Summary
Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l'analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.
Introduction
Dilution limitante analyse de la fréquence des précurseurs de cellules sécrétant des anticorps ont suggéré que les cellules B réactives à un antigène particulier se produit typiquement à une fréquence de 0,05 à 0,005% dans le répertoire normal, en fonction de l'état de vaccination et de la taille / nombre d'épitopes présents sur l'antigène. La faible fréquence de ces cellules, il a été difficile d'étudier l'évolution de leur état au cours du développement de réponses immunitaires, telles que la vaccination ou après une exposition à un antigène étranger, ou au cours du développement de l'auto-immunité. Tri 1, 2, 3, 4, 5, 6 cellules Auparavant, les chercheurs ont entrepris l' isolement des lymphocytes B de l' antigène réactif en utilisant des techniques allant de l' antigène revêtu des plaques ou des adsorbants des colonnes, à des globules rouges remise à zéro de l' antigène revêtu, à activé par fluorescence. though ces techniques ont réussi à identifier et isoler les cellules de l'antigène réactif B, les résultats ont varié en termes de rendement, la pureté et l'évolutivité. Récemment, nous avons développé une nouvelle méthode à la fois de détecter et d'enrichir rares sous-populations de lymphocytes B en utilisant des nanoparticules magnétiques. Le procédé permet l'enrichissement avec un rendement relativement élevé et la pureté des grandes populations de départ, et est compatible avec l'analyse des réponses à l'antigène. En enrichissant des populations de cellules en suspension, le procédé élimine les contraintes qui sont associées à la géométrie des plaques ou des colonnes recouvertes d'antigène, ce qui limite le débit. Enfin, étant donné que les cellules enrichies restent associées à l'antigène et d'un rapporteur fluorescent, ils peuvent être en outre purifiés par tri FACS. Comme décrit ici, nous avons utilisé cette approche pour l'étude des cellules périphériques du tétanos du sang anatoxine réactif B avant et après la vaccination des sujets humains, ainsi que les cellules de autoantigène réactif B des sujets avec différents autoitroubles mmune, y compris le diabète de type 1, la maladie de Graves, et la maladie de Hashimoto 7. Le procédé fonctionne aussi bien chez la souris et l'homme, et il est compatible avec une analyse des cellules présentatrices d'antigène réactif B à partir d'une variété de tissus (manuscrit en préparation).
Dans son format de base, les cellules mononucléaires du sang périphérique sont d'abord mises en incubation avec un antigène biotinylé avec des anticorps dirigés contre des antigènes de surface cellule requis pour l'analyse phénotypique. Cette étape de marquage est suivie par le lavage et la fixation, et l' addition de streptavidine couplée à un colorant rouge lointain fluorescent pour la détection des cellules de liaison biotinylé antigène (figure 1). Des études antérieures ont permis d' identifier des cellules B spécifiques de l' antigène d'une manière similaire , mais en utilisant directement les antigènes conjugués à un fluorochrome 8, 9, 10, 11. Bien que ce soit un digneapproche, l' utilisation d'antigènes biotinylés en conjonction avec la streptavidine permet une plus grande amplification du signal ( et donc une meilleure différenciation des cellules non contraignantes de liaison et), en particulier lorsque les antigènes sont de petite taille 12, 13, 14. Une autre considération est l'utilisation de la streptavidine à la place de l'avidine, car streptavidine est déglycosylée, ce qui diminue la liaison non spécifique. En outre, on utilise un colorant rouge lointain fluorescent comme fluorochrome en raison de sa photostabilité, le rendement quantique (luminosité) et de sa petite taille (~ 1,3 kDa). Fluorochromes de protéines tels que la phycoérythrine (~ 250 kD) et allophycocyanine (~ 105 kD) 15 ne sont pas optimales , car ils contiennent potentiellement de nombreux épitopes antigéniques. Utilisation d'un petit colorant organique fluorescent composé d'un seul épitope, tel que le colorant rouge lointain fluorescent, réduit la complexité de la population cellulaire isolée.
Une fois que les cellules sont biotinylées-antigen et adsorbé de colorant streptavidine rouge lointain fluorescent, ils sont enrichis en utilisant des nanoparticules magnétiques colorant conjugué anti-rouge lointain fluorescentes. Nanoparticules uniques ne sont pas détectés par la plupart des cytomètres de flux et donc ne doivent pas être enlevés avant la purification par FACS de tri et les essais en aval 16. sélection magnétique pour des cellules spécifiques de l'antigène B enrichit la population d'intérêt, éliminant ainsi le temps et le coût du tri des événements rares en utilisant un cytomètre de flux.
Ci-dessous, nous montrons des résultats représentatifs de l'enrichissement des cellules spécifiques anatoxine tétanique B à partir d'un sujet avant et sept jours après la vaccination de rappel antitétanique. Nous avons choisi cette application particulière , par exemple , afin de démontrer la capacité de cette méthode pour enrichir les cellules spécifiques de l' antigène B suivantes aiguë dans la stimulation in vivo. Lorsqu'il est couplé avec la cytométrie de flux, ce procédé est capable d'enrichir et de différencier naïve mémoire spécifique à un antigène, etcellules et plasmablaste B permet au chercheur de suivre l'évolution de leur fréquence au fil du temps. En outre, nous avons inclus un autre dosage en aval possible, par exemple , un essai ELISPOT, ce qui démontre que les cellules conservent l'aptitude à sécréter un anticorps suivant l' enrichissement. Une autre application de cette méthode pourrait impliquer le transfert adoptif de cellules enrichies dans un hôte. Nous avons précédemment montré les cellules conservent l'aptitude à agir en tant que cellules présentant un antigène à des lymphocytes T spécifiques de l'antigène ci-après isolement et de transfert (données non présentées). Par conséquent, il existe un certain nombre d'essais possibles en aval pouvant être couplé à la méthode qui informe ainsi la compréhension de la réponse immunitaire spécifique d'un antigène. Nous avons décrit la méthode ci-dessous, y compris les contrôles pour déterminer le rendement global, la pureté, la spécificité cellulaire, et pliez-enrichissement.
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Protocol
1. Isolement de PBMC humaines
- Recueillir 30-50 ml de sang à l'aide de tubes de collecte de sang héparinisés.
NOTE: La quantité de sang utilisée dépend de la question expérimentale particulière et la fréquence dans le sang des cellules B spécifiques de l'antigène d'intérêt. sang héparinisé peut être traité immédiatement ou légèrement secoué pendant une nuit à la température ambiante pendant le traitement le jour suivant. Le retard dans le traitement a très peu d'effet sur l'efficacité de l'enrichissement et est associée à une perte minimale de viabilité. - Mélanger le sang entier 1: 1 avec stérile, du magnésium à température ambiante et exempte de calcium du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
- Dans un tube conique stérile de 50 ml, ajouter 10 ml d'une solution à gradient de densité à la température ambiante. Conserver les bouteilles de gradient de densité ouverts dans l'obscurité à 4 ° C, mais réchauffer à la température ambiante avant utilisation.
- Si possible mis le pistolet de pipette pour le réglage lent et / ou d'appliquer très peu, et pourtant cohérente pression de déclenchement lentementcouche de 30-35 ml de sang dilué sur le dessus du gradient de densité, en faisant attention de ne pas mélanger les deux.
REMARQUE: Placer la pointe de la pipette contre le bord des 50 ml conique tout en ajoutant le sang dilué contribuera à assurer un flux constant cohérente. - Centrifuger à 400 g pendant 30 min à 20 ° C avec le frein désactivé.
- Retirer la couche supérieure, qui contient le plasma et les plaquettes, en faisant attention à ne pas perturber la couche de cellules mononucléaires ci-dessous.
- En utilisant une pipette stérile, recueillir la couche de cellules mononucléaires (buffy coat) et placer dans un 50 ml tube conique stérile séparé.
- Ajouter du PBS à la suspension cellulaire à un volume de 50 ml. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec frein.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 10 ml de PBS. Compter les cellules et déterminer la viabilité en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
- Resuspendre les cellules à 10 7 cellules / ml et placer sur la glace jusqu'à ce prêt pour un traitement ultérieur.
2. coloration des cellules
- Retirer 1-2 x 10 6 cellules pour chaque compensation de fluorescence / contrôle FMO nécessaire, le cas échéant. reste centrifugeuse de cellules à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
- Resuspendre les cellules dans un tampon stérile filtré à froid FACS (PBS + 1% de sérum albumine bovine (BSA) + azoture de sodium 0,01%) à 3-6 x 10 7 cellules / ml (remove dans un tube de 1,5 ml par centrifugation). Assurez-vous que le tampon FACS est froid et le garder sur la glace tout au long de la procédure de coloration.
- Diviser la population de cellules en quarts (AD) lors de l'optimisation du dosage. Utilisez fraction A pour enrichir les cellules B spécifiques de l'antigène d'intérêt, l'utilisation des fractions B et C pour déterminer la spécificité de l'enrichissement / coloration (voir 2.5 et 2.6 ci-dessous), et l'utilisation fraction D pour déterminer la fréquence et le nombre de cellules spécifiques de l'antigène dans la population unenriched pour permettre le calcul du rendement et pliez-enrichissement.
- Ajouter FcyR re bloquant humainagent fractions AD sur la glace pour empêcher la liaison des anticorps aux récepteurs Fc.
REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour les conditions appropriées. - Ajouter des anticorps conjugués au fluorochrome à la cellule des antigènes de surface d'intérêt pour les fractions AD pendant 30 min sur de la glace dans l'obscurité, en faisant attention de ne pas inclure fluorochromes qui peuvent traverser réagir avec les anticorps de colorant anti-rouge lointain fluorescents couplés à des nanoparticules magnétiques.
NOTE: Ce sont des conjugués d'anticorps à infrarouge proche colorant fluorescent, Cy5, Cy5.5 et Cy7. Les taches de viabilité qui sont ajoutées doivent être compatibles avec l'utilisation d'un fixateur. Si l'on n'a pas l'intention d'analyser les cellules en utilisant FACS, mais de déterminer la fréquence d'anticorps sécrétant, par exemple, par ELISPOT, coloration de la surface avec des anticorps est inutile. - Pour tester la spécificité du test, incuber la fraction B avec une quantité suffisante d'antigène non marqué pendant 30 minutes sur de la glace, de telle sorte que la majorité des récepteurs avec une affinité d'au moins10 -6 M sont bloqués.
NOTE: En règle générale, une bonne concentration de départ est un 50-100 fois supérieure à la quantité d'antigène jugé suffisant en 2.6 ci - dessous (par exemple 50-100 uM). Cela devrait bloquer toutes les cellules B ayant une forte affinité pour l'antigène non marqué se lier à l'antigène biotinylé, qui est ajouté à l'étape 2.6 ci-dessous, permettant ainsi la confirmation de la spécificité des cellules enrichies. Cette étape peut être réalisée en conjonction avec l'étape 2.4 ci-dessus. - Ajouter antigène biotinylé à Fractions A, B et D. Incuber sur la glace pendant 30 min.
REMARQUE: La concentration d'antigène biotinylé doit être ajustée pour déterminer la quantité optimale requise pour assurer la détection et la séparation des cellules de liaison de cellules de voisinage non spécifique suffisante. Généralement, une bonne concentration de départ à l'essai est de 1-5 uM.
NOTE: Pour les fractions A et D, cette étape peut être réalisée simultanément avec l'étape 2.4 ci-dessus. Pour la fraction B, cette étape doit être effectuée après l'étape 2.5 (lavage à l'entrétapes een est inutile). - Omettre antigène biotinylé de Fraction C afin de déterminer toute liaison des cellules B à d'autres réactifs dans le protocole, comme colorant rouge lointain fluorescent streptavidine et les billes magnétiques.
- Laver les cellules deux fois par la suspension de cellules dans 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifugation à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Après le lavage final, diluer la suspension concentrée de cellules dans 1 ml de 2% formaldéhyde par 5 x 10 7 cellules et laisser reposer dans l' obscurité sur la glace pendant 5 min.
REMARQUE: La fixation des cellules à ce stade, en sorte que l'antigène biotinylé reste lié à la RCB pour le reste de la procédure. Pour les cellules viables - pour l'analyse en aval, par exemple dans ELISPOT ou les transferts adoptives, omettre l'étape de fixation. - Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans 1 ml FACS froid tampon par 5 x 107 cellules.
- Ajouter le colorant 1-2 pg streptavidine-rouge lointain fluorescent / ml et incuber sur de la glace pendant 20 minutes dans l'obscurité. Titrer la quantité de streptavidine pour chaque application.
- Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. préparation Fraction D est terminée à ce moment car il ne sera pas soumis à l'enrichissement en utilisant les billes magnétiques.
Remarque: Cet exemple sera utilisé pour déterminer la fréquence et le nombre de cellules B spécifiques de l'antigène dans l'échantillon. Il sera utilisé pour déterminer le rendement et plier l'enrichissement obtenu par enrichissement.
3. Magnetic Enrichissement à base de nanoparticules
- Resuspendre les cellules à partir d' échantillons AC dans 1 ml de tampon froid de séparation (PBS + 0,5% de BSA + EDTA 2 mM) par 5 x 10 7 cellules et de passer à travers un filtre de 40 um pour éliminer les grumeaux qui pourraient obstruer la colonne.
- Ajouter Anti-Cy5 / nanoparticules de colorant anti-rouge lointain fluorescentes. for des résultats optimaux, la concentration des nanoparticules doit être adaptée à chaque utilisation, mais un bon point de départ est de 50 pi de suspension par 5 x 10 7 cellules / ml. Tourner dans l'obscurité à 4 ° C pendant 10 min.
- Laver deux fois avec 1 ml de tampon de séparation à froid à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon froid de séparation par 5 x 10 7 cellules.
4. Enrichissement magnétique utilisant LS ou Colonnes LD
- Placez trois LS ou des colonnes de LD dans le champ magnétique d'un séparateur magnétique et ajouter 3 ml de tampon de séparation pour mouiller les colonnes (voir description du produit pour déterminer quel type de colonne est le mieux adapté). Autoriser tous les 3 ml de passer à travers la colonne et jeter après la collecte.
REMARQUE: Bien que la séparation des cellules marquées de nanoparticules magnétiques peut être réalisée en utilisant l'une quelconque des dispositifs de séparation magnétiques qui sont disponibles dans le commerce, le laboratoire a eu le plus de succès avec l'utilisation de colonnes LS, in terms de rendement, la pureté et l'efficacité de l'enrichissement. - Placer les tubes coniques de 15 ml trois étiquetés "Fraction A / (B) / (C) négative", pour les cellules sélectionnées négativement, sous la colonne. Ajouter la particule magnétique de cellules marquées à leur colonne respective et permettre à tout le volume de passer à travers.
- Ajouter 3 ml de tampon de séparation à froid sur le dessus, et laisser ce passage à travers la colonne et répétez avec 2 ml. Recueillir les cellules sélectionnées négativement et mettre de côté sur la glace.
- Retirer la colonne du champ magnétique et placer sur le dessus d'un tube de 15 ml conique étiqueté "Fraction A / (B) / (C) positif", pour les cellules sélectionnées positivement.
- Remplir la colonne vers le haut avec environ 6 ml de tampon de séparation et immédiatement plonger ce volume à travers la colonne pour recueillir des cellules qui avaient liés au champ magnétique utilisant le piston fourni.
- Pour augmenter la pureté, les cellules sélectionnées positivement peuvent être enrichis en utilisant une deuxième colonne de nettoyage, en répétant le procedure.
- Faire tourner les deux fractions sélectionnées négativement et positivement à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C et à mettre en suspension dans un volume final désiré. Procéder à l'analyse en aval, tels que FACS, ELISPOT ou transfert adoptif.
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Representative Results
Analyse de la pureté, le rendement, et pliez-enrichissement par cytométrie de flux
Les populations enrichies comme décrit ci-dessus contiennent inévitablement des cellules contaminantes qui ne sont pas liés colorant streptavidine rouge lointain fluorescent mais sont piégés dans la matrice. Ces impuretés peuvent être retirées de populations enrichies par tri FACS. Pour estimer la pureté des populations enrichies, porte sur des cellules vivantes basées sur l'avant et la diffusion latérale et / ou de teinture en direct / morts et analyser colorant + cellule fréquence bien-rouge fluorescent. Le pourcentage au sein de cette dernière porte est indicative de la pureté. Une analyse supplémentaire de la spécificité et l'affinité pour l'antigène de ces cellules nécessite tri FACS de cellules individuelles, suivie du clonage et le séquençage de gènes d'immunoglobulines exprimés et la production d'anticorps recombinants et l'analyse.
Rendement fait référence au nombre de antige isoléles lymphocytes B récupérés dans la fraction n-A de liaison par rapport au nombre de la population de départ (fraction D). Étant donné que le même nombre de cellules se trouvaient dans la fraction D comme fraction A, on peut directement déterminer le rendement (nombre de cellules B de liaison d'antigène dans la fraction A ÷ N ° cellules de liaison d'antigène B dans la fraction D).
Fold-enrichissement (E) est reflétée par le pourcentage de cellules de colorant + B rouge lointain fluorescent dans la fraction "positive" enrichie A par rapport à celui de la fraction D. Cette valeur indique l'augmentation proportionnelle dans les cellules spécifiques de l'antigène B obtenus par l'enrichissement des nanoparticules. La valeur peut être trouvée en utilisant l'équation suivante:
Pour illustrer cette technique, nous montrons des résultats représentatifs obtenus en utilisant l'anatoxine tétanique (Tet-Tox) comme un modèleantigène à détecter et à enrichir pour les cellules B Tet-Tox-réactifs dans le sang périphérique de sujets qui ont été vaccinés contre le tétanos à des moments différents. La figure 1 est une vue schématique du procédé et de l'adsorbant d'antigène. La figure 2a montre la fréquence des cellules Tet-Tox-réactives B d'une personne qui a été mise à vacciner contre le tétanos il y a plus d' une décennie. Montré sont les populations enrichies de Fraction A et la fréquence de base des cellules B Tet-Tox-spécifiques de Fraction D. D'où ( "positive") et appauvri ( «négatif»), dans cet exemple, nous sommes en mesure d'enrichir les cellules de liaison d'environ 7 fois et atteint une pureté de 4% dans la fraction enrichie.
La figure 2b montre la spécificité de la réaction en utilisant le sang d'un sujet qui a été vacciné ~ 3 ans auparavant. Quand on a ajouté un excès de 50 fois (50 pM), de l'anatoxine tétanique non marquée aux cellules avant de suppion de l'antigène biotinylé (Fraction B) nous sommes en mesure de bloquer la liaison de 83%, ce qui démontre la spécificité de liaison à l'antigène. Lorsque nous avons omis antigène biotinylé de la procédure (Fraction C), un petit nombre (~ 0,2%) des cellules B toujours liée; cette petite fraction de cellules B reflète probablement la liaison à une partie non-antigène dans l'adsorbant, tel que le colorant streptavidine-rouge lointain fluorescent, l'anticorps anti colorant rouge lointain fluorescente ou les billes magnétiques.
Pour démontrer l' utilisation de la méthode pour analyser les changements dans liaison à l' antigène phénotype cellulaire après l' immunisation , nous montrons dans la figure 3 la fréquence des cellules B Tet-Tox-spécifiques dans la naïve, la mémoire et les populations plasmablaste dans le sang tirées avant et 7 jours après rappel vaccination d'un sujet sain. Bien que le pourcentage de cellules B naïves parmi le total des cellules Tet-Tox liant B est passée de 84% à 64% après coup de pouce, le pourcentage de memorpopulations y et plasmablaste entre cellules totales Tet Tox réactifs ont augmenté de 16% à 36% et 0% à 40%, respectivement. La figure 3b montre les données ELISPOT représentatives du sang périphérique des 7 jours post-boost sujet sain. L'isolement des cellules Tet-Tox contraignants B a conduit à l'enrichissement de 4 fois en anticorps antitétanique fréquence des cellules sécrétant.
Figure 1: Méthode de détection et à l' enrichissement de l' anatoxine tétanique (Tet Tox) liant le cellules B. (A) Protocole pour l' enrichissement et l' isolement des cellules Tet-Tox de liaison B. (B) Schéma d'adsorbant utilisé pour identifier et enrichir les cellules Tet-Tox de liaison B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2: cytogrammes représentatifs démontrant l' enrichissement des cellules B Tet Tox liaison à partir du sang périphérique humain. (A) cytogrammes d'enrichi et les cellules B Tet Tox réactifs épuisés de Fraction A et le total des cellules B Tet-Tox-réactifs de Fraction D à partir d' un sujet normal derniers vaccinés> 10 ans auparavant. (B) cytogrammes des PBMC à partir des populations "positives" provenant d' un sujet vacciné ~ 3 ans auparavant et enrichi en A (fraction A), après une pré-incubation avec un excès de 50 uM non marqué Tet Tox (fraction B), ou enrichie avec Tet-Tox-biotine omis lors de la procédure (Fraction C). Toutes les analyses ont été bloqués sur les CD19 + lymphocytes. Les pourcentages représentent le pour cent des cellules Tet-Tox-liaison de toutes les cellules B (CD19 +) dans la fraction finale.ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Exemples d'analyse post-enrichissement des cellules de liaison d'antigène. (A) Flux représentant analyse cytométrique du phénotype cellulaire après enrichissement de cellules Tet-Tox de liaison B. Cytogrammes décrivent l' identification et l' analyse des naïfs Tet-Tox-réactive (CD27 -), la mémoire (CD27 +) et plasmoblastes (CD27 ++ CD38 ++) dans les sous - populations de cellules B d'un sujet avant et 7 jours après la vaccination de rappel contre le tétanos. Toutes les cellules ont été bloqués sur les CD19 + lymphocytes des populations enrichies «positives». (B) Analyse ELISPOT représentative de cellules sécrétrices d' anticorps dans enrichis, appauvris, et un total de fractions de cellules B non aménagées dans le sang périphérique d'un sujet sain 7 jours après la boost. Pour l'essai ELISPOT, les puits d'une plaque à 96 puits ont d'abord été revêtus d'une solution d'anatoxine tétanique / ml 10 pg. Deux dilutions successives de suspensions cellulaires ont été réalisées dans des puits (à travers la plaque) à partir de cellules à une concentration égale à partir des fractions enrichies non enrichis, appauvris, et le coût total. les cellules sécrétrices d'anticorps antitétanique ont été détectés avec des anticorps biotinylé anti-IgG humaine (H & L), suivi par streptavidine-AP. La plaque a été développée avec un tampon de développement ELISPOT , et la réaction a été stoppée par lavage de la plaque trois fois avec bidistillée H 2 O. Le nombre de points à une dilution des cellules dans la plage linéaire a été déterminée, et le nombre de CSA a été calculé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici un nouveau procédé pour réaliser l'isolement et l'enrichissement de cellules B de liaison d'antigène provenant du sang périphérique humain. Le procédé est facilement applicable à des souris et à d'autres tissus, tels que les ganglions lymphatiques et la rate, et est compatible avec une analyse post-enrichissement du phénotype et la fonction (manuscrit en préparation) cellulaire.
L'utilisateur doit être conscient d'un certain nombre de variables qui peuvent avoir une incidence sur le succès de cette procédure. De l'expérience des cellules mortes ont tendance à coller aux billes magnétiques et «prendre» des colorants fluorescents, tels que le colorant Streptavidin-rouge lointain fluorescent, conduisant à fond non spécifique accrue. Il est essentiel d'enlever autant de cellules mortes à partir d'échantillons que possible avant d'entamer cette procédure. L'utilisation de taches qui permettent la discrimination en direct / morts porte sur les cellules mortes de l'analyse peut être utile, mais la présence de cellules mortes peut compromettre l'interprétation des dosages d'anticorps sécrétant fréquence cellulaire etfonction suivante transfert adoptif.
En outre, nous avons constaté que le titrage soigneux de l'antigène ajouté biotinylé est essentiel de faire la distinction spécifique de l'antigène et la liaison non spécifique. L'utilisation de trop peu d'antigène va conduire à une sous-estimation de la fréquence des cellules de liaison d'antigène, alors que trop d'antigène peut provoquer la détection / enrichissement faux positif. Utilisation de concentrations d'antigènes qui sont trop élevées peuvent être indiquée par liaison apparente à des cellules non-B dans les échantillons. En outre, la détection apparente d'une trop haute fréquence (> 1%) de l'antigène des cellules réactives peut être une indication de la question de la spécificité de liaison. Le but ultime pour déterminer la quantité optimale d'antigène à utiliser est d'ajouter un peu plus d'un antigène que ce qui est présent à des concentrations physiologiques, de telle sorte que la majorité des récepteurs des cellules B avec une affinité de <10 -6 M, par exemple, l'antigène sont saturés. Cela garantit que les cellules spécifiques de l'antigène B sont bEING détectée avec une affinité qui a un potentiel pathogène. L' addition de trop peu d' antigène, soit au niveau ou en dessous des concentrations physiologiques, peut conduire à la détection de très peu de cellules B spécifiques de l' antigène en raison d' une diminution occupation de l' antigène des RCO. D'autre part, l' ajout de trop de l' antigène, dépassant de loin les concentrations physiologiques, peut conduire à une augmentation de la liaison non spécifique qui comprend des cellules B avec une faible affinité pour l'antigène (> 10 -6 M) et sont en fait ignorants de l'antigène in vivo. Par conséquent, il est vital d'abord titrer l'antigène biotinylé à travers quelques bûches afin d'être sûr que seuls véritables cellules présentatrices d'antigène réactif B sont détectés. De même, nous avons constaté que l'utilisation de trop de colorant streptavidine-rouge lointain fluorescent peut augmenter fond.
Il est également important de noter que la biotinylation de l'antigène peut affecter la disponibilité des épitopes antigéniques. Par conséquent, l'optimisation en utilisant biotinylation différente rencontréauges peuvent être importants. En variante biotine peut être couplé à des amines primaires, des amines tertiaires, des groupes sulfhydryle ou des groupes carboxyle. L'utilisation de longueurs de bras d'écartement étendues peut améliorer la disponibilité de l'épitope en réduisant l'encombrement stérique.
Une des limites de cette technique est son efficacité réduite pour l'enrichissement des cellules B liaison à l'antigène de cryoconservés par rapport à des cellules fraîches. Cela pourrait concerner plus la mort cellulaire et associé «poisseuse» dans les échantillons congelés. Néanmoins, le procédé peut être appliqué à des échantillons congelés, mais il est probablement important de ne pas comparer directement les résultats de l'enrichissement et l'analyse des cellules fraîches et congelées. Une autre limitation est la pureté des lymphocytes B spécifiques de l'antigène dans l'échantillon enrichi. De l'expérience, il y a toujours quelques cellules qui "tag along", qui comprend les deux cellules B non spécifiques et les cellules T. Ceci est à prévoir étant donné la rareté de la population cellulaire sur essaie d'enrichir. Cependant, la pureté du tcellules il peut être augmenter en faisant en sorte qu'une seule suspension cellulaire est obtenue avant d'ajouter les cellules à la colonne, enrichissant une seconde fois sur une nouvelle colonne, ou par FACS de tri des cellules spécifiques de l'antigène B. Selon le type d'étude, le chercheur peut décider quelle option est la meilleure et si elle est nécessaire.
Comme nous l'avons optimisé cette technique, nous avons envisagé qu'il se prêter à une discrimination d'affinité élevée par rapport à cellules présentatrices d'antigène réactif à faible affinité basée sur le titrage de l'antigène ou de l'intensité des taches. Cependant, dans une étude précédente, nous avons montré cellules présentatrices d'antigène réactif B avec un maximum à une différence de 1 000 fois plus d'affinité pour leur antigène ont été également enrichi en utilisant cette méthode 7. Par conséquent, la mesure formelle de l'affinité des cellules enrichies en utilisant une analyse de récepteurs d'antigènes recombinants exprimés par résonance plasmonique de surface est nécessaire si la connaissance de l'affinité est pertinent pour l'étude.
Inhérents à cette technique est la limitation que l'addition de l'antigène biotinylé et de la streptavidine peut activer les cellules par réticulation du BCR. Cela pourrait poser un problème pour certains tests fonctionnels en aval, tels que ceux qui cherchent à comparer les cellules stimulées à un contrôle de repos. Ce problème peut être atténué en gardant les échantillons de contrôle à froid pour empêcher la transduction des signaux. Il est également possible que les signaux BCR pourraient affecter une réponse biologique en cours. A partir de l' expérience cellules présentatrices d'antigène enrichi conservent leur capacité à sécréter des anticorps, comme indiqué par analyse ELISPOT (figure 3b) et fonctionnent comme cellules présentatrices d' antigène aux lymphocytes T in vitro et après un transfert adoptif dans des souris (données non montrées). Une dernière limite de cette technique est l'utilisation d'anticorps anti-fluorochome pour réaliser la liaison à cellules présentatrices d'antigène adsorbé nanoparticule. Anti-colorant rouge lointain fluorescent réagit de manière croisée avec certains fluorochromes structurellement apparentées, y compris Cy7 et Cy5.5. Cela peut limiter les options oconjugués anticorps f disponibles pour la mesure des marqueurs phénotypiques. Cependant, avec une plus grande disponibilité de nouveaux fluorochromes, cela devient moins un problème.
En utilisant cette méthode de détection et d' enrichissement, il est possible d'identifier facilement les cellules B liaison à l' antigène en ex vivo du sang périphérique, de la rate, ou d' autres tissus. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier la réponse immunitaire des cellules réactives à l'antigène après une immunisation ou d'une exposition à des antigènes étrangers et dans le contexte d'une maladie auto-immune. Bien qu'aucune méthode pour détecter des cellules présentatrices d'antigène réactif B est avérée être sans défauts, cette méthode est simple, rapide et produit une pureté relativement élevée, le rendement et l'enrichissement des cellules présentatrices d'antigène réactif qui peut être couplé à une variété d'aval dosages. En outre, compte tenu des principes de base du procédé, ce procédé pourrait facilement être adaptée à une variété de besoins expérimentaux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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