Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generation af en kronisk obstruktiv lungesygdom Model i mus ved gentagne ozon eksponering

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

Denne undersøgelse beskriver den succesfulde generation af en ny kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) dyremodel af gentagne gange udsætter mus til høje koncentrationer af ozon.

Abstract

Kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er karakteriseret ved vedvarende luftstrømmen begrænsning og lunge parenkymalt ødelæggelse. Det har en meget høj forekomst i aldrende befolkninger. Den nuværende konventionelle behandlingsformer for KOL fokus primært på symptom-ændring narkotika; udvikling af nye behandlingsformer er således bydende nødvendigt. Kvalificeret dyremodeller for KOL kunne bidrage til at karakterisere de underliggende mekanismer og kan bruges til nye stof screening. Nuværende KOL modeller, såsom LPS (LPS) eller de svin i bugspytkirtlen elastase (PPE)-induceret emfysem model, generere KOL-lignende læsioner i lungerne og luftvejene men ikke ellers ligner patogenesen af menneskelige KOL. En cigaretrøg (CS)-induceret model er en af de mest populære, fordi det ikke kun simulerer KOL-lignende læsioner i luftvejene, men det er også baseret på en af de vigtigste farlige materialer, der forårsager KOL i mennesker. Men de tidskrævende og arbejdskrævende aspekter af modellens CS-induceret dramatisk begrænse dens anvendelse i nye stof screening. I denne undersøgelse genereret vi med succes en ny KOL model ved at udsætte mus til høje niveauer af ozon. Denne model viste følgende: 1) faldt tvungen ekspirationsvolumen 25, 50 og 75/tvunget vital kapacitet (FEV25/FVC, FEV50/FVC og FEV75/FVC), der angiver forværringen af lungefunktion; 2) udvidet lunge alveolerne, med lunge parenkymalt ødelæggelse; 3) reduceret træthed tid og afstand; og 4) øget inflammation. Taget sammen, viser disse data, at ozon eksponering (OE) model er en pålidelig dyremodel, der ligner mennesker fordi ozon overeksponering er en af de ætiologiske faktorer af KOL. Desuden, tog det kun 6-8 uger, baseret på vores tidligere arbejde, at skabe en OE model, der henviser til, at det kræver 3-12 måneder til at fremkalde cigaretrøg model, der angiver, at OE model kunne være et godt valg for KOL forskning.

Introduction

Det er blevet anslået, at KOL, herunder emfysem og kronisk bronkitis, kunne være den tredje hyppigste årsag til dødsfald i verden i 20201,2. Potentielle forekomsten af KOL i en befolkning over 40 år gamle skønnes for at være 12,7% hos mænd og 8,3% hos kvinder inden for de næste 40 år3. Ingen medicin er i øjeblikket tilgængelig at vende den gradvise forværring i KOL patienter4. Pålidelig dyremodeller for KOL ikke kun kræve efterligning af patologiske sygdomsprocessen men også kræver et kort generation periode. Nuværende KOL modeller, herunder LP'ER eller en PPE-induceret model, kan fremkalde emfysem-lignende symptomer5,6. En enkelt administration eller en uge-lang udfordring af LP'ER eller PPE til mus eller rotter resulterer i markant neutrofili i bronchoalveolar lavage væske (BALF), øger pro-inflammatoriske mediatorer (fx TNF-α og IL-1β) i BALF eller serum, producerer lung parenkymalt ødelæggelse, udvidede luft rum, og grænser luftstrømmen5,6,7,8,9,10. Dog LP'ER eller PPE er ikke årsagerne til menneskelige KOL og dermed efterligne ikke den patologiske proces11. En CS-induceret model produceret en vedvarende luftstrømmen begrænsning, lunge parenkymalt ødelæggelse, og reduceret funktionelle motion kapacitet. Men en traditionel CS protokollen kræver mindst 3 måneder til at generere en KOL model12,13,14,15. Det er således vigtigt at generere en ny, mere effektiv dyremodel, der opfylder de to krav.

For nylig, supplement rygning, luftforurening og erhvervsmæssig eksponering er blevet mere almindelige årsager til KOL16,17,18. Ozon, som en af de vigtigste forurenende stoffer (dog ikke det vigtigste element i luftforurening), kan direkte reagerer med luftvejene og ødelægge lungevæv af både børn og unge voksne19,20,21 ,22,23,24,25. Ozon, samt andre Stimulatorer, herunder LP'ER, PPE og CS, er involveret i en alvorlig af biokemiske veje af pulmonal oxidativ stress og DNA-skader og er knyttet til indledningen og fremme af KOL26,27. En anden faktor er, at symptomerne på nogle KOL patienter forværres efter at være udsat for ozon, der angiver, at ozon kan forstyrre lunge funktion18,28,29. Derfor, vi skabt en ny KOL model af gentagne gange udsætter mus til høje koncentrationer af ozon i 7 uger; Dette resulterede i luftstrømmen defekter og lunge parenkymalt skader ligner dem i tidligere undersøgelser30,31,32. Vi udvidede OE protokol til hunmus i denne undersøgelse og gengivet korrekt emfysem observeret i mandlige mus i vores tidligere undersøgelser30,31,32. Fordi KOL dødeligheden er faldet i mænd, men øget hos kvinder i mange lande33, en KOL model i hunner er nødvendigt at studere mekanismerne og udvikle terapeutiske metoder for kvindelige KOL-patienter. Anvendeligheden af OE model til alle køn giver yderligere støtte til dets anvendelse som en KOL model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: The OE model har skabt og brugt i tidligere rapporterede forskning 30 , 31 , 32. Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) i Shanghai Jiaotong Universitet.

1. mus

  1. hus patogenfrie, 7 til 9 uger gamle BALB/c hunmus i individuelle ventileret bure i en dyr facilitet under kontrolleret temperatur (20 ° C) og fugtighed (40-60%). Give en 12-timers lys og 12 h mørke cyklus i anlægget. Leverer mad og vand ad libitum.

2. Ozon eller luft eksponering

  1. Generer ozon med en elektrisk generator i en forsegling akryl (f.eks plexiglas) boks. Blæse luft ud af boksen ved hjælp af en lille blæser gennem en luft aftræksrør, som er tilsluttet på indersiden og ud af boksen. Overvåge koncentrationen af ozon i boksen ved hjælp af en ozon sonde. Vent indtil koncentrationen af ozon i boksen når 2,5 dele per million (ppm).
    Bemærk: Ozon sonden kan automatisk slukke ozon generator og kan opretholde ozon i boksen på 2,5 ppm.
  2. Placere mus i boksen når niveauet for ozon når 2,5 ppm. Holde mus i æske til 3 h hver gang for at udsætte dem for ozon.
    Bemærk: Boksen kan opretholde en ozon niveau på 2,5 ppm under 3 h ved automatisk og frakobling af ozon generator og blæser CO 2 der er produceret af mus ud af æsken.
  3. Give to ozon eksponeringer (hver eksponering varig 3 h) pr. uge (en gang hver 3 dag) i 7 uger, udsætte kontrol mus til luft på samme tid og i samme periode.

3. Mikro-computertomografi

  1. i slutningen af uge 7, bedøver mus med en intraperitoneal injektion af pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) justere dosis efter individuelle situationer at se, at musen ikke reagere på en tå knivspids. skærm og holde musen på en jævn vejrtrækning frekvens; og sørg for ingen frivillige bevægelser eksisterer under procedurerne.
  2. Placere de bedøvede mus i salen af en mikro-beregnet tomografi (µCT).
  3. Kalibrere µCT ved hjælp af standard-protokol og fabrikanten ' s instruktioner. Indstille X-ray tube på 50 kV og aktuelt på 450 µA.
    Bemærk: Begge X-ray og detektoren rotere omkring musene.
  4. Udføre µCT analyse ved at erhverve 515 fremskrivninger med en effektiv pixelstørrelse 0.092 mm, en eksponeringstid på 300 ms for én skive og skive tykkelse 0.093 mm.
  5. Rekonstruere lungen med de erhvervede billeder ved hjælp af en software. Justere gråtone billede lysstyrke ved at angive minimum og maksimum af gråtonet på-750 og-550 Hounsfield enheder, hhv.
    Bemærk: Softwaren vil automatisk beregne mængden af lunge parenkym og lav-dæmpning område (LAA) 34 , 35.
  6. Beregne procentdelen af LAA (LAA %) ved at dividere LAA volumen samlede lunge-volumen.

4. løbebånd Test

  1. Give mus en tilpasning tester med en hastighed på 10 m/min. i 10 min. på en kørende løbebånd machine. Bemærk: El er altid slukket når proceduren føres.
  2. administrere en træthed test til mus.
    1. Varme op mus med en hastighed på 10 m/min. 5 min.
    2. Øge hastigheden til 15 m/min. i 10 min.
    3. Øge træningens intensitet: øge hastigheden af 5 m/min., startende fra 20 m/min, al mulig 30 min indtil mus kan ikke fortsætte med at køre 36.
  3. Optage løbe distance og køretid som træthed afstand og tid, træthed, henholdsvis alt.

5. pulmonal funktion målinger

  1. bedøver mus med en intraperitoneal injektion af pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) justere dosis efter individuelle situationer at se, at musen gør ikke reagerer på en tå knivspids og vente, indtil mus har fastholdt spontan vejrtrækning. skærm og holde musen på en jævn vejrtrækning frekvens; og sørg for ingen frivillige bevægelser eksisterer under procedurerne.
  2. Omhyggeligt tracheostomize mus og placere dem i en krop plethysmograph, der er tilsluttet en computer-styrede ventilator.
    Bemærk: Ventilation er styret via en ventil, placeret proksimalt til den endotrakealtube. Opsætningen giver forskellige semi-automatiske manøvrer, herunder manøvre af kvasistatiske pres volumen og manøvre hurtigt flow volumen.
  3. Pålægge gennemsnitligt vejrtrækning hyppigheden af 150 vejrtrækninger/min til de bedøvede musen via pres-kontrolleret ventilation indtil en regelmæssig åndedrætsmønster og komplet udløb ved hver vejrtrækning cyklus er opnået.
  4. Udfører kvasistatiske tryk-volumen manøvre med enheden ved hjælp af det negative pres genereret i plethysmograph.
  5. Udfører hurtig flow volumen manøvre inden for de kvasistatiske tryk-volume sløjfer til at registrere FVC og FEV. Puste lungen til + 30 cm H 2 O og umiddelbart bagefter tilslutte det til et meget negativt pres at håndhæve udløb indtil residualvolumen er på-30 cm H 2 O. post FEV i de første 25, 50 og 75 ms af udånding (FEV 25 FEV 50 og FEV 75, henholdsvis). Afvis de suboptimale manøvrer. For hver test med hver enkelt mus, gennemføre mindst tre acceptabel manøvrer at få en pålidelig betyde for alle numeriske parametre.

6. BALF samling

  1. efter terminal anæstesi med pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8-2,4 ml/100 g) justere dosis efter individuelle situationer at se at musen ikke reagerer på en tå knivspids og miste ånde), lavage den mus med 2 mL PBS, via en 1 mm-diameter endotrakealtube og derefter hente BALF 10.
  2. Pool hentet lavage delprøver og centrifugeres dem ved 4 ° C og 250 x g i 10 min.
  3. Indsamle supernatanten til øjeblikkelig brug og gemme resten på-80 ° C eller flydende nitrogen.
  4. Tæller antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer.
  5. Resuspenderes celle i PBS og derefter spin (1.400 x g, 6 min.) 250 µL af resuspenderede celler på dias ved hjælp af et dias spinner centrifuge.
  6. Anvende Wright farvning på celler på dias ifølge producenten ' s protokol.
  7. Tæller 200 celler pr. mus; identificere cellerne som makrofager eller neutrofiler, ifølge standard morfologi, under 400 X forstørrelse, og tælle deres tal.

7. Hjertets blod prøvetagning

  1. indsamle blod via hjerte punktering, læg det i 1,5 mL rør, og holde det på is i 30 min.
  2. Centrifugeres blodprøver i 5 min på 2.000 x g og 4 ° C.
  3. Overføre supernatanten (serum) til en ny tube og gemme det på-80 ° C eller flydende nitrogen.
  4. Forberede serum for IL-1β, IL-10, og ved hjælp af de respektive ELISA kits test til påvisning af TNF-α.

8. Lunge morfometrisk analyse

  1. dissekere lungerne og tracheas fra mus.
    1. Position hver aflivede mus på en kirurgisk bord straks efter ofringen.
    2. Dissekere væk platysma og anterior trakeal muskler til at visualisere og få adgang til de trakeal ringe.
    3. Åbne op for thorax hulrum. Dissekere lungerne og luftrøret, men ikke adskille hjertet fra lungerne.
  2. Tilsluttes en sprøjte indeholdende 4% PARAFORMALDEHYD gennem en PE90 polyethylen rør endotracheal kateteret.
    Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt. Bære handsker og sikkerhedsbriller og bruge løsning inde i et stinkskab.
  3. Puste lungen helt ved hjælp af 4% PARAFORMALDEHYD (10 dråber, ~ 200 µL) gennem endotracheal kateteret. Fjern hjertet efter afslutningen inflation.
  4. Bevar lunge i en 15 mL tube indeholder 10 mL af 4% PARAFORMALDEHYD for mindst 4 h.
  5. Embed lunge i paraffin. Få 5 µm sektioner af paraffin blok skæring med en Rotationsmikrotom. Under skæring, udsætte det maksimale areal af lungevæv inden for området bronchiale træ.
  6. For morfometrisk analyse, udføre hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning på afsnittene.
  7. Billede afsnittene med lysfelt opretstående mikroskop (mål linse, 20 X, eksponeringstid, 1.667 ms).
  8. Har to efterforskere blindet behandling protokol uafhængigt tælle de histologiske sektioner. Brug de gennemsnitlige lineær skæringspunkt (L m) som en parameter til måling af afstand af indbyrdes alveolær septal væggen. Bestemme L m ved hjælp af følgende trin:
    1. åbne billeder af sektionerne i Photoshop og tegne en reticule-gitter på billedet med fem 550 µm lange linjer.
    2. Tælle antallet af alveolerne på tværs af gitterlinje.
    3. Beregner L m ved at dividere længden af linjen gitter med antallet af alveolerne. Kvantificering, image fem sektioner pr. mus. Erhverve ti billeder af hvert afsnit (ét billede pr. felt) og vurdere tilfældigt. I feltet udvælgelse, undgå felter af luftvejene og skibe ved at flytte et felt frem eller i en anden retning.
      Note: Data er præsenteret som den gennemsnit ± S.E.M. En un-parret t-test blev gennemført for sammenligning mellem luft-eksponerede mus og ozon-eksponerede mus. Tre dyr i hver gruppe blev brugt til at beregne den store forskel. En p-værdi på < 0,05 blev betragtet som væsentlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempler på 3D µCT billeder af hver gruppe er vist i figur 1en. Ozon-eksponerede mus havde en betydeligt større samlede lunge volumen (figur 1en og b) og LAA % (figur 1c) end gjorde luft-eksponerede kontrol mus. Lunge volumen og LAA % forblev forhøjet efter seks uger af ozon eksponering31,32. Øget lunge volumen og LAA % repræsenterer emfysem fænotype. Eksempler på lunge alveolær udvidelsen i figur 2en illustrere emfysem dannelse. En stigning i den gennemsnitlige lineær skæringspunkt (Lm) blev observeret i ozon-eksponerede mus (figur 2b), som bekræftede, at lunge parenkymalt ødelæggelse opstod efter ozon eksponering.

Lungefunktion blev målt af luftstrømmen hastighed parametre, vist som FEV25/FVC, FEV50/FVC og FEV75/FVC. Resultaterne viste, at alle de parametre, der faldt i ozon-eksponerede mus (fig. 3a-c) var i overensstemmelse med de typiske lunge funktionelle defekter i KOL patienter4,37. Yderligere evaluering OE model, gennemført vi en øvelse tolerance test, i stedet for 6-minutters gang test (6MWT)38,39, som er almindeligt anvendt til at vurdere ændringer i funktionelle motion kapacitet i KOL-patienter. Ozon eksponering faldt betydeligt træthed tid og træthed afstand (figur 4en og b).

For at løse patogenesen af KOL i OE model, blev makrofager og neutrofiler talt fra BALFs af mus; pro-inflammatoriske cytokiner (IL-1β og TNF-α) og anti-inflammatoriske cytokiner (IL-10) blev opdaget i mus sera. Ozon-eksponerede mus viste en betydelig stigning i inflammatoriske celler, makrofager og neutrofiler (figur 5a-c), samt en betydelig nedgang i IL-10 og en forøgelse af IL-1β og TNF-α (figur 6a-c ). Alle data viste, at OE model sammenfattet menneskelige KOL-lignende symptomer.

Figure 1
Figur 1. Ozon eksponering øget lunge volumen og LAA % opdaget af µCT. a repraesentative 3D billeder viser lunger af luft - eller ozon-eksponerede mus på 7 uger efter de respektive eksponering. b individuel samlede lunge mængder af de to grupper blev udvundet fra 3D-billeder for statistik. Ozon-eksponerede mus viste en betydelig stigning i samlede lunge volumen. c individuelle og gennemsnitlige LAA % for de to grupper. Ozon-eksponerede mus viste en betydelig stigning i LAA %. Den røde farve angiver LAA (voxels med tætheder af 2.550-2.700 Hounsfield enheder). Luftrør og bronkier vist med rødt i denne figur blev fjernet for at beregne lunge LAA. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± S.E.M. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Ozon eksponering øget Lm. a repraesentative micrographs af lunge alveolære rum i han-farvede dele af luft-eksponerede eller ozon-eksponerede mus. (b) individuelle værdier af Lm var kvantificeres fra afsnittene lunge i de to grupper for statistik. Der konstateredes en stigning i Lm i ozon-eksponerede mus. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± S.E.M. ** P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Ozon eksponering faldt pulmonal funktion. (a-c) For både luft-eksponerede og ozon-eksponerede mus, de enkelte FEV i de første 25, 50 og 75 ms af hurtige udløb (FEV25, FEV50og FEV75, henholdsvis), samt FVC, var alle optaget. Procenter af FEV25, FEV50og FEV75 til FVC blev beregnet særskilt. FEV25/FVC, FEV50/FVC og FEV75/FVC alle faldt betydeligt i ozon-eksponerede mus. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Ozon eksponering faldt træthed tid og træthed afstand. (a) individuelle løb gange for luft - eller ozon-eksponerede mus blev registreret. Ozon-eksponerede mus viste en betydelig nedgang i træthed tid. (b) enkelte kører afstande på de to grupper var optaget. Ozon-eksponerede mus udstillet en betydelig nedgang i træthed afstand. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± S.E.M. * P < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Inflammatoriske celler tælles fra BALF. (a) individuelle og gennemsnitlige antal samlede celler (TOTAL) i luft - eller ozon-eksponerede mus. b individuel og gennemsnitlig tal af makrofager (MAC) i de to grupper. c individuelle og gennemsnitlige antal neutrofile (NEU) i de to grupper. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

ithin-side = "1" >Figure 6
Figur 6 . Inflammatoriske og anti-inflammatorisk cytokin påvisning i serum. (a) individuelle og gennemsnitlige værdier af mængden af IL-10 i luft - eller ozon-eksponerede mus. (b) individuelle og gennemsnitlige værdier af mængden af IL-1β i de to grupper. c individuelle og gennemsnitlige værdier af mængden af TNF-α i de to grupper. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± S.E.M. * P < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi en pålidelig metode til at generere en ny KOL model. Sammenlignet med andre modeller (dvs. LP'ER eller PV-modeller), sammenfatter denne OE model den patologiske proces af KOL-patienter. Fordi cigaretrøg er den vigtigste farligt materiale, der forårsager KOL i menneskelige patienter40, stadig CS modellen den mest populære KOL model41,42. CS modellen kræver dog en 3 - 12 måneder R & D periode for nye lægemidler. I forhold til CS-model, reducerer den nuværende OE model perioden generation til 6-8 uger. Vi har observeret emfysem i mandlige mus efter 6 uger af eksponering for ozon i vores tidligere undersøgelser30,31,32. I denne undersøgelse, vi påføres hunmus OE protokol for 7 uger og med succes genereret en kvindelig OE model. Fordi det er blevet rapporteret, at KOL dødelighed har faldet i mænd men øget hos kvinder i nogle lande33, er det nødvendigt at studere de patogene mekanismer og udvikle kur tilgange for kvindelige KOL-patienter ved hjælp af en kvindelig KOL model. Vi ved, at de ovennævnte KOL modeller (dvs. LP'ER, PPE og CS) kan arbejde i både mandlige og kvindelige dyr43. Formålet med dette arbejde var at foreslå en yderligere KOL model, der både sammenfatter den patologiske proces af KOL-patienter og kræver en meget kort generation-periode.

Det vigtigste skridt for at generere denne model var udsætter mus til ozon (på et niveau på 2,5 ppm) to gange om ugen (en gang hver 3 dag) for 6-8 uger (i denne undersøgelse, brugte vi 7 uger, selvom vi ikke prøve dosis eskalering). Ved at kontrollere de kritiske parametre for eksponering frekvens og ozonkoncentration, gengivet vi med held emfysem i mandlige C57BL/6 mus31,32, mandlige BALB/c mus30og BALB/c hunmus (nuværende undersøgelse). Emfysem fænotype resulterede fra ozon eksponering, med luftstrømmen begrænsning og lunge parenkymalt ødelæggelse svarende til de ændringer i KOL patienter44,45.

Der er stadig begrænsninger for denne undersøgelse. For eksempel, fordi patogenesen af menneskelige KOL er relateret til anatomi i lungerne, skal en ideel KOL model genereres i dyr, der har en pulmonal anatomiske struktur ligner mennesker. Sammenlignet med store dyr, besidder små dyr endnu mindre omfattende luftvejene forgrening end mennesker46. Vi må indrømme, at det ville være mere meningsfyldt at generere en KOL model i store dyr. Det er imidlertid meget vanskeligt at etablere omfattende modeller i dyr. En anden begrænsning af denne model er den kliniske relevans. Selv om det er sikkert, at ozon kan reagere med luftvejene og beskadige lunge væv19,22, og selv om der er beviser for, at symptomerne på nogle KOL patienter forværres efter udsættelse for ozon28, ozon er ikke den vigtigste årsag til KOL patienter. Vi er dog stadig foreslår og bruge denne OE model, fordi både ozon og CS beskadige luftvejene ved overtalelse inflammation og føre til oxidativt stress26,27. Således et nyt lægemiddel, der kan helbrede KOL i OE model kan brobygningsforløbene også arbejde i CS-model og derfor potentielt være udviklet til KOL-patienter.

Anvendelser af OE model er ikke begrænset til decifrere de molekylære og cellulære mekanismer af KOL. Vores to nyere artikler undersøgte også effekten af N-acetylcystein (NAC)31 og NaHS32 (en eksogen donor af H2S) til behandling af KOL via eksogene administrationen af de to stoffer til OE model. I den første undersøgelse fandt vi en tilbageførsel af airway hyper-lydhørhed og en reduktion af luftvejene glat muskelmasse efter indgift af NAC. Disse virkninger kan angive grundlaget for kliniske fordele af NAC i KOL patienter31. I den anden undersøgelse af OE model fandt vi, at administrationen af eksogene NaHS omvendt lungebetændelse og delvis tilbageført træk ved emfysem. Således, med denne OE model, vi viste i en forundersøgelse, NaHS kunne udvikles som en potentiel kandidat i medicin til KOL patienter32. Derfor, OE model har potentielle anvendelsesmuligheder for både mekanisme forskning og stof screening for KOL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Z.W.S. og WW er nuværende medarbejdere og aktieoptionsprogram indehavere af gruppen cellulære biomedicin (NASDAQ: CBMG). Andre Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed over for Mr. Boyin Qin (Shanghai Public Health kliniske Center) for den tekniske bistand med µCT evaluering i denne protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
  2. Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
  3. Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
  4. Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
  5. Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
  6. Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
  7. Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
  8. Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
  9. Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
  10. Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
  11. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
  12. Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
  13. Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
  14. Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
  15. Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
  16. Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S. Air pollution and COPD. Postgrad Med. 62, 124-127 (1977).
  17. Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
  18. DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
  19. Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
  20. Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
  21. Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
  22. Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
  23. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
  24. Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
  25. Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
  26. Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
  27. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
  28. Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
  29. Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
  30. Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
  31. Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
  32. Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
  33. Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
  34. Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
  35. Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
  36. Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
  37. Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
  38. ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
  39. Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
  40. Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
  41. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
  42. Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
  43. Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
  44. Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
  45. U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
  46. Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).

Tags

Medicin sag 126 kronisk obstruktiv lungesygdom kronisk bronkitis emfysem luftstrøm begrænsning lunge parenkymalt ødelæggelse ozon eksponering
Generation af en kronisk obstruktiv lungesygdom Model i mus ved gentagne ozon eksponering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter