Summary
Un método simple y efectivo que emplea nanopartículas magnéticas para detectar y enriquecer células B reactivas al antígeno para el análisis funcional y fenotípica se describe.
Introduction
Dilución limitante análisis de la frecuencia de precursor de células secretora de anticuerpos han sugerido que las células B reactivas a un antígeno particular se producen normalmente a una frecuencia de 0,05 a 0,005% en el repertorio normal de, dependiendo del estado de la vacunación y el tamaño / número de epítopos presentes en el antígeno. La baja frecuencia de estas células ha hecho que sea difícil para el estudio de los cambios en su estado durante el desarrollo de la respuesta inmune, tales como después de la vacunación o la exposición a un antígeno extraño, o durante el desarrollo de la autoinmunidad. Anteriormente, los investigadores han llevado a cabo el aislamiento de células B reactivas al antígeno utilizando técnicas que van desde las placas recubiertas con antígeno o adsorbentes de la columna, para la reposición de glóbulos rojos antígeno recubierto, a clasificación de células 1, 2, 3, 4, 5, 6 activada por fluorescencia. though estas técnicas han tenido éxito en la identificación y el aislamiento de células B reactivas al antígeno, los resultados han variado en términos de rendimiento, pureza y capacidad de ampliación. Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para detectar y enriquecer tanto subpoblaciones de linfocitos B raras usando nanopartículas magnéticas. El método permite el enriquecimiento con rendimiento relativamente alto y la pureza de las poblaciones de partida de gran tamaño, y es compatible con el análisis de las respuestas a antígeno. Al enriquecer a partir de poblaciones de células en suspensión, el método elimina las limitaciones que se asocian con la geometría de placas o columnas recubiertas de antígeno, y límite de rendimiento. Finalmente, ya que las células enriquecidas permanecen asociados con el antígeno y un reportero fluorescente, que se pueden purificar aún más por FACS clasificación. Como se describe en el presente documento hemos usado este enfoque para el estudio de las células de toxoide del tétanos reactiva de sangre periférica B antes y después de la inmunización de sujetos humanos, así como las células B autoantígeno reactiva de sujetos con diferentes autoitrastornos mmune, incluyendo la diabetes tipo 1, enfermedad de Graves, y la enfermedad de Hashimoto 7. El método funciona igual de bien en el ratón y humano, y es compatible con el análisis de las células B reactivas al antígeno de una variedad de tejidos (manuscrito en preparación).
En su formato básico, las células mononucleares de sangre periférica se incubaron primero con el antígeno biotinilado junto con anticuerpos para antígenos de la superficie celular necesarias para el análisis fenotípico. Esta etapa de marcaje es seguido por el lavado y fijación, y la adición de estreptavidina acoplada a colorante rojo lejano fluorescente para la detección de las células de unión biotinilado-antígeno (Figura 1). Estudios previos han identificado las células B específicas de antígeno de una manera similar pero utilizando antígenos directamente conjugado con un fluorocromo 8, 9, 10, 11. Aunque este es un dignoenfoque, el uso de antígenos biotinilados en conjunción con estreptavidina permite una mayor amplificación de la señal (por lo tanto una mejor diferenciación de la unión y las células no vinculante), en particular cuando los antígenos son pequeñas 12, 13, 14. Una consideración adicional es el uso de estreptavidina en lugar de avidina porque estreptavidina se desglicosilada, la disminución de la unión no específica. Además, usamos colorante rojo lejano fluorescente como el fluorocromo debido a su fotoestabilidad, rendimiento cuántico (brillo), y su pequeño tamaño (~ 1,3 kD). Fluorocromos de proteínas como la ficoeritrina (~ 250 kD) y aloficocianina (~ 105 kDa) 15 no son óptimas, ya que potencialmente contienen muchos epítopos antigénicos. El uso de un pequeño tinte fluorescente orgánica compuesta de un único epítopo, tal como tinte rojo lejano fluorescente, reduce la complejidad de la población de células aislada.
Una vez que son células con biotina-antigen y adsorbido rojo lejano-colorante fluorescente-estreptavidina, que se enriquecen usando nanopartículas magnéticas de tinte-conjugado anti-rojo lejano fluorescentes. Nanopartículas individuales no son detectados por la mayoría de los citómetros de flujo y por lo tanto no tienen que ser retirados antes de la purificación por clasificación FACS y ensayos de aguas abajo 16. la selección magnética de células B específicas de antígeno enriquece la población de interés, lo que elimina el tiempo y el coste de clasificar los eventos raros utilizando un citómetro de flujo.
A continuación les mostramos los resultados representativos de enriquecimiento de células B-toxoide tetánico-específica de un sujeto antes y siete días después de la inmunización de refuerzo de toxoide tetánico. Elegimos esta aplicación particular como un ejemplo con el fin de demostrar la capacidad de este método para enriquecer células B específicas de antígeno siguientes aguda en la estimulación in vivo. Cuando se combina con citometría de flujo, este método es capaz de enriquecer y diferenciar específica de antígeno ingenuo, la memoria, ycélulas y plasmablasto B permite al investigador para seguir los cambios en su frecuencia con el tiempo. Además, se incluye otra posible ensayo de aguas abajo, por ejemplo, un ensayo ELISPOT, lo que demuestra que las células conservan la capacidad de secretar anticuerpos después de enriquecimiento. Otra aplicación de este método podría implicar la transferencia adoptiva de células enriquecidas en un huésped. Hemos demostrado anteriormente células mantienen la capacidad para actuar como células presentadoras de antígeno a las células T específicas de antígeno después del aislamiento y de transferencia (datos no mostrados). Por lo tanto, hay una serie de posibles ensayos de aguas abajo que pueden ser acoplados con el método, que en conjunto informa a la comprensión de la respuesta inmune específica de antígeno. Hemos descrito a continuación el método, incluidos los controles para determinar el rendimiento general, la pureza, la especificidad de la célula, y doblar-enriquecimiento.
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Protocol
1. Aislamiento de PBMC humanas
- Recoger 30-50 ml de sangre utilizando tubos de recogida de sangre heparinizada.
NOTA: La cantidad de sangre que se utiliza depende de la pregunta experimental particular, y la frecuencia en la sangre de las células B específicas de antígeno de interés. La sangre heparinizada se puede procesar inmediatamente o sacudió suavemente durante la noche a temperatura ambiente durante el procesamiento de la día siguiente. El retraso en el procesamiento tiene muy poco efecto sobre la eficiencia de enriquecimiento y se asocia con una pérdida mínima de la viabilidad. - Mezclar la sangre completa 1: 1 con, magnesio estéril temperatura ambiente y la solución salina tamponada con fosfato libre de calcio (PBS).
- En un tubo cónico estéril de 50 ml, añadir 10 ml de solución de gradiente de densidad de la temperatura ambiente. Almacenar las botellas de gradiente de densidad abiertos en la oscuridad a 4 ° C, pero se calienta a temperatura ambiente antes de usarla.
- Si es posible ajustar la pistola de pipeta para el ajuste lento y / o se aplica muy poco, pero consistente, la presión de disparo para lentamentela capa de 30-35 ml de la sangre diluida en la parte superior del gradiente de densidad, teniendo cuidado de no mezclar los dos.
NOTA: La colocación de la punta de la pipeta contra el borde de las cónico de 50 ml, mientras que la adición de la sangre diluida ayudará a asegurar un flujo constante consistente. - Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 20 ° C con el freno desactivado.
- Eliminar la capa superior, que contiene plasma y plaquetas, teniendo cuidado de no perturbar la capa de células mononucleares a continuación.
- Usando una pipeta estéril, recoger la capa de células mononucleares (capa leucocitaria) y ponerlo en un tubo cónico de 50 ml estériles distintas.
- Añadir PBS a la suspensión celular a un volumen de 50 ml. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 20 ° C con freno.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 10 ml de PBS. Recuento de células y determinar la viabilidad usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
- Resuspender las células en 10 7 células / ml y colocar en hielo hasta que esté listo para su posterior procesamiento.
2. La tinción de células
- Retire 1-2 x 10 6 células por cada una compensación de fluorescencia / control de FMO es necesario, en su caso. Centrifugar resto de las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C con freno.
- Resuspender las células en tampón estéril filtrada, frío FACS (PBS + 1% de albúmina de suero bovino (BSA) + azida de sodio al 0,01%) a 3-6 x 10 7 células / ml (eliminan en un tubo de centrífuga de 1.5 ml). Asegúrese de que el tampón FACS frío y mantener en hielo durante todo el procedimiento de tinción.
- Dividir la población de células en cuatro partes (AD) al optimizar el ensayo. Utilice la fracción A de enriquecer células B específicas de antígeno de interés, las fracciones de uso de B y C para determinar la especificidad de enriquecimiento / tinción (ver 2.5 y 2.6 más adelante), y el uso fracción D para determinar la frecuencia y el número de células específicas de antígeno en la población no enriquecido para permitir el cálculo del rendimiento y doble-enriquecimiento.
- Añadir FcyR re bloqueo humanaagente de fracciones AD en hielo para evitar la unión de anticuerpos a los receptores Fc.
NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para las condiciones apropiadas. - Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo a la celda antígenos de superficie de interés para las fracciones de AD durante 30 min en hielo en la oscuridad, con cuidado de no incluir fluorocromos que pueden producirse reacciones cruzadas con los anticuerpos anti-tinte rojo lejano fluorescentes acoplados a nanopartículas magnéticas.
NOTA: Estos incluyen conjugados de anticuerpo para tinte fluorescente en el infrarrojo cercano, Cy5, Cy5.5 y Cy7. Las manchas de viabilidad que se agregan deben ser compatibles con el uso de un fijador. Si uno no tiene la intención de analizar las células por medio de FACS, pero determinar la frecuencia secretora de anticuerpos, por ejemplo, mediante ELISPOT, tinción de la superficie con anticuerpos es innecesaria. - Para probar la especificidad del ensayo, se incuba la fracción B con una cantidad suficiente de antígeno no marcado durante 30 minutos en hielo, de modo que la mayoría de los receptores con una afinidad de al menos10 -6 M están bloqueados.
NOTA: Por lo general, una buena concentración de partida es un 50 a 100 veces en exceso de la cantidad de antígeno considera suficiente en 2.6 a continuación (por ejemplo, 50 a 100 mM). Esto debería bloquear cualquier célula B con una alta afinidad por el antígeno no marcado se una al antígeno biotinilado, que se añade en el paso 2.6 a continuación, lo que permite la confirmación de la especificidad de las células enriquecidas. Este paso se puede completar en conjunción con el paso 2.4 anteriormente. - Añadir antígeno biotinilado a las fracciones A, B, y D. Incubar en hielo durante 30 min.
NOTA: La concentración de antígeno biotinilado se debe titular para determinar la cantidad óptima necesaria para asegurar la detección y separación de las células de unión de células espectadoras no específicos adecuados. Normalmente, una buena concentración de partida de la prueba es de 1-5 M.
NOTA: para las fracciones A y D, este paso puede realizarse simultáneamente a la etapa 2.4 anterior. Para la fracción B, este paso debe realizarse después del paso 2.5 (lavado en between pasos es innecesaria). - Omitir el antígeno biotinilado de la fracción C con el fin de determinar cualquier unión de las células B a otros reactivos en el protocolo, tales como estreptavidina colorante rojo lejano fluorescente y las perlas magnéticas.
- Lavar las células dos veces con la suspensión de células en 1 ml de tampón FACS frío por cada 5 x 10 7 células y centrifugación a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Después del lavado final, se diluye la suspensión de células concentrado en 1 ml 2% de formaldehído por cada 5 x 10 7 células y dejar reposar en la oscuridad en hielo durante 5 min.
NOTA: fijación de las células en este punto garantiza que el antígeno biotinilado permanece unido a la BCR para el resto del procedimiento. Para las células viables - para el análisis de aguas abajo, como en ELISPOT o transferencias adoptivos, omitir la etapa de fijación. - Lavar las células dos veces con 1 ml de tampón FACS frío por cada 5 x 10 7 células y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender en 1 ml de FACS frío tampón por 5 x 107 células.
- Añadir colorante 1-2 g de estreptavidina-rojo lejano fluorescente / ml y se incuba en hielo durante 20 min en la oscuridad. Valorar la cantidad de estreptavidina para cada aplicación.
- Lavar las células dos veces con 1 ml de tampón FACS frío por cada 5 x 10 7 células y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. preparación de la fracción D se completa en este punto, ya que no se someterá a un enriquecimiento usando las perlas magnéticas.
Nota: este ejemplo se utilizará para determinar la frecuencia y el número de células B específicas de antígeno en la muestra. Esto se utiliza para determinar el rendimiento y doblar-enriquecimiento obtenido por enriquecimiento.
3. Enriquecimiento magnética basada en nanopartículas
- Resuspender las células a partir de muestras de CA en 1 ml de tampón frío de separación (PBS + BSA al 0,5% + EDTA 2 mM) por cada 5 x 10 7 células y pasar a través de un filtro de 40 micras para eliminar los grumos que podrían obstruir la columna.
- Añadir Anti-Cy5 / nanopartículas de tinte anti-rojo lejano fluorescentes. for resultados óptimos, la concentración de nanopartículas se debe ajustar para cada uso, pero es un buen punto de partida es 50 l de suspensión por cada 5 x 10 7 células / ml. Girar en la oscuridad a 4 ° C durante 10 minutos.
- Lavar dos veces con tampón de separación frío 1 ml a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 1 ml de tampón de separación frío por cada 5 x 10 7 células.
4. Uso de enriquecimiento magnético o columnas LS LD
- Coloque tres columnas LS o LD en el campo magnético de un separador magnético y añadir 3 ml de tampón de separación para mojar las columnas (véase la descripción del producto para determinar qué tipo de columna es el más adecuado). Permitir a los 3 ml pasen a través de la columna y se descartan después de la recolección.
NOTA: A pesar de la separación de las células de nanopartículas magnéticas marcado se puede realizar usando uno cualquiera de los dispositivos de separación magnética que están disponibles comercialmente, el laboratorio ha tenido el mayor éxito con el uso de columnas LS, en terms de rendimiento, pureza, y la eficiencia de enriquecimiento. - Colocar los tubos tres 15 ml cónicos etiquetados "Fracción A / (B) / (C) negativo", para las células seleccionadas negativamente, en la columna. Añadir la partícula magnética células marcadas a su respectiva columna y permitir que todo el volumen pase a través.
- Añadir 3 ml de tampón de separación fría en la parte superior, y permite que esto pase a través de la columna y repetir con 2 ml. Recoger las células seleccionadas negativamente y dejar de lado en hielo.
- Retirar la columna del campo magnético y colocar en la parte superior de un tubo cónico de 15 ml con la etiqueta "Fracción A / (B) / (C) positivo", para las células seleccionadas positivamente.
- Llene la columna a la parte superior con aproximadamente 6 ml de tampón de separación y de inmediato hundir este volumen a través de la columna para recoger las células que se habían enlazado al campo magnético mediante el émbolo proporcionado.
- Para aumentar la pureza, las células seleccionadas positivamente se pueden enriquecer adicionalmente usando una segunda columna limpia, repitiendo el procemiento.
- Girar tanto las fracciones seleccionadas negativamente y positivamente a 400 xg durante 10 min a 4 ° C y suspender en el volumen final deseado. Proceder con el análisis de aguas abajo, tales como FACS, ELISPOT o transferencia adoptiva.
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Representative Results
Análisis de la pureza, rendimiento, y doblar el enriquecimiento mediante citometría de flujo
Poblaciones enriquecidas como se describió anteriormente, inevitablemente, contienen células contaminantes que no se han unido tinte rojo lejano estreptavidina fluorescente, pero están atrapadas en la matriz. Estas impurezas pueden eliminarse de las poblaciones enriquecidas por FACS. Para estimar la pureza de las poblaciones enriquecidas, puerta de células vivas basa en dispersión frontal y lateral y / o la mancha en vivo / muerto y analizar tinte + células frecuencia de rojo lejano fluorescente. El porcentaje dentro de este último puerta es indicativa de la pureza. El análisis adicional de la especificidad y afinidad de antígeno de estas células requiere FACS clasificación de células individuales, seguido de la clonación y secuenciación de genes de inmunoglobulina expresados y la producción de anticuerpo recombinante y análisis.
Rendimiento se refiere al número de antige aisladocélulas B recuperados en la fracción n-unión A en relación con el número de la población de partida (Fracción D). Desde el mismo número de células estaban en Fracción D como fracción A, se puede determinar directamente el rendimiento (# de células B de unión a antígeno en la fracción A ÷ # de células B de unión a antígeno en la fracción D).
Doblar de enriquecimiento de (E) es reflejado por el porcentaje de células de colorante + B de rojo lejano fluorescente en la fracción de "positiva" enriquecido A con respecto a que en la fracción D. Este valor indica el aumento proporcional en las células B específicas de antígeno obtenidos por enriquecimiento de nanopartículas. El valor se puede encontrar utilizando la siguiente ecuación:
Para demostrar esta técnica, nos muestran resultados representativos obtenidos utilizando toxoide tetánico (Tet-Tox) como modeloantígeno para detectar y enriquecer para las células B Tet-Tox-reactiva en la sangre periférica de sujetos que han sido vacunados contra el tétanos a diferentes puntos de tiempo. La Figura 1 es un esquema del método y el adsorbente antígeno. La figura 2a muestra la frecuencia de células B Tet-Tox-reactivos de un individuo que era la última vacunados contra el tétanos hace más de una década. Se muestra la población de la Fracción A y la frecuencia basal de células B Tet-Tox-específicos de la Fracción D. De ahí enriquecido ( "positivo") y empobrecido ( "negativo"), en este ejemplo podemos enriquecer las células de unión en torno 7 veces y logra una pureza del 4% en la fracción enriquecida.
La Figura 2b muestra la especificidad de la reacción a partir de sangre de un sujeto que habían sido vacunados ~ 3 años antes. Cuando añadimos un exceso de 50 veces (50 M) no marcado de toxoide tetánico a las células antes de adición del antígeno biotinilado (Fracción B) que son capaces de bloquear la unión en un 83%, lo que demuestra la especificidad de unión al antígeno. Cuando omitimos antígeno biotinilado del procedimiento (Fracción C), un número pequeño (~ 0,2%) de las células B obliga todavía; esta pequeña fracción de las células B, presumiblemente refleja la unión a algunos no antígeno en el adsorbente, tal como el tinte de estreptavidina-rojo lejano fluorescente, el anticuerpo anti-colorante rojo lejano fluorescente o las perlas magnéticas.
Para demostrar el uso del método para analizar los cambios en el fenotipo celular después de la inmunización de unión al antígeno que mostramos en la figura 3 la frecuencia de células B Tet-Tox-específicas en la ingenua, la memoria, y las poblaciones plasmablasto en la sangre extraídas antes y 7 días después del refuerzo vacunación de un sujeto sano. Mientras que el porcentaje de células B vírgenes entre el total de células Tet-Tox de unión B se redujo de 84% a 64% después del refuerzo, el porcentaje de memorpoblaciones y y plasmablasto entre las células Tet Tox-reactivos totales aumentaron del 16% al 36% y 0% a 40%, respectivamente. La Figura 3b muestra los datos de ELISPOT representativos de la sangre periférica de los 7 días después del refuerzo sujetos sanos. Aislamiento de las células B Tet-Tox de unión llevó a enriquecimiento 4 veces en el anticuerpo toxoide tetánico frecuencia de células secretoras.
Figura 1: Método de detección y enriquecimiento de toxoide tetánico (Tet Tox) unión a células B. (A) Protocolo para el enriquecimiento y aislamiento de células B Tet-Tox-unión. (B) Esquema del adsorbente empleado para identificar y enriquecer las células B Tet-Tox-unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2: citogramas representativos que demuestran el enriquecimiento de las células B Tet Tox de unión a partir de sangre periférica humana. (A) de citogramas enriquecido y empobrecido células B Tet-Tox reactivos de células B totales Tet-Tox-reactivos de la fracción D de un sujeto normal últimos 10 años vacunados> previamente Fracción A y. (B) citogramas de PBMCs de las poblaciones "positivos" de un sujeto vacunado ~ 3 años antes y enriquecido como en A (fracción A), después de la preincubación con un exceso de 50 uM sin marcar Tet-tox (Fracción B), o enriquecido con Tet-Tox-biotina omitido durante el procedimiento (Fracción C). Todos los análisis fueron cerrada en los linfocitos CD19 +. Los porcentajes representan el porcentaje de células Tet-Tox-de unión de todas las células B (CD19 +) en la fracción final.ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de análisis post-enriquecimiento de células de unión al antígeno. (A) Representante análisis de citometría de flujo de fenotipo celular después de enriquecimiento de las células B Tet-Tox de unión. Citogramas representan identificación y análisis de ingenuo Tet-Tox-reactiva (CD27 -), memoria (CD27 +), y plasmablastos (CD27 CD38 ++ ++) en las subpoblaciones de células B de un sujeto antes y 7 días después de la vacunación de refuerzo contra el tétanos. Todas las células fueron cerrada en los linfocitos CD19 + de las poblaciones "positivos" enriquecidos. (B) análisis representativo ELISPOT de anticuerpo secretor de células en enriquecidos, agotados, y las fracciones totales de células B no acondicionadas a partir de sangre periférica de un sujeto sano 7 días después de boost. Para el ensayo ELISPOT, los pocillos de una placa de 96 pocillos se revistieron primero con una solución / ml 10 g de toxoide tetánico. diluciones en serie de dos veces de las suspensiones de células se hicieron en los pozos (en toda la placa) a partir de las células a la misma concentración de las fracciones no acondicionadas enriquecidos, agotadas, y total. Se detectaron las células secretoras de anticuerpos Anti-tétanos con biotinilado anti-humano IgG (H & L), seguido por estreptavidina-AP. La placa se desarrolló con tampón de desarrollo de ELISPOT y se detuvo la reacción mediante lavado de la placa tres veces con H bidestilada 2 O. Se determinó el número de manchas en una dilución de células en el intervalo lineal, y se calculó el número de ASC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí se describe un nuevo método para llevar a cabo el aislamiento y enriquecimiento de células B de unión a antígeno de la sangre periférica humana. El método es fácilmente aplicable a los ratones y a otros tejidos, tales como el bazo y los ganglios, y es compatible con el análisis post-enriquecimiento de fenotipo y la función celular (manuscrito en preparación).
El usuario debe tener en cuenta una serie de variables que pueden afectar el éxito de este procedimiento. Por experiencia células muertas tienden a adherirse a las perlas magnéticas y "tomar" tintes fluorescentes, tales como el tinte de estreptavidina-rojo lejano fluorescente, lo que lleva a un aumento de fondo no específica. Es fundamental para eliminar la mayor cantidad de células muertas de muestras como sea posible antes de comenzar este procedimiento. El uso de colorantes que permiten la discriminación en vivo / muerto a la puerta a las células muertas del análisis puede ser útil, pero la presencia de células muertas puede comprometer la interpretación de la prueba de anticuerpos que secretan la frecuencia de células ysiguiente función de transferencia adoptiva.
Además, hemos encontrado que una cuidadosa valoración del antígeno biotinilado añadido es esencial para distinguir el antígeno específico y la unión no específica. El uso de demasiado poco antígeno conducirá a una subestimación de la frecuencia de células de unión al antígeno, mientras que un exceso de antígeno puede causar falsa detección / enriquecimiento positivo. El uso de concentraciones de antígeno que son demasiado altos pueden puede ser indicado por aparente de unión a las células no-B en las muestras. Además, la detección aparente de una frecuencia demasiado alta (> 1%) de células reactivas a antígenos puede ser una indicación de emisión especificidad de unión. El objetivo final al determinar la cantidad óptima de antígeno a usar es añadir un poco más de antígeno que está presente en concentraciones fisiológicas, tal que la mayoría de los receptores de las células B con una afinidad de <10 -6 M, por ejemplo, para el antígeno están saturados. Esto asegura que las células B específicas de antígeno son bEING detectado con una afinidad que tiene un potencial patógeno. Además de muy poco antígeno, es decir, en o por debajo de las concentraciones fisiológicas, puede conducir a la detección de muy pocas células B específicas de antígeno debido a la disminución de la ocupación de los antígenos BCR. Por otro lado, la adición de un exceso de antígeno, muy por encima de las concentraciones fisiológicas, puede conducir a un aumento de la unión no específica que incluirá las células B con una baja afinidad por el antígeno (> 10 -6 M) y en realidad son ignorantes del antígeno in vivo. Por lo tanto, es vital para titular por primera vez el antígeno biotinilado a través de algunos registros con el fin de estar seguros de que están siendo detectados sólo verdaderas células B reactivas al antígeno. Del mismo modo, se ha encontrado que el uso de tinte demasiado estreptavidina-rojo lejano fluorescente puede aumentar de fondo.
También es importante señalar que la biotinilación de antígeno puede afectar a la disponibilidad de los epítopos antigénicos. Por lo tanto, la optimización del uso de diferentes biotinilación se reunióhods pueden ser importantes. Alternativamente biotina se pueden acoplar a aminas primarias, aminas terciarias, sulfhidrilos, o grupos carboxilo. El uso de longitudes de brazo espaciador prolongados puede mejorar la disponibilidad epítopo al reducir el impedimento estérico.
Una de las limitaciones de esta técnica es su reducida eficacia para el enriquecimiento de las células B de unión al antígeno de criopreservados en comparación con las células frescas. Esto podría deberse a una mayor muerte celular y asociado "pegajosidad" de las muestras congeladas. No obstante, el método se puede aplicar a las muestras congeladas, pero es probable que sea importante no comparar directamente los resultados de enriquecimiento y análisis de células frescas y congeladas. Otra limitación es la pureza de las células B específicas de antígeno en la muestra enriquecida. Por experiencia, siempre hay algunas células que "tag along", que incluye tanto las células B no específicas y las células T. Esto es de esperar, dada la rareza de la población de células en está tratando de enriquecer. Sin embargo, la pureza de tél células pueden ser aumento, asegurando que se obtiene una suspensión de células antes de añadir las células a la columna, enriqueciendo una segunda vez en una nueva columna, o por clasificación FACS las células B específicas de antígeno. Dependiendo del tipo de estudio, el investigador puede decidir qué opción es mejor y si es necesario.
Como hemos optimizado esta técnica nos imaginamos que sería susceptible de discriminación de alta afinidad frente a las células de antígeno reactivo de baja afinidad basados en la valoración antígeno o intensidad de la tinción. Sin embargo, en un estudio anterior, demostramos células B de antígeno reactivo con hasta una diferencia de 1.000 veces en la afinidad a su antígeno fueron enriquecidos igualmente usando este método 7. Por lo tanto, se requiere la medición formal de la afinidad de células enriquecidas usando análisis de resonancia de plasmón de superficie de receptores de antígenos recombinantes expresados si el conocimiento de la afinidad es pertinente para el estudio.
Inherente a esta técnica es la limitación que la adición del antígeno biotinilado y estreptavidina puede activar las células por reticulación de la BCR. Esto podría suponer un problema para determinados ensayos funcionales posteriores, como las que tratan de comparar las células estimuladas con un control en reposo. Este problema puede ser mitigado por mantenimiento de las muestras de control fría para evitar la transducción de señales. También es posible que las señales del BCR podrían afectar a una respuesta biológica en curso. De la experiencia antígenos de células enriquecido mantienen su capacidad de secretar anticuerpos, como se indica por el análisis ELISPOT (Figura 3b) y funcionan como células presentadoras de antígeno a las células T in vitro y después de la transferencia adoptiva en ratones (datos no presentados). Una última limitación de esta técnica es el uso de anticuerpos anti-fluorochome para llevar a cabo la unión a células de antígeno adsorbido nanopartícula. Anti- colorante rojo lejano fluorescente reacciona de forma cruzada con ciertos fluorocromos estructuralmente relacionados, incluyendo Cy7 y Cy5.5. Esto puede limitar las opciones oconjugados de anticuerpo F disponibles para la medición de marcadores fenotípicos. Sin embargo, con el aumento de la disponibilidad de nuevos fluorocromos, esto se está convirtiendo en un problema menor.
El uso de este método de detección y enriquecimiento, es posible identificar fácilmente las células B de unión a antígeno en ex vivo de sangre periférica, el bazo, o de otros tejidos. Este método es particularmente útil en el estudio de la respuesta inmune de las células reactivas a antígenos después de la inmunización o la exposición a los antígenos extraños y en el contexto de la enfermedad autoinmune. Aunque no existe un método para detectar células B reactivas al antígeno ha demostrado ser sin sus defectos, este método es rápido, simple, y produce una pureza relativamente alta, el rendimiento, y el enriquecimiento de las células reactivas al antígeno que puede acoplarse a una variedad de aguas abajo ensayos. Además, debido a los principios básicos del método, este procedimiento podría fácilmente ser adaptado a una variedad de necesidades experimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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