. - Voeg gebiotinyleerd antigeen fracties A, B en D. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
OPMERKING: Concentratie van gebiotinyleerd antigeen worden getitreerd om de optimale hoeveelheid om een adequate detectie en scheiding van cellen binding van niet-specifieke cellen te waarborgen bystander bepalen. Typisch een goed uitgangspunt concentratie test is 1-5 uM.
LET OP: Voor fracties A en D, deze stap kan gelijktijdig worden gedaan met stap 2.4. Voor de fractie B, moet deze stap worden uitgevoerd nadat stap 2.5 (wassen in betwEen stappen niet nodig). - Weglaten gebiotinyleerd antigeen van Fraction C om eventuele binding van B-cellen aan andere reagentia in het protocol, zoals streptavidine ver rood-fluorescerende kleurstof en de magnetische korrels te bepalen.
- Was de cellen tweemaal uit suspensie van cellen in 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Na de laatste wasbeurt, verdun geconcentreerde celsuspensie in 1 ml 2% formaldehyde per 5 x 10 7 cellen en laat zitten in het donker op ijs gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Fixatie van de cellen op dit punt verzekert dat de gebiotinyleerde antigen gebonden blijft aan de BCR voor de rest van de procedure. Voor levensvatbare cellen - voor downstream-analyse, zoals in ELISPOTs of adoptief transfers, laat de fixatie stap. - Was de cellen tweemaal met 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in 1 ml koud FACS buffer per 5 x 107 cellen.
- Voeg 1-2 pg streptavidine-ver-rood-fluorescerende kleurstof / ml en incuberen op ijs gedurende 20 minuten in het donker. Titreer de hoeveelheid streptavidine voor elke toepassing.
- Was de cellen tweemaal met 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Fractie D is voorbereid op dit punt niet verrijking zal ondergaan met de magnetische korrels.
Opmerking: Dit monster wordt gebruikt om de frequentie en het aantal antigeenspecifieke B-cellen in het monster. Deze wordt gebruikt om de opbrengst te bepalen en verrijking voudige verrijking bereikt.
3. magnetische nanodeeltjes gebaseerde Enrichment
- Resuspendeer cellen uit monsters AC in 1 ml koude buffer scheiding (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) per 5 x 10 7 cellen en passeren door een 40 urn filter om eventuele klonten die de kolom zou kunnen verstoppen te verwijderen.
- Voeg Anti-Cy5 / Anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof nanodeeltjes. for optimaal resultaat moet de concentratie van de nanodeeltjes worden getitreerd voor elk gebruik, maar een goed startpunt is 50 pl suspensie per 5 x 10 7 cellen / ml. Roteren in het donker bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Was tweemaal met 1 ml koude buffer scheiding bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 1 ml koude buffer scheiding per 5 x 10 7 cellen.
4. Magnetische Verrijking met behulp van LS of LD Columns
- Plaats drie LS of LD kolommen in het magnetische veld van een magnetische scheider en voeg 3 ml scheidingsbuffer de kolommen nat (zie het produkt te bepalen welk type kolom het meest geschikt). Laat alle 3 ml door de kolom te passeren en gooi deze na collectie.
Opmerking Hoewel scheiding van magnetische nanodeeltjes gelabelde cellen kan worden uitgevoerd met een van de magnetische scheidingsinrichtingen die commercieel verkrijgbaar zijn, het laboratorium is het meeste succes met behulp van LS kolommen had, in terms opbrengst, zuiverheid en efficiency van verrijking. - Plaats drie 15 ml conische buizen label "Fractie A / (B) / (C) negatief" voor negatief geselecteerde cellen in de kolom. Voeg het magnetisch gelabelde cellen hun respectieve kolom en laat het volledige volume passeren.
- Voeg 3 ml koude buffer scheiding geplaatst, en laat deze door de kolom stroomt en herhaal met 2 ml. Verzamel de negatief geselecteerde cellen en zet apart op ijs.
- Verwijder de kolom uit het magnetische veld en bovenop een 15 ml conische buis label "Fractie A / (B) / (C) positief", voor het positief geselecteerde cellen.
- Vul de kolom naar de top met ongeveer 6 ml scheidingsbuffer onmiddellijk duiken dit volume door de kolom cellen die het magnetische veld gebonden was met de bijgeleverde zuiger verzamelen.
- Om de zuiverheid te verhogen, kan de positief geselecteerde cellen verder worden verrijkt met een tweede schone kolom, het herhalen van de procedure.
- Spin zowel negatief als positief geselecteerde fracties bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en schorsen gewenste eindvolume. Ga verder met downstream-analyse, zoals FACS, ELISPOT of adoptieve overdracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse van de zuiverheid, opbrengst, en vouw-verrijking met behulp van flowcytometrie
Populaties verrijkt zoals hierboven beschreven onvermijdelijk contaminerende cellen die niet gebonden streptavidine far-red-fluorescerende kleurstof maar zijn ingevangen in de matrix bevat. Deze verontreinigingen kunnen van verrijkte populaties van FACS-sortering worden verwijderd. Om de zuiverheid van verrijkte populatie te schatten, poort op levende cellen op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing en / of levende / dode vlek en analyseren van ver-rood-fluorescerende kleurstof + cel frequentie. Het percentage op deze laatste poort wijst op zuiverheid. Verdere analyse van de specificiteit en affiniteit antigeen van deze cellen vereist FACS sortering van afzonderlijke cellen, gevolgd door klonering en sequentiebepaling van tot expressie gebrachte immunoglobulinegenen en recombinante antilichaamproductie en analyse.
Rendement betreft het aantal geïsoleerde antigen-bindende B-cellen teruggewonnen fractie A ten opzichte van het nummer in de uitgangspopulatie (fractie D). Aangezien hetzelfde aantal cellen in fractie D als fractie A, kan men direct de opbrengst (# of antigeenbindend B-cellen in een fractie ÷ # of antigeenbindend B-cellen in fractie D) te bepalen.
Voudige verrijking (E) wordt gereflecteerd door het percentage ver-rood-fluorescerende kleurstof + B-cellen in de "positieve" verrijkte fractie A ten opzichte van die in fractie D. Deze waarde geeft de proportionele toename van antigeenspecifieke B-cellen bereikt door nanodeeltjes verrijking. De waarde kan worden gevonden met behulp van de volgende vergelijking:
Deze techniek tonen, tonen we representatieve resultaten verkregen met tetanus-toxoïde (Tet-Tox) als modelantigeen te detecteren en verrijken Tet-Tox-reactieve B-cellen in het perifere bloed van patiënten die zijn tegen tetanus op verschillende tijdstippen zijn ingeënt. Figuur 1 is een schema van de werkwijze en het antigeen adsorbens. Figuur 2a toont de frequentie van Tet-Tox-reactieve B-cellen uit een individu die laatste gevaccineerd tegen tetanus meer dan tien jaar geleden. Worden de verrijkte ( "positieve") en verarmd ( "negatief") populaties van fractie A en de basislijn frequentie van Tet-Tox-specifieke B-cellen uit fractie D. Vandaar dat in dit voorbeeld kunnen we bindende cellen te verrijken met ongeveer 7-voudig en hiermee de zuiverheid van 4% in de verrijkte fractie.
Figuur 2b toont de specificiteit van de reactie met behulp van bloed van een patiënt die 3 jaar eerder waren gevaccineerd ~. Als we nog een 50-voudige overmaat (50 uM) ongelabeld tetanus-toxoïde aan de cellen voordat Addition van het gebiotinyleerde antigen (fractie B) zijn we in staat binding te blokkeren met 83%, waaruit de specificiteit van antigeenbinding. Toen we weggelaten gebiotinyleerd antigeen van de procedure (Fractie C), een klein aantal (~ 0,2%) van B-cellen nog steeds gebonden; Deze kleine fractie van B-cellen vermoedelijk weerspiegelt binding aan sommige niet-antigeen in het adsorberend middel, zoals streptavidine-ver-rood-fluorescerende kleurstof, de anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof antilichaam of magnetische korrels.
Om het gebruik van de werkwijze tonen voor veranderingen in antigeenbinding celfenotype na immunisatie zien we in figuur 3 de frequentie van Tet-Tox-specifieke B-cellen in de naïeve, geheugen en plasmablast populaties in bloed afgenomen vóór en 7 dagen na de booster analyseren vaccinatie van een gezonde persoon. Terwijl het percentage naïeve B-cellen onder totale Tet-Tox-bindende B-cellen daalde van 84% tot 64% na boost het percentage MEMORy en plasmablast populaties onder totale Tox Tet-reactieve cellen nam toe van 16% tot 36% en 0% tot 40%, respectievelijk. Figuur 3b toont representatieve ELISPOT gegevens van perifere bloed van de 7 dagen na boost gezonde proefpersoon. Isolatie van het Tet-Tox-bindende B-cellen tot 4-voudige verrijking in tetanustoxoïd antilichaam uitscheidende cellen frequentie.
Figuur 1: Methode voor de detectie en verrijking van tetanustoxoïd (Tet Tox) -bindings B-cellen. (A) Protocol voor verrijking en isolatie van Tet-Tox-bindende B-cellen. (B) Schematische weergave van adsorbens gebruikt om Tet-Tox-bindende B-cellen te identificeren en te verrijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
n-page = "1"> 
Figuur 2: Representatieve cytogrammen demonstreren verrijking van Tet Tox-bindende B-cellen uit humaan perifeer bloed. (A) cytogrammen van verrijkt en verarmd Tet Tox-reactieve B-cellen uit fractie A en de totale Tet-Tox-reactieve B-cellen uit fractie D van een normale onderwerp laatste gevaccineerd> 10 jaar eerder. (B) cytogrammen van PBMC's van de "positieve" populatie van een individu gevaccineerd ~ 3 jaar geleden en verrijkt zoals in A (fractie A), na pre-incubatie met een overmaat van 50 uM ongelabeld Tet-tox (fractie B) of verrijkte met Tet-Tox-biotine weggelaten tijdens de procedure (fractie C). Alle analyses werden gated op CD19 + lymfocyten. Percentages vertegenwoordigen het percentage Tet-Tox-bindende cellen van B-cellen (CD19 +) in de laatste fractie.ank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van post-verrijking analyse van antigeen bindende cellen. (A) Representatieve flowcytometrische analyse van cel fenotype na verrijking van Tet-Tox-bindende B-cellen. Cytogrammen verbeelden identificatie en analyse van Tet-Tox-reactieve naïeve (CD27 -), het geheugen (CD27 +), en plasmablasten (CD27 ++ CD38 ++) in B-cel subpopulaties van een onderwerp voor en 7 dagen na booster vaccinatie tegen tetanus. Alle cellen werden gated op CD19 + lymfocyten van de verrijkte "positieve" populaties. (B) Vertegenwoordiger ELISPOT analyse van antilichaam afscheidende cellen in verrijkte, uitgeput, en de totale unenriched B-cel fracties uit perifere bloed van een gezonde proefpersoon 7 dagen na boost. Voor de ELISPOT test werden putjes van een plaat 96 eerst bekleed met een 10 ug / ml oplossing van tetanus-toxoïde. Tweevoudige seriële verdunningen van celsuspensies werden in putjes (over de plaat) ab cellen bij gelijke concentratie van de verrijkte, uitgeput en totale unenriched fracties. Anti-tetanus antilichaam uitscheidende cellen werden gedetecteerd met gebiotinyleerd anti-humaan IgG (H & L), gevolgd door streptavidine-AP. De plaat werd ontwikkeld met ELISPOT ontwikkeling buffer en de reactie werd gestopt door het wassen van de plaat driemaal met tweemaal gedestilleerd H2O het aantal spots in een cel verdunning in het lineaire gebied werd bepaald en het aantal ASC berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor isolatie en verrijking van antigeen-bindende B-cellen uit humaan perifeer bloed bereiken. De werkwijze is goed toepasbaar voor muizen en andere weefsels zoals de milt en lymfeklieren, en is compatibel met post-verrijking analyse van cel fenotype en functie (manuscript in voorbereiding).
De gebruiker moet zich bewust van een aantal variabelen die het succes van deze procedure kan beïnvloeden. Uit ervaring dode cellen meestal bij de magnetische kralen en "opnemen" fluorescente kleurstoffen, zoals de Streptavidine-ver-rood-fluorescerende kleurstof, waardoor niet-specifieke achtergrond toe. Het is van cruciaal belang om zo veel dode cellen uit monsters mogelijk te verwijderen voor het begin van deze procedure. Het gebruik van vlekken die live / dead discriminatie gate uit dode cellen van de analyse mogelijk te maken kan nuttig zijn, maar de aanwezigheid van dode cellen kunnen de interpretatie van assays van antilichamen compromis afscheidende cel frequentie enfunctie na adoptieve overdracht.
Bovendien hebben we gevonden dat zorgvuldige titratie van het gebiotinyleerde antigeen toegevoegd is essentieel onderscheiden antigeen-specifieke en niet-specifieke binding. Het gebruik van te weinig antigeen zal leiden tot een onderschatting van de frequentie van antigeen-bindende cellen terwijl teveel antigeen vals positieve detectie / verrijking veroorzaken. Gebruik van antigen concentraties te hoog MAY kan worden aangegeven door duidelijk binding aan niet-B-cellen in de monsters. Verder blijkt detectie van een te hoge frequentie (> 1%) antigeen reactieve cellen een indicatie bindingsspecificiteit probleem. Het uiteindelijke doel het bepalen van de optimale hoeveelheid antigeen te gebruiken is om een beetje meer antigeen dan aanwezig is bij fysiologische concentraties zodanig toegevoegd dat de meerderheid van de B-celreceptoren met een affiniteit van <10 -6 M bijvoorbeeld voor het antigeen verzadigd. Dit zorgt ervoor dat antigeenspecifieke B-cellen Being gedetecteerd met een affiniteit die pathogene potentieel heeft. Toevoeging van te weinig antigeen, dat wil zeggen op of onder fysiologische concentraties kan leiden tot de detectie van zeer weinig antigeenspecifieke B-cellen als gevolg van verminderde antigeen bezetting van de BCR. Anderzijds, toevoeging van te veel antigeen, ver boven fysiologische concentraties, kan leiden tot verhoogde niet-specifieke binding die B-cellen met een lage affiniteit voor het antigeen (> 10 -6 M) omvatten en in feite onwetend van de antigen in vivo. Daarom is het essentieel om eerst titreren het gebiotinyleerde antigeen in enkele stammen om vertrouwen dat enige ware antigeen-reactieve B-cellen gedetecteerd worden. Zo hebben we dat het gebruik van te veel streptavidine-ver-rood-fluorescerende kleurstof gevonden kan achtergrond te verhogen.
Het is ook belangrijk op te merken dat biotinylering van antigen kan de beschikbaarheid van antigene epitopen beïnvloeden. Daarom optimalisatie met verschillende biotinylatie voldaanhods kan belangrijk zijn. Alternatief biotine kunnen worden gekoppeld met primaire aminen, tertiaire aminen, sulfhydrylen of carboxylgroepen. Het gebruik van de uitgebreide spacer armlengtes kunnen epitoop beschikbaarheid te verbeteren door het verminderen van sterische hindering.
Een van de beperkingen van deze techniek is de beperkte effectiviteit verrijking van antigeen bindende B-cellen van gecryopreserveerd vergelijking met verse cellen. Dit kan betrekking hebben op een grotere celdood en de bijbehorende "kleverigheid" in bevroren monsters. Toch kan de werkwijze worden toegepast op bevroren monsters, maar het is waarschijnlijk niet van belang direct resultaat van verrijking en analyse van verse en ingevroren cellen te vergelijken. Een andere beperking is de zuiverheid van antigeenspecifieke B-cellen in het verrijkte monster. Uit ervaring, er altijd een aantal cellen dat "tag langs", waaronder zowel niet-specifieke B-cellen en T-cellen. Dit is te verwachten gezien de zeldzaamheid van de celpopulatie op probeert te verrijken. De zuiverheid van thij cellen kan verhogen doordat een enkele celsuspensie wordt verkregen voor het toevoegen van de cellen aan de kolom, verrijken een tweede keer op een nieuwe kolom of door FACS sorteren van de antigeen-specifieke B-cellen. Afhankelijk van het type onderzoek, de onderzoeker kan bepalen welke optie het beste en of het nodig.
Als we deze techniek geoptimaliseerd we voor ogen dat zij vatbaar zijn voor discriminatie van hoge affiniteit versus lage affiniteit antigeen-reactieve cellen op basis van antigeen titratie of kleurintensiteit zou zijn. In een eerdere studie hebben we aangetoond antigeen-reactieve B-cellen met tot 1000-voudig verschil in affiniteit voor hun antigeen waren even verrijkt met deze methode 7. Vandaar dat formeel meten van de affiniteit van de verrijkte cellen met behulp van surface plasmon resonance analyse van tot expressie gebracht recombinant antigen receptoren vereist als kennis van de affiniteit relevant is voor de studie.
Inherent aan deze techniek is het limitatie dat toevoeging van gebiotinyleerd antigeen en streptavidine de cellen door verknopen van het BCR activeert. Dit kan een probleem voor bepaalde downstream functionele assays, zoals die trachten gestimuleerde cellen te vergelijken met een controle rustende pose. Dit probleem kan worden verminderd door hem controlemonsters koud transductie van signalen te voorkomen. Het is ook mogelijk dat BCR signalen doorlopend biologische respons zou kunnen beïnvloeden. Uit ervaring antigeen verrijkte cellen behouden hun vermogen tot het uitscheiden van antilichaam, zoals aangegeven door ELISPOT analyse (figuur 3b) en functioneren als antigeenpresenterende cellen in vitro T en na adoptieve overdracht in muizen (gegevens niet getoond). Een laatste beperking van deze techniek is het gebruik van anti-fluorochome antilichamen nanodeeltjes bereiken binding aan antigeen geadsorbeerd cellen. Anti ver-rood-fluorescerende kleurstof kruisreageert met bepaalde structureel verwante fluorochromen, zoals Cy7 en Cy5.5. Dit kan de mogelijkheden beperken of antilichaamconjugaten beschikbaar voor het meten van fenotypische markers. Echter, met een verhoogde beschikbaarheid van nieuwe fluorochromen, dit is steeds minder een probleem.
Met behulp van deze detectie en verrijking werkwijze is het mogelijk om antigeenbindend B-cellen in ex vivo perifeer bloed, milt of andere weefsels gemakkelijk identificeren. Deze werkwijze is bijzonder nuttig bij het bestuderen van de immuunrespons antigeen reactieve cellen na immunisatie of blootstelling aan vreemde antigenen en in de omgeving van autoimmuunziekte. Hoewel er geen methode om antigeen-reactieve B-cellen gedetecteerd heeft bewezen zonder gebreken, deze werkwijze is snel, eenvoudig, en vormt een betrekkelijk hoge zuiverheid, opbrengst en verrijking van antigeen-reactieve cellen die kunnen worden gekoppeld met een verscheidenheid van stroomafwaartse assays. Bovendien, als gevolg van de basisprincipes van de werkwijze Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
