Summary
שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.
Introduction
הגבלת דילול המנתח של תדר מבשר תאי מפרישי נוגדן הציע B תאים תגובתי אנטיגן מסוים מתרחשים בדרך כלל בתדר של 0.05 ל 0.005% ברפרטואר הרגיל, בהתאם למצב החיסון והגודל / מספר אפיטופים הנוכחי על אנטיגן. התדירות הנמוכה של תאים אלה מקשה ללמוד שינויים במעמדם במהלך פיתוח של מערכת חיסונית, כגון החיסון הבא או חשיפת אנטיגן זר, או במהלך ההתפתחות של אוטואימוניות. בעבר, חוקרים התחייבו בידוד של תאי B-reactive אנטיגן באמצעות טכניקות החל צלחות או adsorbents טור מצופה אנטיגן, כדי איפוס תאי דם אדום מצופה אנטיגן, קרינה המופעל מיון תא 1, 2, 3, 4, 5, 6. though טכניקות אלו היו מוצלחות בזיהוי ובידוד תאי B תגובתי-אנטיגן, התוצאות השתנו במונחי תשואה, טוהר ויכולת רחב. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשני לזהות ולהעשיר תת-אוכלוסיות לימפוציטים B נדירים באמצעות חלקיקים מגנטיים. השיטה מאפשרת העשרה עם תשואה גבוהה יחסית וטוהר מאוכלוסיות מוצא גדולים, והוא תואם עם ניתוח של תגובות אנטיגן. על ידי העשרה מאוכלוסיות של תאים בתרחיף, השיטה מבטלת אילוצים הקשורים בגיאומטריה של צלחות מצופות אנטיגן או עמודות, ותפוקת גבול. לבסוף, מאז תאים מועשרים נשארים הקשורים אנטיגן כתב ניאון, הם יכולים להיות מטוהרים עוד יותר על ידי מיון FACS. כפי שתואר במסמך זה השתמשנו גישה זו ללימוד של תאי B toxoid-reactive טטנוס הדם ההיקפיים לפני וחיסון הבאים בבני אדם, כמו גם תאי B autoantigen-reactive מן הנבדקים עם autoi שוניםפרעות mmune, כולל סוכרת מסוג 1, מחלת גרייבס, ומחלת השימוטו 7. השיטה עובדת באותה מידה אדם לעכבר, והוא תואם עם ניתוח של תאי B-reactive אנטיגן ממגוון רקמות (כתב היד בהכנה).
בשנת הפורמט הבסיסי שלה, תאי דם היקפיים mononuclear מודגרת הראשון עם אנטיגן biotinylated יחד עם נוגדנים לתא אנטיגנים השטח הנדרש לניתוח פנוטיפי. צעד תיוג זה ואחריו כביסה קיבעון, והוספת streptavidin מצמידים את צבע מרחיקות אדום ניאון לגילוי של אנטיגן biotinylated מחייב תאים (איור 1). מחקרים קודמים זיהו תאי B אנטיגן ספציפי באופן דומה אך אנטיגנים באמצעות מצומדות ישירות fluorochrome 8, 9, 10, 11. למרות זאת הוא ראויגישה, שימוש אנטיגנים biotinylated בשיתוף עם streptavidin מאפשרת הגברת אות יותר (ומכאן בידול טוב יותר של כריכה, תאים בלתי מחייבים), במיוחד כאשר אנטיגנים הם קטנים 12, 13, 14. שיקול נוסף הוא השימוש streptavidin במקום avidin כי streptavidin הוא deglycosylated, ומקטין את הלא ספציפית מחייב. יתר על כן, אנו משתמשים צבען מרחיקות אדום ניאון כמו fluorochrome בשל photostability שלה, תשואה קוונטית (בהירות), ואת גודלו הקטן (~ 1.3 KD). Fluorochromes חלבון כגון Phycoerythrin (~ 250 KD) ו allophycocyanin (~ 105 KD) 15 אינם אופטימליים כי הם פוטנציאל להכיל אפיטופים אנטיגני רבים. שימוש פלורסנט לצבוע אורגני קטן מורכב epitope יחיד, כגון צבע מרחיקות אדום ניאון, ומפחית את המורכבות של אוכלוסיית התא המבודדת.
לאחר התאים הם biotinylated-antigen ו adsorbed צבען streptavidin מרחיקה ניאון האדום, הם מועשרים באמצעות חלקיקים מגנטיים אנטי מרחיקות אדום ניאון צבען מצומדות. חלקיקים אחת אינם מזוהים על ידי cytometers הזרימה ביותר ולכן אין צורך להסיר לפני טיהור ידי FACS מיון מבחנים במורד זרם 16. מבחר מגנטי עבור תאי B אנטיגן ספציפי מעשיר את האוכלוסייה של עניין, ומבטל את הזמן והעלות של מיון אירועים נדירים באמצעות cytometer זרימה.
להלן אנו מציגים תוצאות נציג מהעשרה של תאי B טטנוס-toxoid ספציפי של נושא לפני ושבעה ימים לאחר חיסון מגבר toxoid טטנוס. בחרנו היישום המסוים הזה כדוגמה כדי להדגים את היכולת של שיטה זו להעשיר תאי B אנטיגן ספציפי הבאים חריפה גירוי vivo. כאשר מצמידים עם תזרים cytometry, שיטה זו היא מסוגלת מעשירה ומבדל אנטיגן ספציפי נאיבי, זיכרון,plasmablast B תאים מאפשרים לחוקר לעקוב שינויים בתדירות שלהם לאורך זמן. בנוסף, אנו כוללים אחר assay במורד אפשרי, למשל ב assay ELISPOT, אשר מראה כי תאים לשמור על היכולת להפריש נוגדנים הבאים עשרה. יישום נוסף של שיטה זו עשויה להיות כרוך העברת מאמצת של תאים מועשרים לתוך שורה. הראינו בעבר תאים לשמר את היכולת לפעול כפי אנטיגן הצגת תאים לתאי T אנטיגן ספציפי הבאים בידוד והעברה (מידע לא מוצג). לפיכך, יש מספר המבחנים במורד זרם האפשריים שיכול להיות מצמידים את השיטה, אשר יחד מודיע ההבנה של התגובה החיסונית אנטיגן ספציפי. תארנו את השיטה הבאה, לרבות בקרות כדי לקבוע תשואה כוללת, טוהר, תא סגולי, ומקפלים-העשרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניתוק של PBMCs אנוש
- אסוף 30-50 מ"ל של דם באמצעות צינורות איסוף דם heparinized.
הערה: כמות הדם המשמשים תלוי בשאלה ותדירות הניסוי בפרט בדם של תאי B אנטיגן ספציפי של עניין. דם heparinized ניתן לעבד מיד או התנדנדה קלות הלילה בטמפרטורת החדר לעיבוד למחרת. העיכוב עיבוד יש השפעה מועטה מאוד על יעילות של העשרה והיא קשורה עם הפסד מינימלי של כדאיות. - מערבבים כל הדם 1: 1 עם מגנזיום הטמפרטורה סטרילי, חדר בופר פוספט חינם סידן (PBS).
- בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות בטמפרטורת החדר. אחסן את בקבוקי שיפוע צפיפות פתח בחושך ב 4 ° C, אבל חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- אם אפשר להגדיר את האקדח פיפטה להגדרה האיטית ו / או ליישם מעט מאוד, ובכל זאת עולה בקנה אחד, לחץ על הדק לאטשכבת 30-35 מ"ל של דם מדולל על גבי שיפוע צפיפות, נזהרים שלא לערבב בין השניים.
הערה: הצבת הקצה פיפטה כנגד הקצה של 50 מיליליטר חרוטים תוך הוספת הדם המדולל תעזור להבטיח זרימה קבועה ועקבית. - צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם הבלם כבוי.
- הסר את השכבה העליונה, אשר מכיל פלסמה וטסיות, נזהר שלא להפריע את שכבת התאים mononuclear להלן.
- בעזרת פיפטה סטרילית, לאסוף את שכבת התאים mononuclear (באפי מעיל) ומקום לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי סטרילי נפרד.
- להוסיף PBS על השעיית התא לנפח של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם הבלם.
- הסר supernatant ו resuspend התאים pelleted ב 10 מ"ל של PBS. ספירת תאים ולקבוע כדאיות באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
- תאים Resuspend ב 10 7 תאים / מ"ל ומניחים על קרח עד מוכן לעיבוד נוסף.
מכתים 2. של תאים
- הסר 1-2 x 10 6 תאים עבור כל פיצוי קרינה / שליטת FMO צורך, אם זה אפשרי. שארית צנטריפוגה של תאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
- Resuspend תאים מסוננים סטרילית, חיץ FACS קר (PBS + 1% אלבומין בסרום שור (BSA) + 0.01% אזיד הנתרן) בשעה 3-6 x 10 7 תאים / מ"ל (להסיר צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות). ודא כי למאגר FACS קר ולשמור אותו על קרח לאורך כל ההליך מכתים.
- מחלק את אוכלוסיית התא לרבעים (AD) בעת ביצוע אופטימיזציה של assay. השתמש חלק א 'עד להעשיר תאי B אנטיגן ספציפי של שברים עניין, שימוש B ו- C כדי לקבוע את הספציפיות של העשרה / מכתים (ראה 2.5 ו 2.6 להלן), ושימוש חלק D כדי לקבוע את התדירות ואת מספר התאים אנטיגן ספציפי ב אוכלוסיית unenriched לאפשר חישוב התשואה ומקפלת-העשרה.
- להוסיף מחדש חסימת FcγR אדםסוכן שברים לספירה על הקרח כדי למנוע מחייב של נוגדנים לקולטנים Fc.
הערה: בצע את ההוראות של היצרן עבור תנאים מתאימים. - הוסף fluorochrome- מצומדות נוגדנים לתא אנטיגנים פני השטח של עניין שברים לספירה למשך 30 דקות על הקרח בחושך, נזהרים שלא לכלול fluorochromes שעשויים לחצות להגיב עם נוגדנים לצבוע אנטי מרחיקות אדום ניאון מצמידים חלקיקים מגנטיים.
הערה: אלה כוללים conjugates נוגדנים צבע פלואורסצנטי ליד-IR, Cy5, Cy5.5, ו Cy7. כל כתמי כדאיות שנוספים צריכים להיות תואמים את השימוש מקבע. אם אחד אינו מתכוון לנתח את התאים באמצעות FACS, אבל לקבוע את תדירות מפרישי נוגדן, למשל, על ידי ELISPOT, מכתים משטח עם נוגדנים הוא מיותר. - כדי לבדוק את הספציפיות של assay, דגירה הפרקציה B עם כמות מספקת של אנטיגן ללא תווית עבור 30 דקות על הקרח, כך שרוב קולטנים בעלי זיקה של לפחות10 -6 M חסומים.
הערה: בדרך כלל, ריכוז התחלה טובה היא עודף לקפל 50-100 מסכום אנטיגן שדי ב 2.6 להלן (למשל 50-100 מיקרומטר). זה אמור לחסום כל תאי B עם זיקה גבוהה עבור אנטיגן ללא התווית להיקשר האנטיגן biotinylated, אשר מתווסף בשלב 2.6 להלן, ובכך מאפשרים אישור של הספציפיות של התאים המועשרים. שלב זה יכול להסתיים בשיתוף עם צעד 2.4 לעיל. - הוסף אנטיגן biotinylated ל שברים A, B ו- D. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
הערה: ריכוז של אנטיגן biotinylated צריכה להיות טיטרציה לקבוע את הכמות האופטימלית הדרושה כדי להבטיח זיהוי נאות הפרדת מחייב תאי מתאי עוברים אורח שאינו ספציפיים. בדרך כלל ריכוז התחלה טובה המבחן הוא 1-5 מיקרומטר.
הערה: לקבלת שברים A ו- D, שלב זה יכול להיעשות במקביל צעד 2.4 לעיל. לשבריר B, שלב זה צריך להיעשות לאחר שלב 2.5 (כביסה betwצעדים een הוא מיותר). - השמט אנטיגן biotinylated מ שבר C כדי לקבוע כל עקדת תאי B כדי ריאגנטים אחרים בפרוטוקול, כגון לצבוע streptavidin- מרחיקות אדום ניאון ואת חרוזים מגנטיים.
- שטפו תאים פעמיים על ידי השעיה של תאים ב 1 מ"ל של חיץ קר FACS לכל 5 x 10 7 תאים צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- לאחר השטיפה של הדבר, לדלל השעית תא מרוכזת בפורמלין% 1 מיליליטר 2 לכל 5 x 10 7 תאים ולתת לשבת בחושך על קרח למשך 5 דקות.
הערה: קיבוע של התאים בשלב זה מבטיח כי אנטיגן biotinylated נשאר קשור אל BCR עבור הנותרים של ההליך. עבור תאי קיימא - לניתוח במורד זרם, כגון ELISPOTs או עברות מאמצות, להשמיט את צעד הקיבעון. - שטפו תאים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ קר FACS לכל 5 x 10 7 תאים צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. Resuspend ב 1 מ"ל FACS קר חיץ לכל 5 x 107 תאים.
- להוסיף 1-2 מיקרוגרם streptavidin-מרחיקות אדום ניאון לצבוע / מ"ל ו דגירה על קרח למשך 20 דקות בחושך. לכייל את כמות streptavidin עבור כל יישום.
- שטפו תאים פעמיים עם חיץ קר 1 מ"ל FACS לכל 5 x 10 7 תאים צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. הכנת שהבר D הושלמה בשלב זה כפי שהוא לא יעבור העשרה באמצעות החרוזים המגנטיים.
הערה: מדגם זה ישמש כדי לקבוע את התדירות ואת מספר תאי B אנטיגן ספציפי במדגם. זה ישמש כדי לקבוע את התשואה ומקפלת-העשרת מושגת על ידי העשרה.
עשרת Nanoparticle מבוסס 3. מגנטים
- תאים Resuspend ממדגמים AC ב 1 מ"ל של חיץ ההפרדה קר (PBS + 0.5% BSA + 2 מ"מ EDTA) לכל 5 x 10 7 תאים ולהעביר דרך פילטר 40 מיקרומטר לחסל כל גושים שיכול להדביק את הטור.
- הוסף חלקיקים לצבוע אנטי-Cy5 / Anti-מרחיקות אדום ניאון. For תוצאות אופטימליות, ריכוז חלקיקים יש טיטרציה עבור כל שימוש, אבל נקודת התחלה טובה היא 50 ההשעיה μl לכל 5 x 10 7 תאים / מ"ל. סובב בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- שטפו פעמיים עם חיץ ההפרדה קר 1 מ"ל ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. תאים Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ ההפרדה קר לכל 5 x 10 7 תאים.
4. העשרה מגנטיים באמצעות LS או עמודות LD
- מניחים שלוש LS או עמודות LD בשדה המגנטי של מפריד מגנטי ולהוסיף 3 מ"ל של חיץ ההפרדה להרטיב את עמודות (ראה תיאור המוצר כדי לקבוע איזה סוג של העמודה המתאימה ביותר). אפשר את כל 3 מ"ל לעבור דרך העמודה וזורקים לאחר איסוף.
הערה: למרות הפרדת התאים שכותרתו מגנטיים nanoparticle ניתן להשיג באמצעות כל אחד מהתקני הפרדה המגנטיים כי הם זמינים מסחריים, במעבדה צופה את ההצלחה הרבה ביותר עם השימוש בעמודי LS, ב terms של תשואה, טוהר, ויעילות של העשרה. - מניחים שלושה צינורות חרוטי 15 מ"ל שכותרתו "הפרקציה A / (B) / (C) שלילי", עבור התאים שנבחרו באופן שלילי, תחת העמודה. מוסיפים את התאים המגנטי החלקיקים שכותרתו לעמודה שלהם ולאפשר את הכרך כולו לעבור.
- הוסף 3 מ"ל של חיץ ההפרדה קר פונה כלפי מעלה, להניח לזה לקרות דרך עמוד וחזור עם 2 מ"ל. איסוף התאים שנבחרו באופן שלילי ומניחים בצד על הקרח.
- הסר את העמודה מהשדה המגנטי ומניחים על גבי צינור חרוטי 15 מ"ל שכותרתו "הפרקציה A / (B) / (C) חיובי" עבור התאים שנבחרו באופן חיובי.
- מלאו את העמודה לפסגה עם כ -6 מ"ל של חיץ ההפרדה ומיד לצלול בכרך זה דרך העמודה לאסוף תאים שקשרו לשדה המגנטי באמצעות הבוכנה מסופק.
- כדי להגדיל טוהר, התאים שנבחרו באופן חיובי ניתן להעשיר עוד יותר באמצעות טור נקי שני, חזרה על proceפרוצדורה.
- ספין הן שברים שנבחרו באופן שלילי חיובי ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ו להשעות בנפח הסופי הרצוי. המשך עם ניתוח במורד הזרם, כגון FACS, ELISPOT או העברת המאמצת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח של טוהר, תשואה, ומקפלים-העשרה באמצעות cytometry זרימה
אוכלוסיות מועשר כמתואר לעיל בהכרח מכילים תאים זיהום שלא כבול streptavidin- לצבוע מרחיקות אדום ניאון אבל כלואים בתוך מטריקס. זיהומים אלו ניתן להסיר מאוכלוסיות מועשרות על ידי מיון FACS. כדי להעריך טוהר אוכלוסיות מועשרות, שער על תאים חיים המבוסס על קדימה וצד פיזור ו / או חי / כתם מת ולנתח מרחיקות אדום ניאון תדר צבע + תא. האחוז בתוך השער האחרון זה מעיד על טוהר. ניתוח נוסף של הזיקה הסגולית אנטיגן של תאים אלה דורש מיון FACS של תאים בודדים, ואחריו שיבוט רצף של גני אימונוגלובולינים הביעו וייצור נוגדן רקומביננטי וניתוח.
תשואה מתייחסת למספר antige המבודדn-מחייב תאי B התאושש בשבריר קרוב משפחה אל המספר (D Fraction) האוכלוסייה ההתחלה. מאז אותו מספר של תאים היו בשבריר D כשבר, אפשר לקבוע את התשואה ישירות (# של תאי B מחייב אנטיגן בשבריר A # ÷ של תאי B מחייב אנטיגן ברה שבר).
מקפל-העשרה (E) מתבטא באחוז התאים לצבוע + B מרחיקה אדום ניאון בשבריר המועשר "חיובי" קרוב משפחה לזה שבר ד ערך זה מציין את הגידול היחסי בתאי אנטיגן ספציפי B מושגים על ידי עשרה ננו-חלקיקים. הערך ניתן למצוא באמצעות המשוואה הבאה:
כדי להדגים את הטכניקה הזו, אנו מציגים תוצאות נציג שהושגו באמצעות-toxoid טטנוס (ט-Tox) כמודלאנטיגן כדי לזהות ולהעשיר עבור תאים ט-Tox-reactive B בדם ההיקפי של נבדקים אשר חוסנו כנגד טטנוס בנקודות שונות בזמן. איור 1 הוא סכימטי של השיטה ואת כושר ספיגה אנטיגן. איור 2 א מראה את התדר של תאי ט-Tox-reactive B מאדם שהיה אחרון חיסון נגד טטנוס יותר מאשר לפני עשור. המוצגים הם מועשר ( "חיובי") מדולדל ( "שליליים") אוכלוסיות שבריר ואת תדירות הבסיס של תאי B ט-Tox ספציפיים מן שבר ד לפיכך, בדוגמה זו אנו מסוגלים להעשיר תאים מחייב בכ פי 7 והשיג טוהר 4% בשבריר מועשר.
איור 2b מראה את הספציפיות של התגובה באמצעות דם הנושא אשר חוסן ~ 3 שנים קודם לכן. כאשר הוספנו עודף של פי 50 (50 מיקרומטר) של toxoid טטנוס ללא תווית לתאי לפני additיון של אנטיגן biotinylated (חלק ב ') אנו מסוגלים לחסום מחייב ידי 83%, הוכיח את הספציפיות של אנטיגן מחייב. כאשר אנו השמטנו אנטיגן biotinylated מההליך (חלק ג '), מספר קטן (~ 0.2%) של תאי B עדיין כבול; חלק קטן זה של תאי B כנראה משקף מחייב כמה אנטיגן מי שאינם כאלה adsorbant, כגון streptavidin-מרחיקות אדום ניאון לצבוע, הנוגדן לצבוע אנטי מרחיקות אדום ניאון או חרוזים מגנטיים.
כדי להדגים שימוש בשיטה לנתח שינויי החיסון הבא פנוטיפ תא מחייב אנטיגן שאנו מראים בתרשים 3 תדירות תאי B ט-Tox-ספציפי, הזיכרון התם, ואוכלוסיות plasmablast בדם בציור לפני 7 ימים לאחר גבהה החיסון של אדם בריא. בעוד אחוז תאי B נאיבי בין התאים ט-Tox מחייב B הכולל ירד מ 84% ל -64% לאחר דחיפה, אחוז memor אוכלוסיות y ו plasmablast בין סך ט Tox-reactive תאים עלה מ 16% ל -36% ו 0% עד 40%, בהתאמה. איור 3B מציג נתוני ELISPOT נציג מדם היקפי מ -7 הימים שלאחר דחיפה לנושא בריא. בידוד של תאי B ט-Tox מחייב הוביל העשרה פי 4 בתדירות מפריש תאים נוגדן toxoid טטנוס.
איור 1: שיטה לגילוי והעשרה של toxoid טטנוס (ט Tox) -binding תאי B. (א) פרוטוקול להעשרה ובידוד של תאי ט-Tox מחייב B. (ב) תרשים של סופח מועסק לזהות ולהעשיר תאי ט-Tox מחייב B. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
n-page = "1"> 
איור 2: cytograms נציג הוכחת העשרת ט Tox מחייב תאי B מדם היקפי אנושי. (א) Cytograms של מועשר מדולדל ט Tox-reactive תאי B מן שבריר ותאי ט-Tox-reactive B סך D הפרקציה מנושא נורמלי חוסנו האחרון> בעבר 10 שנים. (ב) Cytograms של PBMCs מן האוכלוסיות "חיוביות" מנושא חוסן ~ בעבר 3 שנים והעשיר כמו A (שבריר), לאחר דגירה מראש עם עודף של 50 אום ללא תווית-tox ט (חלק ב '), או מועשר עם ט-Tox ביוטין השמיט במהלך (C שבר) ההליך. כל הניתוחים היו מגודרים על לימפוציטים CD19 +. אחוזים מייצגים את אחוז ט-Tox מחייב תאים של כל תאי B (CD19 +) בשבריר הסופי.ה' "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דוגמאות של ניתוח שלאחר העשרת התאים מחייב אנטיגן. (א) ניתוח תזרים cytometric נציג של פנוטיפ התא הבא העשרת תאי B ט-Tox מחייב. Cytograms מתאר זיהוי וניתוח של ט-Tox-reactive נאיבי (CD27 -), זיכרון (+ CD27), ו plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++) בתת אוכלוסיות תא B של נושא לפני 7 ימים לאחר חיסון מגבר נגד טטנוס. כל התאים היו מגודרים על CD19 + לימפוציטים מתוך אוכלוסיות "החיוביות" המועשרות. (ב) הנציג ELISPOT ניתוח של הנוגדן מפריש תאים מועשרים, מדולדל, ושברי תאי B הכוללים unenriched מדם היקפי של אדם בריא 7 ימים לאחר boost. עבור assay ELISPOT, בארות של צלחת 96 גם היו מצופים הראשון עם פתרון 10 מיקרוגרם / מ"ל של toxoid טטנוס. שני דילולים סדרתי של המתלים תא נעשו בבארות (פני הצלחת) החל עם תאים בריכוז שווה מן מועשר, מדולדל, והתמורה הכוללת שברים unenriched. נוגדן אנטי-טטנוס מפריש תאים התגלו עם IgG אנטי אנושי biotinylated (H & L), ואחריו streptavidin-AP. צלחת פותחתה עם חיץ פיתוח ELISPOT והתגובה הופסקה על ידי שטיפת הצלחת שלוש פעמים עם H הפעמים מזוקקות 2 O. מספר כתמים בדילול תא בטווח ליניארי נקבע, ומספר ASCs חושב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה חדשה להשיג בידוד והעשרה של תאי B מחייב אנטיגן מדם היקפי אנושי. השיטה ישימה בקלות עכברים לרקמות אחרות, כגון בלוטות הטחול הלימפה, והוא תואם עם ניתוח שלאחר העשרת פנוטיפ תא והתפקוד (כתב יד בהכנה).
המשתמש צריך להיות מודע של מספר משתנים שיכולים להשפיע על ההצלחה של הליך זה. מניסיון תאים מתים נוטים להיצמד חרוזים המגנטיים "תופס" צבעי ניאון, כגון streptavidin-מרחיקות אדום הניאון לצבוע, מוביל רקע גדילה הלא ספציפי. זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר תאים מתים ממדגמים ככל האפשר לפני תחילת הליך זה. שימוש כתם המאפשרים חיים / אפליה מתה לשער את תאים מתים מן הניתוח עשוי להיות מועיל, אבל נוכחות של תאים מתים עלולה לפגוע פרשנות של מבחנים של נוגדן מפריש תדירות תאהפונקציה הבאה העברת המאמצת.
בנוסף, מצאנו כי טיטרציה הזהירה של אנטיגן biotinylated הוסיף חיונית להבחין אנטיגן ספציפי מחייב הלא ספציפי. שימוש אנטיגן מעט מדי יוביל הערכה נמוכה מדי של התדירות של תאי מחייב אנטיגן, ואילו כמות גדולה מדי אנטיגן יכול לגרום / העשרה זיהוי חיובי כוזב. שימוש בריכוזים אנטיגן כי הם במאי גבוה מדי יכול להיות שמציינים לכאורה מחייב תאים שאינם B בדגימות. יתר על כן, זיהוי לכאורה של בתדירות גבוהה מדי (> 1%) של אנטיגן תאים תגובתי עשויים להיות אינדיקציה מחייבת נושא סגולי. המטרה הסופית בקביעת הכמות האופטימלית של אנטיגן להשתמש היא להוסיף קצת יותר אנטיגן מאשר בריכוזים פיזיולוגיים, כגון כי הרוב המכריע של קולטני תאי B עם זיקה של <10 -6 M, למשל, עבור האנטיגן רווי. הדבר מבטיח כי תאי B אנטיגן ספציפי הם בeing מזוהה עם זיקה שיש לו פוטנציאל פתוגניים. תוספת של אנטיגן מעט מדי, כלומר בבית או מתחת ריכוזים פיסיולוגיים, עלולה להוביל לגילוי של תאי B אנטיגן ספציפי מעט מאוד עקב ירידת כיבוש אנטיגן של BCRs. מצד השני, תוספת של אנטיגן יותר מדי, בהרבה ריכוזים פיסיולוגיים, יכולה להוביל מחייב גדל הלא ספציפי אשר תכלול תאי B עם זיקה נמוכה עבור אנטיגן (> 10 -6 M) והם בעצם בורים של אנטיגן in vivo. לפיכך, הוא חיוני, כדי לכייל את אנטיגן biotinylated הראשון על פני כמה יומנים כדי להיות בטוח כי תאי B אנטיגן-reactive נכון רק שיראו. בדומה לכך, מצאנו כי שימוש יותר מדי צבע streptavidin-מרחיקות אדום ניאון יכול להגדיל ברקע.
כמו כן, חשוב לציין כי biotinylation של אנטיגן יכול להשפיע על הזמינות של אפיטופים אנטיגני. לפיכך, אופטימיזציה באמצעות biotinylation השונה נפגשהhods עשוי להיות חשוב. לחלופין ביוטין יכול להיות מצמידים את אמינים ראשוניים, אמינים שלישוניים, sulfhydryls, או קבוצות carboxyl. השתמש באורכי זרוע spacer מורחבים יכול לשפר את זמינות epitope על ידי צמצום הפרעה סטרית.
אחת המגבלות הוא טכניקה זו אפקטיבית המצומצמת להעשרת תאי B מחייב אנטיגן מן cryopreserved בהשוואה לתאים טריים. זה יכול להתייחס מוות של תאים יותר הקשורים "דביקות" בדגימות קפוא. אף על פי כן, השיטה ניתן ליישם דגימות קפואות אבל זה כנראה חשוב לא להשוות תוצאות ישירות העשרה וניתוח של תאים טריים וקפואים. מגבלה נוספת היא טוהרת תאי B אנטיגן ספציפי במדגם המועשר. מניסיון, תמיד יש כמה תאים "תג יחד", הכולל הוא הלא ספציפיים בתאי B ותאי T. זאת על מנת צפויה בהתחשב נדירה של אוכלוסיית התא על מנסה להעשיר. עם זאת, את הטוהר של tהוא תאים יכולים להיות גידול על ידי הבטחה כי השעית תא בודדת מתקבלת לפני הוספת התאים לעמודה, להעשיר בשנית על עמודה חדשה, או על ידי FACS מיון תאי B אנטיגן ספציפי. בהתאם לסוג של מחקר, החוקר יכול להחליט איזו אפשרות הוא טוב ביותר והאם יש צורך.
ככל שאנו אופטימיזציה בטכניקה זו אנו שחזינו כי זה יהיה מקובל אפליה של זיקה גבוהה לעומת תאי אנטיגן-reactive זיקה נמוכה המבוססים על טיטרציה אנטיגן או עוצמת מכתים. עם זאת, במחקר קודם, הראינו תאי B תגובתי אנטיגן עם עד הבדל 1,000 של פי זיקה לאנטיגן שלהם הועשרו באופן שווה באמצעות שיטה זו 7. לפיכך, מדידה רשמית של הזיקה של תאים מועשרים באמצעות ניתוח תהודת plasmon פני שטח של קולטנים אנטיגן רקומביננטי הביעו נדרשת אם הידע של הזיקה רלוונטי המחקר.
הטמון בטכניקה זו הוא lחיקוי כי תוספת של אנטיגן biotinylated ו streptavidin יכול להפעיל את התאים על ידי cross-linking BCR. זה יכול להוות בעיה עבור מבחנים פונקציונליים במורד מסוימים, כגון אלה מבקשים להשוות תאי מגורה פקד נח. בעיה זו עלולה להיות מתנה על ידי שמירה על דגימות בקרה קרות למנוע תמרה של אותות. אפשר גם כי אותות BCR עלולים להוביל תגובה ביולוגית מתמשכת. מניסיון תאים מועשר אנטיגן לשמור את יכולתן להפריש נוגדנים, כפי שצוין על ידי ניתוח ELISPOT (איור 3B) ותפקוד כמו אנטיגן הצגת תאים לתאי T. במבחנה לאחר העברת המאמצת לעכברים (מידע לא מוצג). מגבלה סופית טכניקה זו היא השימוש נוגדנים נגד fluorochome להשיג nanoparticle מחייב לתאי adsorbed אנטיגן. Anti- לצבוע מרחיקות אדום ניאון צולבות מגיב עם fluorochromes מסוימות הקשורות מבנית, לרבות Cy7 ו Cy5.5. זה יכול להגביל את האפשרויות oconjugates ו נוגדן זמין למדידת סמנים פנוטיפי. עם זאת, עם זמינות מוגברת של fluorochromes החדש, זה נהיה פחות בעיה.
באמצעות זיהוי זה ושיטת העשרה, אפשר לזהות אנטיגן מחייב B תאים בקלות vivo לשעבר דם היקפי, טחול, או ברקמות אחרות. שיטה זו שימושית במיוחד בלימוד התגובה החיסונית של תאי תגובתי אנטיגן הבאים חיסון או חשיפה לאנטיגנים זרים על רקע של מחלה אוטואימונית. אמנם אין שיטה לזהות תאי B-reactive אנטיגן הוכיחה להיות בלי מגרעותיו, שיטה זו היא מהירה, פשוטה, ומייצרת טוהר גבוה יחסית, תשואה, והעשרה של תאים-reactive אנטיגן שניתן מצמיד את מגוון במורד הזרם מבחנים. בנוסף, בשל עקרונות היסוד של השיטה, הליך זה יכול להיות מותאם בקלות למגוון צרכים ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
