Summary
機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。
Introduction
限界希釈する抗体分泌細胞の前駆体頻度の分析は、特定の抗原に対して反応性B細胞は、典型的には、ワクチン接種の状態と抗原上に存在するエピトープのサイズ/数に応じて、通常のレパートリーは0.05〜0.005％の頻度で起こることを示唆しています。これらの細胞の低頻度は、それが難しいような外来抗原、または自己免疫の開発中に、次のワクチン接種または暴露のような免疫応答の開発中にその状態の変化を研究するために作られました。以前に、研究者らは、抗原被覆プレートまたはカラムの吸着剤から、抗原でコーティングされた赤血球のリセットに、1、2、3、4、5を蛍光活性化細胞選別、6の範囲の技術を用いて抗原反応性B細胞の単離を行っています。 Thougこれらの技術は、抗原反応性B細胞を同定及び単離に成功している時間は、その結果は、収率、純度およびスケーラビリティの点で変化しています。最近では、両方の検出および磁性ナノ粒子を用いた希少なBリンパ球亜集団を豊かにする新規な方法を開発しました。この方法は、大きな始動集団からの比較的高い収率および純度で濃縮を可能にし、抗原に対する応答の解析と互換性があります。懸濁液中の細胞の集団から豊かにすることで、この方法は、抗原をコーティングしたプレートまたは列、および限界スループットのジオメトリに関連付けられている制約を排除します。濃縮された細胞は、抗原および蛍光レポーターに関連付けられたままであるので、最終的に、彼らはさらに、FACS選別によって精製することができます。本明細書に記載するように、私たちは前に、末梢血破傷風トキソイド反応性B細胞の研究のために、このアプローチを使用し、様々なautoiを有する被験者からヒト被験者の免疫化、ならびに自己反応性B細胞を、次のしています1型糖尿病、バセドウ病、橋本病7を含むmmune障害、。この方法は、マウスおよびヒトで同様に動作し、種々の組織（原稿準備中）からの抗原反応性B細胞の解析と互換性があります。
その基本的な形式では、末梢血単核細胞を、最初に表現型分析のために必要な表面抗原、細胞に対する抗体と一緒にビオチン化抗原と共にインキュベートします。この標識工程は、洗浄及び固定に続いて、ストレプトアビジンを添加する（ 図1）ビオチン化抗原結合細胞の検出のための遠赤色蛍光色素に結合されています。以前の研究は同様に、抗原特異的B細胞を同定したが、直接蛍光色素8、9、10、11に結合させた抗原を用いています。これは価値があるが、アプローチは、ストレプトアビジンと組み合わせたビオチン化抗原の使用は、抗原は12、13、14小さい場合は特に、大きな信号増幅（結合および非結合細胞の、したがってより良い差別化）を可能にします。追加の考慮事項は、ストレプトアビジンの代わりにストレプトアビジンが脱グリコシル化されているので、非特異的結合を減少させるの使用です。さらに、我々は、その光安定、量子収率（明るさ）、およびその小さなサイズ（〜1.3キロダルトン）に蛍光色素として遠赤蛍光染料を使用しています。彼らは潜在的に多くの抗原性エピトープを含んでいるので、このようなフィコエリトリン（〜250キロダルトン）およびアロフィコシアニン（〜105 kD）の15のようなタンパク質の蛍光色素は最適ではありません。このような遠赤色蛍光色素として、単一のエピトープからなる小有機蛍光色素の使用は、単離された細胞集団の複雑性を低減します。
細胞がされるとビオチン化-Antigenと遠赤蛍光色素 - ストレプトアビジン吸着は、それらが抗遠赤蛍光色素結合磁性ナノ粒子を使用して濃縮されています。シングルナノ粒子は、ほとんどのフローサイトメーターによって検出されていないため、FACSソーティングと下流のアッセイ16による精製の前に除去する必要はありません。抗原特異的なB細胞のための磁気選択、フローサイトメーターを使用して稀なイベントを選別する時間とコストを排除する、関心の集団を濃縮します。
我々は前と7日破傷風トキソイドの追加免疫後に被験者からの破傷風トキソイド特異的B細胞の濃縮から代表的な結果を示し、以下に。我々は、in vivo刺激における急性以下の抗原特異的B細胞を濃縮するために、この方法の能力を実証するために、一例として、この特定のアプリケーションを選択しました。フローサイトメトリーと組み合わせると、この方法は、抗原特異的ナイーブ、メモリを濃縮し、分化することが可能であり、かつ形質B細胞および研究者が時間をかけて自分の周波数の変化に追従することができます。また、我々は、 例えば、細胞は、濃縮後の抗体を分泌する能力を保持することを実証するELISPOTアッセイ、別の可能な下流アッセイを含みます。この方法の別の用途は、宿主に濃縮された細胞の養子移入を伴う可能性があります。我々は以前に、細胞が単離および転送次抗原特異的T細胞を抗原提示細胞として作用する能力を維持示した（データ示さず）。したがって、一緒に抗原特異的免疫応答の理解を通知する方法、に結合することができる可能な下流アッセイの数があります。我々は全体の収率、純度、細胞特異性、および折り畳み式濃縮を決定するための制御を含む、以下の方法を、記載しています。
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Protocol
ヒトPBMCの1の単離
- ヘパリン処理した採血管を用いて血液30〜50ミリリットル集めます。
注：使用される血液の量は、目的の抗原特異的B細胞の血液中の特定の実験的な質問と周波数に依存します。ヘパリン化血液はすぐに処理されるか、または翌日処理するために、室温で一晩穏やかに揺動させることができます。処理の遅延は、濃縮の効率にはほとんど影響があり、生存能力の最小の損失と関連しています。 - 無菌、室温マグネシウムおよびカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1：全血1を混ぜます。
- 50ミリリットル滅菌コニカルチューブで、室温密度勾配溶液10mlを加えます。 4℃で暗所で開かれた密度勾配ボトルを保管しますが、使用前に室温に温めます。
- 可能であれば、ゆっくりと遅い設定にピペットガンを設定し、および/または非常に少ない、まだ一貫性を適用し、トリガ圧2を混ぜないように注意しながら、密度勾配の上に希釈した血液30〜35ミリリットル層。
注：希釈血液を添加しながら、50ミリリットルの円錐形の端にピペットの先端を配置するには、一貫性のある安定した流れを確保するのに役立ちます。 - ブレーキと20℃で30分間、400×gで遠心分離がオフになっています。
- 以下の単核細胞層を乱さないように注意しながら、血漿および血小板が含まれている上層を、削除します。
- 滅菌ピペットを用いて、単核細胞層（軟膜）を収集し、別々の滅菌50mlコニカルチューブに配置します。
- 50ミリリットルの体積に細胞懸濁液にPBSを追加します。ブレーキと20℃で10分間、400×gで遠心分離します。
- 上清を除去し、10mlのPBSでペレット化した細胞を再懸濁します。細胞を計数し、血球計または自動細胞カウンターを用いて生存率を測定。
- さらなる処理のための直前まで、10 7細胞/ mlで、氷上での場所で細胞を再懸濁し。
細胞の2染色
- 該当する場合は、必要に応じて各蛍光補正/ FMOの制御のために1〜2×10 6個の細胞を除去します。ブレーキと4℃で10分間、400×gで細胞の遠心分離余り。
- 3-6×10 7細胞/ mlで滅菌濾過し、冷FACS緩衝液（PBS + 1％ウシ血清アルブミン（BSA）+ 0.01％アジ化ナトリウム）中で再懸濁細胞を（1.5 ml遠心チューブに取り除きます）。 FACS緩衝液が冷えていることを確認し、染色手順を通じて氷上に保管してください。
- アッセイを最適化する際に四分の（AD）への細胞集団を分割します。濃縮/染色の特異性を決定するために、関心、使用画分BとCの抗原特異的B細胞を濃縮するために、画分Aを使用して、抗原特異的細胞の頻度および数を決定するために、使用画分D（2.5以下2.6を参照のこと）利回りの計算を可能にし、折り畳み式濃縮をする未濃縮集団。
- 人間のFcγR遮断再追加Fc受容体に対する抗体の結合を防ぐために、氷の上での分画のADへの薬剤。
注：適切な条件については、製造元の指示に従ってください。 - クロスする蛍光色素を含まないように注意しながら、暗所で氷上で30分間の分画のADへの関心の細胞表面抗原に対する蛍光標識抗体を加えるには、磁性ナノ粒子に結合した抗遠赤蛍光色素抗体と反応します。
注：これらは、近赤外蛍光色素、Cy5を、Cy5.5標識、及びCy7のに抗体複合体が含まれます。追加された生存能力の汚れは固定液の使用に適合するものでなければなりません。一つELISPOTによって、例えば、FACSを用いて細胞を分析したが、抗体分泌周波数を決定することを意図していない場合は、抗体を用いた表面染色は不要です。 - アッセイの特異性を試験氷上で30分間、未標識の抗原の十分な量の画分Bをインキュベートし、その結果の親和性を有する受容体の大部分は、少なくとも10 -6 Mはブロックされます。
注：一般的に、良い出発濃度（ 例えば 50〜100μM）を下回る2.6で十分とみなされる抗原の量の50から100倍過剰です。これは、このように濃縮された細胞の特異性の確認を可能にする、以下のステップ2.6で添加されるビオチン化抗原に結合する非標識抗原に対して高い親和性を有する任意のB細胞を阻止すべきです。このステップは、ステップ上記2.4と組み合わせて完成させることができます。 - 30分間氷上で画分A、B、およびDインキュベートにビオチン化抗原を追加します。
注：ビオチン化抗原の濃度は、適切な検出および非特異的バイスタンダー細胞から結合細胞の分離を確実にするために必要とされる最適量を決定するために滴定されるべきです。典型的には、テストに良い出発濃度は1〜5μMです。
注：画分AとDの場合、このステップは、ステップ上記2.4と同時に行うことができます。画分Bの場合は、このステップはbetwのステップ2.5（洗浄後に行われるべきですEENステップ）が不要です。 - そのようなストレプトアビジン遠赤蛍光色素や磁性ビーズなどのプロトコルで他の試薬へのB細胞の結合を決定するために、画分Cからのビオチン化抗原を省略します。
- 4℃で5分間、400×gでの冷FACSの5×10 7個の細胞当たりのバッファと遠心分離の1ミリリットル中に細胞懸濁液により細胞を2回洗浄します。
- 最終洗浄後、5×10 7個の細胞当たり1ミリリットルの2％ホルムアルデヒド中で濃縮された細胞懸濁液を希釈し、5分間氷上で暗所に放置します。
注：この時点で細胞の固定は、ビオチン化抗原は、手順の残りのためのBCRに結合したままであることが保証されます。生細胞について - 下流の分析のために、このようなELISPOTSまたは養子の転送のように、固定工程を省略します。 - 4℃で5分間、400×gで二回コールドFACSの5×10 7個の細胞当たりのバッファと遠心機の1ミリリットルで細胞を洗浄。 1ミリリットル中に再懸濁し、5×10あたりの冷FACS緩衝液7細胞。
- 1-2μgのストレプトアビジン - 遠赤蛍光色素/ mlの追加、暗所で20分間氷上でインキュベートします。各アプリケーションのためのストレプトアビジンの量を滴定します。
- 4℃で5分間、400×gで1ミリリットルの冷FACSの5×10 7個の細胞当たりのバッファと遠心で細胞を2回洗浄します。それは、磁気ビーズを使用して濃縮を受けないように、画分Dの調製は、この時点で終了します。
注：このサンプルは、サンプル中の抗原特異的B細胞の頻度および数を決定するために使用されます。これは、濃縮することにより達成-濃縮を倍収量を決定するために使用されます。
3.磁性ナノ粒子ベースの濃縮
- 5×10 7個の細胞当たりの冷分離緩衝液の1ミリリットル（PBS + 0.5％BSA + 2mMのEDTA）中のサンプルACからの細胞を再懸濁し、カラムを詰まらせる可能性の塊を除去するために40μmのフィルターを通過します。
- アンチのCy5 /アンチ遠赤蛍光色素ナノ粒子を追加します。フォー最適な結果をR、ナノ粒子の濃度は、それぞれの使用のために滴定されるべきであるが、良好な出発点は、5×10 7細胞/ ml当たり50μlの懸濁液です。 10分間、4℃で暗所に回転させます。
- 4℃で5分間、400×gでで1 mlの冷分離緩衝液で2回洗浄します。 5×10 7個の細胞当たりの冷分離緩衝液1ml中の細胞を再懸濁し。
LSまたはLDカラムを用い4.磁気濃縮
- 磁気分離器の磁場中で3 LSまたはLD列を配置し、列を濡らす分離緩衝液の3ミリリットルを追加（列の型が最適であるかを決定するには製品の説明を参照してください）。すべての3ミリリットルがカラムを通過し、収集した後に破棄できるようにします。
注：磁性ナノ粒子の分離標識された細胞は、市販されている磁気分離装置のいずれかを使用して達成することができるが、実験室ではTEに、LSカラムを用いて、最も成功を収めています濃縮の収率、純度、および効率のrms。 - 列の下、マイナスに選択したセルのために標識3 15ミリリットルコニカルチューブ「画分A /（B）/（C）負」を配置します。それぞれの列に磁性粒子標識細胞を追加し、ボリューム全体を通過させます。
- 上に冷たい分離バッファーの3ミリリットルを追加し、これはカラムを通過し、2ミリリットルで繰り返すことができます。負の選択された細胞を収集し、氷上に取っておきます。
- 磁場から列を削除し、積極的に選択したセルのための「画分A /（B）/（C）正」は、標識された15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。
- 約6ミリリットル分離緩衝液ので先頭に列を記入し、すぐに提供するプランジャーを用いた磁気フィールドにバインドした細胞を収集するために、カラムを介してこのボリュームを急落。
- 純度を高めるために、積極的に選択された細胞は、さらにproceを繰り返し、第二の清浄なカラムを用いて濃縮することができますdure。
- 4℃で10分間、400×gで負及び正に選択された画分の両方を回転し、所望の最終容積に懸濁します。このようなFACS、ELISPOTまたは養子移入として、下流の分析を進めてください。
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Representative Results
純度、収量の分析、および倍富化フローサイトメトリーを用いて、
必然的に、ストレプトアビジン遠赤蛍光色素を結合しなかったが、マトリックス中に捕捉されている混入細胞が含まれている上記のように濃縮された集団。これらの不純物は、FACSソーティングにより濃縮された集団から除去することができます。濃縮された集団の純度を推定するために、生細胞にゲートが前方および側方散乱に基づいて、および/または生/死染色と遠赤蛍光染料+細胞頻度を分析します。この後者のゲート内の割合は、純度の指標です。これらの細胞の特異性および抗原親和性のさらなる分析は、発現された免疫グロブリン遺伝子および組換え抗体産生および分析のクローニングおよび配列決定に続いて、単一細胞のFACSソーティングを必要とします。
収量は、単離されたantigeの数を指し出発集団（画分D）における数に対する画分に回収B細胞N結合。同数の細胞は、画分Aと画分Dにあったので、一つは直接収量（画分中の抗原結合B細胞画分Dにおける抗原結合B細胞の÷位の＃）を決定することができます。
倍富化（E）は、「積極的に」富化された画分中の遠赤色蛍光色素+ B細胞のパーセンテージこの値は、によって達成抗原特異的B細胞の比例的増加を示す画分Dのそれと比較することによって反射されますナノ粒子の濃縮。値は以下の式を用いて求めることができます。
この手法を実証するために、我々は、モデルとして破傷風トキソイド（テト・トックス）を用いて得られた代表的な結果を示します抗原が検出し、様々な時点で破傷風の予防接種をされた被験者の末梢血中のTet-トックス反応性B細胞を濃縮します。 図1は、方法および抗原吸着の概略図です。 図2aは、十年以上前に破傷風の予防接種を受け最後の個体からのTet-トックス反応性B細胞の頻度を示しています。この例では、我々は周りによって結合細胞を濃縮することができ、画分Aおよびしたがって画分DからのTet-トックス特異的B細胞のベースライン周波数から（「陰性」）（「正」）富化および枯渇集団で示します7倍および富化された画分の4％の純度を達成します。
図2bは、2〜3年前にワクチン接種された被験者からの血液を用いて、反応の特異性を示します。我々はADDIT前のセルに非標識破傷風トキソイドの50倍過剰（50μM）を添加するとビオチン化抗原（画分B）のイオンは、我々は、抗原結合の特異性を示し、83％によって結合をブロックすることができます。我々は、手順（画分C）から、まだバインドされたB細胞の数が少ない（〜0.2％）をビオチン化抗原を省略した場合、 B細胞のこの小さな部分は、おそらく、そのようなストレプトアビジン - 遠赤蛍光色素、抗遠赤蛍光色素抗体または磁気ビーズのように、吸着剤にいくつかの非抗原への結合を反映しています。
免疫後の抗原結合細胞の表現型の変化を分析するための方法の使用を実証するために、我々は、図3にナイーブ、メモリ内のTet-トックス特異的B細胞、および形質の前に採取した血液中の集団と7日ブースター後の周波数を示しています健常者のワクチン接種。合計のTet-トックス結合B細胞間のナイーブB細胞の割合は、ブースト後64％に84％から減少し、MEMORの割合総テトトックス反応性細胞間のyおよび形質集団は、それぞれ、40％に36％と0％に16％から増加しました。 図3bは、7日後にブースト健常人の末梢血からの代表的なELISPOTデータを示します。 Tet-トックス結合B細胞の単離は、破傷風トキソイド抗体分泌細胞の頻度の4倍の濃縮をもたらしました。
図1：検出およびB細胞を結合性破傷風トキソイド（テトトックス）の濃縮のための方法。 Tet-トックス結合B細胞の富化および単離のための（A）プロトコル。 Tet-トックス結合B細胞を同定し、濃縮するために用いられる吸着剤の（B）図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：ヒト末梢血からのTetトックス結合B細胞の濃縮を実証する代表的サイトグラム。濃縮されたの（A）サイトグラムと> 10年前にワクチン接種を受け、最後の正常な被験者からフラクションDから画分AからのTetトックス反応性B細胞および合計のTetトックス反応性B細胞を枯渇。 〜3年前にワクチン接種および50μMの過剰のプレインキュベーションは、テト-TOX（画分B）を非標識、または濃縮した後、（画分A）のように濃縮された被写体からの「正」の集団からのPBMCの（B）サイトグラム手順（フラクションC）中に省略したTet-トックスビオチンと。全ての分析は、CD19 +リンパ球上にゲートしました。パーセンテージは、最終的な画分中のすべてのB細胞（CD19 +）のテト-トックス結合する細胞のパーセントを表します。ANK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：抗原結合細胞の後の濃縮分析の例。 （A）はTet-トックス結合B細胞の濃縮後の細胞表現型の代表的なフローサイトメトリー分析。前と7日破傷風ブースターワクチン接種後、メモリ（CD27 +）、および対象のB細胞亜集団における形質（CD27 ++ CD38 ++） -サイトグラムはテト-トックス反応ナイーブ（CD27）の識別と分析を示しています。すべての細胞が濃縮された「正」の集団からCD19 +リンパ球にゲートしました。 （B）7日後のBO健常人の末梢血から濃縮、枯渇、および総未濃縮B細胞画分における抗体分泌細胞の代表的なELISPOT分析OST。 ELISPOTアッセイのため、96ウェルプレートのウェルを最初破傷風トキソイドを10μg/ mlの溶液でコーティングしました。細胞懸濁液の2倍連続希釈液を、濃縮された枯渇、および総未濃縮画分から同じ濃度で細胞から始まる（プレート全体）のウェルで行いました。抗破傷風抗体分泌細胞をストレプトアビジンAP、続いてビオチン化抗ヒトIgG（H＆L）を用いて検出しました。プレートは、ELISPOT開発緩衝液で現像し、反応物を再蒸留H 2 Oでプレートを3回洗浄することにより停止した直線範囲内の細胞希釈でスポット数を決定し、そしてたASCの数を算出しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、ヒト末梢血由来の抗原結合性B細胞の単離および濃縮を達成する新規な方法を記載します。この方法は、マウスに、そのような脾臓およびリンパ節など他の組織に容易に適用可能であり、細胞表現型および機能（原稿準備中）の後濃縮分析と互換性があります。
ユーザーは、この手順の成功に影響を与えることができる変数の数を認識すべきです。経験から死んだ細胞は、非特異的バックグラウンドの増加につながる、磁気ビーズに付着し、そのようなストレプトアビジン遠赤蛍光色素などの蛍光色素を、「取る」する傾向があります。この手順を開始する前に、可能なサンプルから、などの多くの死細胞を除去することが重要です。分析からゲートアウト死細胞の生/死の判別を可能に汚れの使用が役に立つかもしれないが、死んだ細胞の存在は、細胞頻度を分泌する抗体のアッセイの解釈を損なう可能性があり、および養子移入次の関数。
また、我々は、追加されたビオチン化抗原の注意深い滴定は、抗原特異的および非特異的結合を区別するために不可欠であることを見出しました。あまりにも多くの抗原が偽陽性検出/濃縮を引き起こす可能性がありながら、あまりにも少ない抗原の使用は、抗原結合細胞の頻度の過小評価につながります。高すぎる月である抗原濃度の使用は、サンプル中の非B細胞の見かけの結合によって示すことができます。さらに、抗原反応性細胞の過度に高い周波数の見かけの検出（> 1％）の結合特異性に問題がある可能性があります。究極の目標を使用するための抗原の最適量を決定する際に生理的濃度で存在するよりも少し多くの抗原を追加し、そのような<10 -6 M、例えば、のための親和性を有するB細胞レセプターの大半こと抗原が飽和しています。これは、抗原特異的B細胞は、Bであることを保証します病原性の可能性を秘めている親和性で検出eing。少なすぎる抗原の添加、 すなわち 、生理的濃度で以下に、のBCRの抗原占有の減少に起因する非常に少数の抗原特異的B細胞の検出をもたらし得ます。一方、はるかに生理的濃度を超えるすぎる抗原の添加は、抗原（> 10 -6 M）に対して低い親和性を有するB細胞を含む、実際の抗原の無知であるれる増加し、非特異的結合をもたらすことができます生体内インチしたがって、最初だけで、真の抗原反応性B細胞が検出されていることを確信するために、いくつかのログを横断ビオチン化抗原を滴定することが重要です。同様に、我々は、あまりにも多くのストレプトアビジン - 遠赤色蛍光色素の使用は、バックグラウンドを増加させることができることを見出しました。
抗原のビオチン化は、抗原性エピトープの利用可能性に影響を与えることができることに留意することも重要です。したがって、異なるビオチン化を用いた最適化が満たさhodsは重要であるかもしれません。あるいはビオチン第一級アミン、第三級アミン、スルフヒドリル、またはカルボキシル基に結合することができます。拡張スペーサーアームの長さの使用は、立体障害を減少させることによって、エピトープの可用性を向上させることができます。
この技術の限界の一つは、新鮮な細胞と比較して、凍結保存からの抗原結合B細胞の濃縮のために低減効果です。これは、より大きな細胞死および凍結サンプルで関連する「粘着性」に関連する可能性があります。それにもかかわらず、この方法は、凍結試料に適用することができますが、直接新鮮凍結細胞の濃縮および分析からの結果を比較することはないだろうが重要です。別の制限は、濃縮されたサンプル中の抗原特異的B細胞の純度です。経験から、いくつかのセルが常に存在すること」に沿っタグ」、これは非特異的なB細胞およびT細胞の両方を含みます。これは、豊かにしようとしている上での細胞集団の希少与え予想されます。しかしトンの、純度彼の細胞は、単一細胞懸濁液を新しいカラムに、または抗原特異的B細胞をFACS選別によって、第2の時間を濃縮、カラムに細胞を添加する前に得られることを確実にすることによって増加することができます。研究の種類に応じて、オプションを決定することができる研究者が最良であるか否か、それが必要です。
私たちはこの技術を最適化されたとして、我々は、それが抗原滴定または染色強度に基づいて、低親和性抗原反応性細胞に対する高い親和性の差別の影響を受けやすいであろうと想定しました。しかし、以前の研究では、我々はそれらの抗原に対する親和性の千倍の差までと抗原反応性B細胞が均等にこの方法7を使用して濃縮した示しました。親和性の知識は、研究に適切である場合したがって、発現された組換え抗原受容体の表面プラズモン共鳴分析を用いて、濃縮された細胞の親和性の正式な測定が必要です。
この技術に内在リットルですビオチン化抗原とストレプトアビジンの添加はBCRを架橋することによって細胞を活性化することができることを模倣。これは、安静時のコントロールに刺激された細胞を比較しようとするものなど、特定の下流の機能アッセイのための問題を引き起こす可能性があります。この問題は、信号の伝達を防止するために、冷対照試料を保持することによって軽減することができます。 BCRシグナルが進行中の生物学的応答に影響を与える可能性もあります。経験抗原富化細胞から（データは示していない）マウスに、インビトロおよび養子免疫伝達後のT細胞への抗原提示細胞としてELISPOT分析（ 図3b）との関数で示されるように、抗体を分泌するそれらの能力を維持します。この手法の最終的な限界は、抗原吸着細胞に結合するナノ粒子を達成するために、抗fluorochome抗体の使用です。抗遠赤蛍光色素がCy7のとCy5.5の含む特定の構造的に関連する蛍光色素、と交差反応します。これは、Oオプションを制限することができます表現型マーカーの測定のために利用可能なF抗体複合体。しかし、新しい蛍光色素の可用性を向上させると、これはあまり問題になってきています。
この検出および濃縮方法を用いて、容易にex vivoで末梢血、脾臓、または他の組織中での抗原結合B細胞を同定することが可能です。この方法は、外来抗原に対する自己免疫疾患の設定において免疫または曝露後の抗原反応性細胞の免疫応答を研究する上で特に有用です。抗原反応性B細胞を検出するためのいかなる方法が故障なしであることが証明されていないが、この方法は、迅速簡単であり、比較的高純度、収率、および下流の様々に結合することができる抗原反応性細胞の濃縮を生成しますアッセイ。さらに、この方法の基本原理のため、この手順を容易に実験的ニーズの多様に合わせて調整することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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