Summary
Tilgængeligheden af somatiske SCs er afgørende for regenerativ medicin, sygdom modellering og få indsigt i SC egenskaber. Præsenterer her vi eksperimentelle strategier til at omprogrammere, in vitro, differentieret voksne celler ind i deres tilsvarende udvideligt væv-specifikke stem/stamceller af forbigående udtryk for den enkelt transcriptional Co aktivator YAP.
Abstract
Her præsenterer vi protokoller for at isolere primære differentierede celler og drej dem i stem/stamceller (SCs) af samme slægt af forbigående udtryk for transskription faktor YAP. Med denne metode konverteres luminale differentieret (LD) celler i mælkekirtlen mus til celler, der udviser molekylære og funktionelle egenskaber af brystkirtler SCs. YAP også slår fuldt differentierede i bugspytkirtlen eksokrine celler i pancreas kanalen-lignende stamfaderen. På samme måde til endogen, naturlige SCs, kan YAP-induceret stilk-lignende celler ("ySCs") i sidste ende udvides, som organoid kulturer lang sigt in vitro uden yderligere behov for ektopisk YAP/TAZ, som ySCs er udstyret med en arvelige selvstændig fornyelse SC-lignende tilstand.
Proceduren omprogrammering præsenteres her tilbyder muligheden for at generere og udvide in vitro- stamceller af forskellige væv kilder fra differentierede celler. Enkel udvidelse af somatiske celler ex vivo har konsekvenser for regenerativ medicin, for forståelse mekanismer af tumor indledning og generelt for celle og udviklingsmæssige biologi undersøgelser.
Introduction
Væv-specifikke somatiske stamceller (SCs) er kritiske for fornyelse af væv og reparation efter skade. Mulighed for at nemt isolere og ubegrænset udvide ex vivo somatiske SCs repræsenterer et kritisk spørgsmål for potentielle regenerative behandlinger samt for SC applikationer i grundforskning og sygdom modellering. Fremskridt i denne retning, men har været begrænset af vanskeligheden ved at indfange SC staten af forskellige epitelial organer in vitro. Faktisk i flere voksen væv bosiddende SCs kan ikke findes eller ikke være let tilgængelige, eller deres antal og regenerativ potentiale kan blive udhulet af ældning eller sygdom forhold. I 2016, begyndte vi at udfylde dette hul ved at rapportere dette udtryk for en enkelt transcriptional coactivator, YAP (ja-forbundet protein) eller dens nært beslægtede proteiner TAZ (transcriptional activator med en PDZ motiv), i terminalt differentieret celler effektivt skaber funktionelle, kan udvides, ikke-tumorfremkaldende, autologe cellepopulationer, der er operationelt og molekylært skelnes fra deres tilsvarende væv-specifikke SCs1. En puls af vedvarende YAP eller TAZ aktivitet for få dage er tilstrækkelig til at fremkalde udseendet af selvstændig fornyelse somatiske SCs. Dette er en stabil tilstand, der er ikke længere afhængige af kontinuerlig transgen udtryk, som det kan overføres gennem celle generationer uden yderligere udtryk for ektopisk YAP/TAZ1. Protokollen præsenteres her detaljer proceduren, der bruges til at generere de novo epitelial stem/stamceller i mælkekirtlen og bugspytkirtel, startende fra differentierede celler i disse væv. Denne procedure fylder en sort boks i den nuværende omprogrammering/transdifferentiation arena. Vigtigste bestræbelser i disse retninger har faktisk indtil videre centreret på celle overgang til slutbrugeren inducerede pluripotente stamceller (iPSC), efterfulgt af konvertering af disse embryonale og pluripotente SCs i mere differentierede celler. IPSCs er dog tumorfremkaldende en gang indført i voksent væv, at øge behovet for at udvikle protokoller til deres fuldstændige og effektive differentiering2. Men denne differentiering skridt, selv når det er muligt, kommer til en pris af langsigtede udvidelsesmuligheder, selvorganisering og orgel genindsættelse potentialer. Disse er væsentlige attributter for orgel regeneration, der er faktisk typisk kun af endogene væv-specifikke SCs og af de i øjeblikket beskrevet YAP-induceret SCs (ySCs). Ligeledes differentierede direkte transdifferentiation i én celletype til en anden ved hjælp af cocktails af forskellige transskription faktorer også generere celler, der mangler væsentlige proliferativ og stemness potentielle3.
Proceduren beskrevet her også udnytter den nyligt indførte organoid teknologi, hvorved endogene SCs kan udvides og differentieret ex vivo4. YAP-induceret SCs kan generere organoid-dannende SCs selv i eksperimentel, biologiske eller sygdom betingelser hvor endogene SCs ikke er til stede. Vi vil gerne bemærke, at typen celle plasticitet formidles af YAP på forskellen med andre omprogrammering procedurer, kan svare til den eneste form for tilbagevenden til et SC-lignende status, der opstår i levende væv. Genfangst af SC-lignende træk har været forbundet med væv reparation eller muterede aktivering5. Selvom undværes for homeostase af flere voksen væv, er YAP og/eller TAZ absolut afgørende for regenerering, tumorvækst og ekspansion af somatiske SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Protocol
Alle dyr procedurer blev udført overholder vores retningslinjer for institutionelle og godkendt af OPBA og Sundhedsministeriet
1. generation af YAP-induceret Mammary stilk-lignende celler (yMaSCs)
Bemærk: Alle medier og løsning kompositioner for punkt 1 er angivet i tabel 1.
- Isolering af primære brystkirtler cellepopulationer
- Forberede under en celle kultur hætte: engangs skalpeller, hyaluronidase løsning, dissociation medium, Hæmolytisk løsning, sortering løsning, kollagen I belægning løsning, Ca2 + chelaterende løsning, vask medium #1, vaske medium #2, dispase løsning, brystkirtler 2D næringssubstrat, ice kolde HBSS/PS.
- For en typisk eksperiment, ofre 10 hunmus (enten CD-1 C57BL/6 stamme), 8-12 uger gamle af cervikal dislokation. Sterilisere maven med rigelige 70% ethanol opløsning før dissektion.
- Dissekere mælkekirtler ved at gøre en Y-formet incision langs abdominal huden og forsigtigt adskille kirtler fra bughinden ved forsigtigt at trække med Dumont pincet. Placere de dissekerede kirtler i en ikke-celle klæbende fad med 10 mL is kold HBSS/PS (20 kirtler for hver parabol), og sørg for ikke at bære over enhver hud fragment.
- Under en vævskultur hætte, vaske hver kirtel engang i 10 mL frisk HBSS/PS og placere dem i en tom ikke-celle klæbende fad (20 kirtler for hver tallerken). Brug ikke vævskultur plader, som celler vil have tendens til at holde sig til dem medfører betydelige tab af materiale.
- Fint hakke mælkekirtlerne med skalpeller, indtil en homogen blanding af 1 mm3 fragmenter. Genskab det hakkede væv fra hvert fad i 10 mL af dissociation medium med 25 mL serologisk pipette til at undgå tilstopning og overføre suspension i en 50 mL konisk slange pipettering mindst 5 x for at disaggregate væv klumper.
Bemærk: For en effektiv fordøjelse, ordentlig hakning af væv i trin 1.1.5 er afgørende. - Inkuber i 1 time ved 37 ° C med kontinuerlig kraftig omrystning. Efter 1 time, check homogenatet og forlænge inkubation af 10 min, hvis klumper er stadig til stede. Spin ned den fordøjede væv ved 400 x g i 5 min. ved stuetemperatur og supernatanten. Resuspenderes væv i 3 mL af hæmolytisk opløsning og inkuberes 3 min på is.
Bemærk: Hæmolyse er en temmelig barsk behandling, så strenge timing er afgørende på dette trin. - Vaske cellerne med 10 mL af vask medium #1, spin ned den fordøjede væv ved 400 x g i 5 min og supernatanten. Væv resuspenderes i 10 mL af vask medium # 2 og plade i 10 cm vævskultur retter. Inkuber retter i 1 timer ved 37 ° C i en celle kultur inkubator.
Bemærk: Dette trin vil tillade fjernelse af størstedelen af fibroblaster, der skal holde sig til fadet, kultur. - Genskab cellesuspension fra opvasken og hældes i en 50 mL konisk slange. Spin på 400 x g i 5 min og fjerne supernatanten. Vaske pelleten to gange i 10 mL af den Ca2 + chelaterende løsning af spinning ned på 400 x g for 5 min hver gang. Resuspenderes i 5 mL 0,25% Trypsin/EDTA og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
- Tilsættes 5 mL dispase på toppen af trypsin løsning og supplere med DNase 1μg/mL. Pipetteres op og ned på mindst 5 x gennem en 1 mL-tip til disaggregate DNA klumper og inkuberes i 10 min. ved 37 ° C, ryster hver 3 min.
- Tilsættes 10 mL vask medium #2 og filter i en ny 50 mL konisk slange gennem en 40 μm celle si. Spin ned cellesuspension ved 400 x g i 5 min og supernatanten, gør sikker hen til fjerne al væsken.
- Rensning af brystkirtler epitelceller af FACS
- Forbered antistof mix ved at tilføje 10 μL Lin (mus lineage antistof cocktail), 12 μl anti-CD326 (Ep-CAM), til en slutkoncentration på 30 ng/mL, 10 μl anti-CD49f, til en endelig koncentration på 25 ng/mL, 10 μl anti-CD61, til en slutkoncentration på 10 ng/mL , 2,5 μl anti-CD29, til en slutkoncentration på 2,5 ng/mL.
Bemærk: fra denne trin for trin 1.3, altid opererer i mørke, at undgå blegning af fluorescently mærket antistoffer. For hver pellet: - Holde et lille antal celler (ved at dyppe et 100 μL tip i toerstoffet) i en separat tube. Resuspend celler i 500 μL af sortering løsning i FACS rør og holde på is som umærkede prøven for FACS procedure.
- Resuspend hver pellet i 200 μl af vask medium #1, tilføje 44,5 μl antistof mix, afpipetteres grundigt og Inkuber i 30 min på is i mørke. Fortyndet cellesuspension i 10 mL af vask medium #1, spin ned på 400 x g i 5 min og supernatanten.
- Resuspenderes celle i sortering løsning sættes 2 mL og filtreres gennem et cap-si FACS tubeand videre til FACS-adskillelse af cellepopulationer (som i figur 1B). Før du udfører multicolor FACS protokollen, Sørg for at korrigere for de mulige spillover af hver fluorokrom i hver af de andre. For at gøre dette, inkuberes hver fluorophore-konjugeret antistof separat med cellesuspension og måle spektral overlapning værdier for alle fluorophores og i alle detektorer, via single-farve kontrol, for at skabe en kompensationsmatrix.
Bemærk: I dette eksperiment, udstyret med 85 μm dyse sidesorteringen var ansat. En typisk forberedelse fra 10 kvindelige mus vil give ca 800.000 LD celler. Fortsæt til sekundære filtrering hvis klumper form under FACS procedure.
- Forbered antistof mix ved at tilføje 10 μL Lin (mus lineage antistof cocktail), 12 μl anti-CD326 (Ep-CAM), til en slutkoncentration på 30 ng/mL, 10 μl anti-CD49f, til en endelig koncentration på 25 ng/mL, 10 μl anti-CD61, til en slutkoncentration på 10 ng/mL , 2,5 μl anti-CD29, til en slutkoncentration på 2,5 ng/mL.
- Såning af primære brystkirtler LD celler
- Under FACS procedure coat en multi godt vævskultur plade med kollagen jeg belægning løsning. Inkuber i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator. Fjerne belægning løsningen og vask med vask medium #1 lige før plating.
- Vaske cellerne inddrives fra FACS procedure med 10 mL vaskeopløsning #1, spin ned 400 x g i 5 min og fjerne supernatanten. Resuspenderes celle i Brystkirtlerne 2D næringssubstratet (500 µL/brønd) og kollagen behandlet plade. Lad celler sidder i en celle kultur inkubator for 48 h til at tillade korrekt celle vedhæftet fil og spredning.
Bemærk: For en typisk sortering fra 10 kvindelige mus, 6-8 brønde med en 24-godt multi godt plade vil give en optimal celle tæthed (100 000 celler/brønd).
- Induktion af yMaSCs (YAP-induceret brystkirtler stamceller)
Bemærk: Fra dette skridt videre, alle procedurer bør udføres BSL-2 betingelser.- Forberede brystkirtler koloni medium. Frisk tilføje matrixen basalmembranen til medium lige før celle såning.
- Til induktion af YAP-induceret brystkirtler stamceller (yMaSCs), transduce de primære LD celler af lentiviral infektion ved at blande en mængde af FUdeltaGW-rtTA viral supernatanten, et rumfang supernatant, FUW-Millie-YAP (eller TAZ), med to bind af serumfrit brystkirtler 2D næringssubstratet 2 x koncentrationer af kosttilskud, i en samlet maengde paa 500 mL. Inkuber celler med lentiviral supernatanter for 48 h. For en typisk lentiviral forberedelse, henvises til online protokol22.
- Efter infektion, vaske vedhængende celler og behandle med brystkirtler 2D næringssubstratet suppleret med 2 µg/mL doxycyclin at fremkalde eksogene YAP (eller TAZ) genekspression. Bruge celler inficeret med Tom, EGFP eller YAPS94A udtrykker vektorer eller celler inficeret med inducerbar YAP (eller TAZ) vektorer, men venstre uden doxycyclin som negative kontroller.
Bemærk: Vellykket infektion kan valideres af qRT-PCR med primere specifikke for menneskelige YAP transgen, som tidligere beskrevet1. - Efter 7 dage af induktion med doxycyclin, frigør vedhængende celler ved inkubering med 0,05% Trypsin/EDTA (150 μl/brønd) i 10 minutter ved 37 ° C; Stop trypsinization ved fortynding 1:5 i vask medium #2 (600 μl/brønd) og tælle celler. Resuspend celler i Brystkirtlerne koloni medium (1 mL for hver brønd), suppleret med 2 μg/mL doxycyclin og frø med en clonogenic tæthed på 1.000 celler/brønd i 24-godt ultralow monteringsbeslag.
Bemærk: Sørg for, at brystkirtler koloni mediet er iskold på tidspunktet for basalmembranen matrix tilsætning. Matrixen basalmembranen skal altid opbevares ved-20 ° C ved ankomsten og optøet langsomt ved 4 ° C natten over; Når optøet, skal det altid være håndteret på isen, ifølge producentens retningslinjer. - Når YAP-udtrykker LD celler starte prolifererende og vokse som MaSC-lignende kolonier i suspension (yMaSC kolonier) (14 dage efter såning), tælle og proces for yderligere analyse (figur 1 c).
Bemærk: Negativ kontrol celler (jævnfør punkt 1.4.3) forbliver som enkelt celler. - Genopbygge kultur med friske brystkirtler koloni Medium hver 72 h inden for 14 dage af yMaSC koloni vækst; at gøre dette forbereder en alikvot af brystkirtler koloni medium uden 5% basalmembranen matrix, suppleret med 10 x koncentration af kosttilskud og tilføje 1:10 af den samlede mængde i hver brønd (f.eks. 100 μl i 1 mL af total medie), til at undgå overdreven fortynding af matrix suspension.
- Sub dyrkning af yMaSCs
- Genskab de primære kolonier fra brystkirtler koloni medium, og derefter tage afstand og reseed.
Bemærk: yMaSC kolonier stammer fra YAP-omprogrammeret LD celler erhverve selvfornyelse kapacitet og kan være held sub kulturperler uden yderligere doxycyclin administration (dvs, uafhængigt af udtryk af transgene YAP/TAZ). - Forberede, under en celle kultur hætte, brystkirtler koloni medium som i trin 1.4.1 og brystkirtler organoid medium.
- Indsamle hver prøve, og der inkuberes i den overskydende mængde (10:1) is koldt HBSS for 1 h på is, for at solubilize matrixen basalmembranen. Vaske kolonier 3 x ved centrifugering ved 180 x g i 5 min og resuspend i is koldt HBSS. Inkuber kolonier i 0,05% trypsin/EDTA i 10 minutter ved 37 ° C til indhente en enkelt cellesuspension. Pipette kolonier op og ned 10 x med en p1000 tip til at sikre komplet dissociation til enkelt celle niveau.
- Tælle og reseed celler i Brystkirtlerne koloni medium (1 mL for hver brønd) uden doxycyclin med en clonogenic tæthed på 1.000 celler/brønd i 24-godt ultralow monteringsbeslag. Gentag dette passaging procedure hver 10-14 dage for at vurdere selvfornyelse.
- Før den tredje passage, passage yMaSC kolonier i organoid kultur betingelser, til at forbedre yMaSC ekspansion og give mulighed for dannelse af mini-kirtler, der selv organiserer i en bilayered epitel tæt minder om mælkekirtlen i vivo histologiske organisation.
- Tilbagesøge brystkirtler koloni medium som i trin 1.5.3 til 1.5.4 kolonier. Resuspend kolonier i 100% vækst faktor reduceret matrixen basalmembranen, i betragtning af at replate højst 20-25 kolonier for hvert hul i en 24-godt ultralow vedhæftet plade i 150 µL af matrixen.
- Inkuber plader i en celle kultur inkubator i 40 min ved 37 ° C og lad basalmembranen matrix størkne og derefter overlay geler med 500 μL af Mamma organoid medium.
- Efter et par dage kontrollere for dannelsen af kolonier til at danne spirende organoids (figur 1E).
- Efter 10-14 dage, passage eller proces organoids for yderligere analyse.
- Til passage organoids kulturer, gendanne organoids ved at indsamle hver prøve og inkubere i overskydende volumen (10:1) is koldt HBSS for 1 h på is, for at solubilize matrixen basalmembranen. Vask organoids 3 x af spin ned på 180 x g i 5 min og resuspend i is koldt HBSS.
- Inkubér organoids i 0,05% trypsin/EDTA i 10 minutter ved 37 ° C til indhente en enkelt cellesuspension. Pipette organoids op og ned 10 x med en p1000 tip til at sikre komplet dissociation til enkelt celle niveau.
- Reseed som en enkelt cellesuspension i en dråbe af 100% vækstfaktor nedsatte basalmembranen matrix (150 μl til hvert hul i en 24-godt ultralow vedhæftet plade). Lad basalmembranen matrix danner en gel af inkubere 40 min ved 37 ° C i en celle kultur inkubator og overlay geler med 500 μL af Mamma organoid medium.
Bemærk: yMaSC organoids kan være cryopreserved af inddrive fra 100% basalmembranen matrix kultur som i trin 1.5.13, undgå trypsinization. Lagre i Brystkirtlerne organoid medium suppleret med 10% DMSO. - Hurtigt fryse yMaSC organoids ved-80 ° C og derefter bevaret i flydende kvælstof.
- Genskab de primære kolonier fra brystkirtler koloni medium, og derefter tage afstand og reseed.
2. generation af yDucts
Bemærk: Alle medier og løsning kompositioner for sektion 2 er angivet i tabel 2.
- Isolering af primære pancreas acini
- Placer dissektion pincet og saks i 70% EtOH og forberede under en hætte acinar kultur cellekulturmedium, 15 mL for hver mus; acinar inddrivelse medium, 60 mL for hver mus; PBS/PS; stamopløsningen collagenase; collagenase jeg løsning A, 15 mL for hver mus; neutraliseret rotte hale kollagen jeg løsning. Neutralisere rotte hale kollagen I til pH = 7, ved at justere først med 0,1 N NaOH til buffer eddikesyre i som kollagen er opløst, og derefter med 10N HCl. Dilute til 2,5 mg/mL i PBS/PS. holde rotte hale kollagen jeg og alle reagenser på is til at neutralisere den. Ofre 6 til 9 uger gamle mus af ordentlig genotype.
- Sted hver mus på sin ryg, og vaske maven med 70% ethanol opløsning. Lave en langsgående indsnit langs den abdominale væg. Find og dissekere bugspytkirtlen (ved hjælp af milten som en guide) og placere det i en 10 cm ikke-celle klæbende parabol i 10 mL is kold PBS/PS. overføre retter umiddelbart under en celle kultur hætte. Fra dette trin og fremefter, virker altid under en celle kultur hætte.
- Overføre hver bugspytkirtlen i en ny ikke-celle klæbende parabol tidligere fyldt med 7 mL collagenase jeg løsning A.
- Hurtigt hakkekød hver bugspytkirtlen med et par engangs skalpeller, at opnå en homogen væv suspension af ca 1 mm3 fragmenter.
Bemærk: Det er vigtigt at bemærke, at denne fremgangsmåde tager ikke mere end 2 min til optimale cellernes levedygtighed. - Inkuber parabol for collagenase fordøjelsen ved 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator i 10 min, ryster hver 3 min for at sikre ensartet væv fordøjelsen.
- Genskab den fordøjede væv i en 50 mL konisk slange (en for hver bugspytkirtlen), vask skål med 10 mL af Acinar vask Medium og placere den i den samme 50 mL konisk tube, pipettering fordøjet væv op og ned ikke mere end 3 x.
- Spin ned fordøjet vævet i 5 min. ved 100 x g ved 18 ° C og Fjern supernatanten.
Bemærk: Spin ned celler ved 18 ° C lavere collagenase aktivitet under dette trin. - Resuspend vævet pellet i 7 mL collagenase opløsning A og hæld denne opløsning i en ny 10 cm ikke-celle klæbende parabol.
- Inkuber parabol til en anden runde af collagenase fordøjelsen ved 37 ° C i 10 min i skridt 2.1.5, ryster hver 3 min for at sikre ensartet væv fordøjelsen. I mellemtiden Forbered en ren 50 mL konisk tube for hver bugspytkirtlen toppet med en 100 μm celle si.
- Genskab det fordøjede væv og passere gennem 100 μm celle si ved udblødning væv med en steril 10 mL sprøjte stemplet (Sørg for at omhyggeligt Tryk ned i vævet, undgå vrid styrker tangerer si overflade). Vask skål med 10 mL af acinar vask medium, og passerer den samme 100 μm celle si denne 10 mL.
- Spin ned fordøjet vævet i 5 min. ved 100 x g ved 18 ° C og Fjern supernatanten.
- Gendanne væv pellet med 10 mL af acinar vask medium. Oploesningen celle i en 50 mL konisk slange allerede indeholder yderligere 10 mL af friske acinar vask medium, undgå overdreven pipettering til resuspension af toerstoffet.
- Spin ned fordøjet vævet i 5 min. ved 100 x g ved 18 ° C og Fjern supernatanten.
- Omhyggeligt resuspend fordøjet vævet i 6 mL af acinar recovery medium og distribuere den i 2 brønde af 6-godt multi godt vævskultur plade, 3 mL. Under et stereomikroskop omhyggeligt vurdere kvaliteten af den acinar isolation, der vises som en homogen suspension af acinar klynger, med en mindre andel af enkelt celler (Se figur 2B); Fjern alle store væv klumper i sidste ende præsentere (typisk ses også med det blotte øje), når der afpipetteres dem ud af løsningen.
- Såning af primære pancreas acini
- Inkuber de nedbrudte acinar klynger ved 37 ° C i en celle kultur inkubator for 2 h, for at muliggøre celle opsving.
- Under celle opsving frakke 48-godt multi brønde med 100 μL af neutraliseret rotte hale kollagen og Inkuber i 1 time ved 37 ° C i en celle kultur inkubator til at tillade en hydrogel pude til form.
- Efter 2 h af celle opsving, indsamle acinar cellesuspension i en konisk slange, spin ned til 5 min. ved 100 x g ved 18 ° C og Fjern supernatanten.
- Resuspend i acini i den passende mængde acinar næringssubstratet (150 μl til hver brønd med en 48 godt vævskultur plade). Frø hver dissocierede bugspytkirtlen i 16 brønd til at opnå en optimal tæthed (100-120 acinar klynger/brønd).
- Fortynde denne acinar suspension med et lige saa stort volumen af neutraliseret rotte hale kollagen jeg løsning, at holde rør på is. Bland omhyggeligt og hurtigt frø cellesuspension oven på kollagen pude beskrevet i 2.2.2 (300 μL til hver brønd med en 48 godt multi godt vævskultur plade).
- Inkubér 1 h ved 37 ° C i en celle kultur inkubator til at tillade en hydrogel til form.
- Induktion af pancreas organoids
- Overlay kollagen hydrogels med 500 μl af Acinar kultur Medium suppleret med 2 μg/ml doxycyclin for YAP-afhængige induktion af pancreas organoids fra R26-rtTAM2; Millie-YAPS127A mus; negative kontroller leveres af wt celler dyrkes i de samme betingelser eller R26-rtTAM2; Millie-YAPS127A celler dyrkes i mangel af doxycyclin.
- Kultur acinar celler i Acinar næringssubstratet suppleret med 2 μg/mL doxycyclin for 5 til 7 dage forfriskende næringssubstratet (300 μL/brønd) hver 48 h og efter organoid dannelse af morfologiske ændringer i retning af cyste danner duktalt-lignende strukturer ( Figur 2 c). Når organoids er dannet, celler kan passaged i bugspytkirtlen organoid kultur betingelser eller høstet for yderligere analyser (f.eks.: RNA udvinding, immunofluorescens).
- Sub dyrkning af pancreas organoids
- For at vurdere deres selvfornyelse kapacitet, alsidighed passage YAP-induceret pancreas organoids (yDucts) i tre-dimensionelle basalmembranen matrix hydrogels (pancreas organoid dyrkningsbetingelserne) uafhængigt af eksogene YAP/TAZ udbuddet (dvs. uafhængigt af doxycyclin administration).
- Forberede Trypsin 0,05%/EDTA; 100% vækstfaktor nedsatte basalmembranen matrix; Pancreas Organoid Medium og Collagenase jeg løsning B.
- Forberede en 15 mL konisk tube med 4 mL af Collagenase løsning B til hver brønd til at være passaged.
- Kassér næringssubstrat, omhyggeligt uddrag hydrogels fra brøndene ved blid aspiration og overføre dem til de koniske rør.
- Inkuber rør ved 37 ° C i 30 min, med kontinuerlig kraftig omrystning for at tillade fuldstændig nedbrydning af kollagen matrix (check hver 10 min indtil hydrogel er helt solubilized). Spin ned gendannede celler ved 750 x g i 2 min og Fjern supernatanten.
- Inkuber gendannede celler i 1 mL Trypsin 0,05%/EDTA i 10 minutter ved 37 ° C til at opnå en enkelt cellesuspension. Fortynd trypsin med 9 mL PBS 1 x, spin ned på 750 x g for 2 min og Fjern supernatanten.
- Resuspend celle pellet i is koldt vækstfaktor reduceret basalmembranen matrix og frø i ultra-lav monteringsbeslag (typisk en dråbe af 150 μl i et godt af en 24-godt plade).
- Lad basalmembranen matrix hydrogel størkne ved at inkubere plader i en celle kultur inkubator 40 min ved 37 ° C og derefter overlay med pancreas Organoid Medium (500 μl til hver brønd). yDucts vil vokse som cyste-lignende organoids i 7-10 dage (figur 2D).
- For yderligere passaging organoids kan fjernes fra basalmembranen matrix ved inkubation i is koldt PBS 1 x i 30 min, efterfulgt af vask 3 gange af spin ned på 180 x g til 5 min og resuspension i is koldt PBS 1 x for at undgå matrix fremførsel. Organoids er derefter adskilles med trypsin 0,05% for 10 min at få en enkelt celler suspension og tilsås i frisk basalmembranen matrix og derefter belagt med pancreas Organoid Medium (som 2.4.7-2.4.8).
- yDuct organoids kan være cryopreserved i flydende kvælstof ved at inddrive fra 100% basalmembranen matrix kultur som i trin 2.4.9, undgå trypsinization, og lagring i pancreas Organoid Medium suppleret med 10% DMSO.
- yDuct organoids er hurtigt fastfrosset på-80 ºC og derefter bevaret i flydende kvælstof.
Representative Results
Generation af yMaSCs
Overblik over den eksperimentelle strategi til at omprogrammere primære brystkirtler LD celler af forbigående udtryk af YAP er præsenteret i figur 1A. Primære brystkirtler LD epitelceller er renset af fluorescerende-aktiveret celle sortering13. Figur 1B repræsenterer en typisk sortering procedure at opnå tre forskellige delpopulationer: Basal celler (EpCAMlavCD49fhøjCD61-), luminale stamfader (LP) celler (EpCAMhøjCD49flavCD61+ ) og LD celler (EpCAMhøjCD49flavCD61-). Omhyggelig gating af de tre delpopulationer er afgørende for at isolere en ren forberedelse af LD celler, der er fuldt differentierede og helt vækst anholdt når seedede i mælkekirtlen kolonidannende betingelser (Se figur 1 c, venstre panel). Omvendt, når tilskyndet til at udtrykke eksogene YAP, LD celler begynde prolifererende for at danne letgenkendeligt tætte epitelial kolonier i 5% basalmembranen matrix suspension kulturer (figur 1 c). Effektiviteten af omprogrammering, attesteret omkring 3% for en typisk eksperiment, kan blive scoret ved at tælle antallet af kolonier over antallet af enkelt celler oprindeligt seedede i basalmembranen matrix suspension kulturer (fig. 1 d). Omprogrammerede luminale celler (yMaSCs) kan så være passage i 100% basalmembranen matrix organoid kultur betingelser (Se ordningen i figur 1A), selvstændige organisering i komplekse organoid-lignende strukturer, der udvikler omkring flere lumen og få vist bemærkelsesværdige selvfornyelse evne selv i mangel af doxycyclin (dvs. i mangel af transgene YAP udtryk) (figur 1E). Histologisk, yMaSC-afledte organoids vise en basal lag (K14 positive), står over for matrixen basalmembranen rekonstitueres ECM og en luminale lag (K8 positive), som står over for lumen-lignende hulrum i organoid (figur 1F). Denne arkitektur er skelnes fra organoids dannet af indfødte MaSCs (figur 1F).
Generation af yDucts
Overblik over den eksperimentelle strategi til at omprogrammere primære pancreas acini ved forbigående ekspression af YAP er præsenteret i figur 2A. Hele acinar klynger er isoleret fra størstedelen af pancreas væv af en kombination af mild dissociation og størrelse udstødelse gennem filtrering. En typisk forberedelse er præsenteret i figur 2B. Efter isolering, skal acinar celle klynger vises som en suspension af eksokrine acinar enheder af homogen størrelse, med ingen forurening af endokrine Langerhanske øer eller fragmenter af pancreas duktalt træ og minimal dissociation til enkelt celler. Forurening af endokrine Holme eller duktalt fragmenter er en indikation af mangelfuld selektiv filtrering (trin 2.1.10), muligvis på grund af barske håndtering; uønskede dissociation af acinar klynger til enkelt celler kan skyldes overdreven collagenase behandling eller unbuffered aktivitet af Proteolytiske enzymer frigivet af det væv, som kan bremses af supplerende SBTI behandling.
En typisk acinar omprogrammering eksperiment er præsenteret i figur 2 c; inden for 5-7 dage af kultur i 3D kollagen-baseret hydrogel i overværelse af doxycyclin, pancreas acini stammer fra R26-rtTAM2/Millie-YAPS127A mus let vende i kanalen-lignende klynger (at vi hedder yDucts), består af en tynd éncellelag af epitelceller, der formere sig omkring en ekspanderende centralt hulrum. Omprogrammering effektivitet, hvilket er omkring 70% til en typisk eksperiment, kan let måles ved at score antallet af kanalen-lignende klynger over det samlede antal seedede acini (figur 2D). Den negative kontrol celler, dvs R26-rtTAM2 / + celler eller R26-rtTAM2/Millie-YAPS127A celler venstre uden doxycyclin, altid forblive som post mitotiske acinar klynger i disse dyrkningsbetingelser, som tidligere rapporteret1 ,14,15. Omprogrammerede yDucts kan derefter passaged på niveauet enkelt celle ind i Matrigel-baseret organoid kultur betingelser16 (Se ordningen i figur 2A), vise bemærkelsesværdige selvfornyelse evne selv i mangel af doxycyclin (dvs. i mangel af transgene YAP udtryk) (figur 2E).
Figur 1: Dyrkning af primære brystkirtler LD celler og induktion af brystkirtler stamceller. (A) skematisk gengivelse af forsøgsmetoden vedtaget for at omprogrammere primære brystkirtler LD celler. (B) repræsentant FACS-plots illustrerer en typisk sortering procedure at rense LD celler. i) dissocierede celler er gated ifølge frem og side scatter for levende celler (P1, blå); II) befolkning P1 er derefter yderligere gated ifølge sin Lin profil: delpopulation af afstamning-negative celler (P2; grey) er valgt, undtagen afstamning-positive hæmatopoietisk celler; III) befolkning P2 er derefter adskilles i en EpCAMhøj (P3; gul + grøn) og en EpCAMlav (P6, red) delpopulationer; IV) P3 og P6 er derefter yderligere gated ifølge deres CD61/CD49f profil i tre delpopulationer: EpCAMlavCD49fhøjCD61- basale celler (P7, red), EpCAMhøjCD49flavCD61+ LP celler (P8, gul) EpCAMhøjCD49flavCD61- LD celler (P9; grøn). (C) billeder er illustrerende for LD celler, inficeret med de angivne konstruktioner, evne til at danne brystkirtler kolonier 15 dage efter såning i Brystkirtlerne koloni medium. Kun YAP-udtrykker celler tur i kolonidannende celler, hvorimod negativ kontrol celler (EGFP-inficeret) forbliver som vækst-anholdt enkelt celler. Skalalinjen = 50 μm. (D) kvantificering af kolonidannende evne til de angivne celler, som i (C). Data præsenteres som middelværdi + s.d. og er repræsentative for fem uafhængige eksperimenter, hver med seks tekniske replikater. (E) repræsentativt billede af YAP-omprogrammeret brystkirtler stamcelle-lignende celler (yMaSCs) efter 12 dage i organoid kultur betingelser i frisk tredimensionale 100% basalmembranen matrix hydrogel i mangel af doxycyclin. Skalalinjen = 100 μm. (F) repræsentative immunofluorescens billeder for den basale markør K14 (grønne) og den luminale markør K8 (rød) af organoids stammer fra de angivne celler, efter 12 dage i organoid kultur betingelser. Skalalinjen = 10 μm. Denne figur er gengivet fra Panciera et al., 20161. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Isolering af primære pancreas acinar celler og induktion af pancreas stamfaderen. (A) skematisk gengivelse af forsøgsmetoden vedtaget for at omprogrammere primære pancreas eksokrine acinar celler. (B) repræsentativt billede af primære pancreas acini lige efter isoleret procedure (trin 2.1.14). Den acinar forberedelse skal vises som en homogen suspension af acinar klynger, med minimal tilstedeværelsen af enkelt celler. Skalalinjen = 400 μm. (C) repræsentative billeder af primære pancreas acini stammer fra R26-rtTAM2 (øverste paneler)eller R26-rtTAM2; Millie-YAPS127A (lavere paneler) mus og kulturperler i 3D-kollagen-baseret hydrogel i 5 dage med eller uden Doxycyclin (doxy), som angivet. Kun konvertere YAP-udtrykker primære acini celler vokser som cyste-lignende organoid efter doxycyclin tilsætning. Skalere barer = 70 μm. (D) kvantificering af pancreas acini evne til at danne duktalt organoids ved transgene YAP overekspression som i (C). Data præsenteres som middelværdi + s.d. og er repræsentative for fem uafhængige forsøg, udført med fire tekniske replikater. (E) repræsentativt billede af YAP-reprogramed duktalt-lignende celler (yDucts) efter tre passager i frisk tredimensionale 100% basalmembranen matrix hydrogel i mangel af doxycyclin. Skalalinjen = 130 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Isolering af primære brystkirtler celler | |
| Ca2 + chelaterende løsning | Opbevares ved 4 ° C |
| EDTA | 0,02% w/V |
| PBS | |
| Kollagen jeg belægning løsning | |
| Eddikesyre 0.02N, pH 3,23 | |
| Rotte hale kollagen (belægning) | 1:50 |
| Dispase løsning | Opbevares ved 4 ° C |
| Dispase | 5 mg/ml |
| PBS | |
| Dissociation Medium | |
| DMEM:F12 | |
| Hyaluronidase stamopløsning | 400 U/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Stamopløsningen collagenase jeg | 600 U/mL |
| Hæmolytisk løsning | Opbevares ved 4 ° C |
| NH4Cl løsning | 1 dele |
| TrisBase 20.6 g/L | 9 dele |
| justere pH til 7.2 | |
| HBSS/PS | Opbevares ved 4 ° C |
| HBSS | |
| Pen/Strep | 2 x |
| Hyaluronidase stamopløsning | Filter 0,2 µm, opbevares ved 4 ° C |
| Hyaluronidase fra kvæg testiklerne (pulver) | 2.000 U/mL |
| Natriumfosfat Buffer 1 M pH7.3 | |
| NH4Cl løsning | Opbevar ved T. amb. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7.1 g/L |
| justere pH til 7.65 | |
| Sortering løsning | Filter 0,2 µm, opbevares ved 4 ° C |
| BSA | 0,1% |
| EDTA | 1 mM |
| HEPES pH 7 | 25 mM |
| PBS | |
| Vaske Medium #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Vaske Medium #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| Pen/Strep | 1 x |
| Brystkirtler 2D næringssubstratet | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| heparin | 4 mg/mL |
| L-glutamin | 1 x |
| murine bFGF | 10 ng/mL |
| murine EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Induktion og Passaging af yMaSCs | |
| Brystkirtler koloni Medium | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| heparin | 4 µg/mL |
| L-glutamin | 1 x |
| Matrigel (tilføje umiddelbart før såning) | 5% |
| murine bFGF | 20 ng/mL |
| murine EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Brystkirtlerne Organoid Medium | |
| Avancerede DMEM:F12 | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| heparin | 4 µg/mL |
| Hepes | 1 x |
| menneskelige Noggin | 100 ng/mL |
| murine bEGF | 20 ng/mL |
| murine EGF | 50 ng/mL |
| R-Spondin 1 | 1 µg/mL |
Tabel 1: Generation af yMaSCs. Sammensætning af alle forskellige dyrkningsmedier og løsninger kræves for isolation af primære brystkirtler LD celler og induktion af yMaSCs (afsnit 1.)
| Isolering af primære pancreas acini | |
| Acinar næringssubstratet | |
| BPE | 50 µg/mL |
| BSA | 0,1% |
| Dexamethason | 1 µg/mL |
| FBS | 0,1% |
| ITS-X | 1 x |
| Pen/Strep | 1 x |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Waymouth's Medium | |
| Acinar vask Medium | |
| BSA | 0,1% |
| Pen/Strep | 1 x |
| RPMI Medium | |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Acinar inddrivelse Medium | |
| Acinar næringssubstratet | |
| FBS | 30% |
| Collagenase jeg opløsning A | |
| Acinar vask Medium | |
| Stamopløsningen collagenase jeg | 360 U/mL |
| PBS/PS | Opbevares ved 4 ° C |
| PBS (fosfatbufferet saltopløsning) | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Stamopløsningen collagenase jeg | Opbevares ved-20 ° C |
| Collagenase, type jeg (pulver) | 6.000 U/mL |
| PBS | |
| Passaging af pancreas organoids | |
| Collagenase jeg løsning B | |
| PBS 1 x | |
| Stamopløsningen collagenase jeg | 240 U/mL |
| Pancreas Organoid Medium | |
| Avanceret DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| gastrin | 10 nM |
| menneskelige FGF10 | 100 ng/mL |
| menneskelige Noggin | 100 ng/mL |
| murine EGF | 50 ng/ml |
| N-acetylcystein | 1,25 mM |
| Nicotinamid | 10 mM |
| Pen/Strep | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 mg/mL |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
Tabel 2: Generation af yDucts. Sammensætning af alle forskellige dyrkningsmedier og løsninger kræves for isolation af primær acinar celler og induktion og passaging af yDucts (afsnit 2.)
Discussion
Her præsenterer vi protokoller for at omprogrammere ex vivo terminalt differentieret epitelceller af forskellige væv ind i deres tilsvarende væv-specifikke stamceller (eller ySCs) ved forbigående ekspression af YAP, som rapporteret tidligere1. Vi har detaljerede to procedurer: en giver mulighed for omprogrammering af FACS-renset celler gennem lentiviral vektorer og en anden en, der undgår viral infektion og drager fordel af transgene YAP udtryk. Hver protokol præsenterer en effektiv strategi til at isolere og kultur primære differentierede celler og en strategi til at tvinge eksogene YAP genekspression i differentierede celler, generere de novo somatiske væv-specifikke udvides stamceller (jf. ordninger i figurer 1A og 2A).
Vi viste, at isolation strategier her præsenteret effektivt isolerer en ren population af differentierede celler, som det fremgår af det faktum, at vi aldrig fundet nogen udvækst fra negative kontrolprøver (tal 1 c og 2 C).
De lentiviral vektorer bruges i denne undersøgelse for omprogrammering af primære brystkirtler LD celler er doxycyclin inducerbar, tilbyder muligheden for en stram kontrol af transgenet udtryk; Dette giver mulighed for at tænde og slukke eksogene YAP udtryk på vil. Særlig opmærksomhed bør placeres i at undgå brugen af en overdreven viral titer, som dette kan være til skade for omprogrammering effektivitet. I tilfælde af primær acinar celler skiftede vi til en fuldt transgene tilgang til at opnå en YAP-afhængige omprogrammering med minimal manipulationer. Denne sidstnævnte strategi er også yderst velegnede til primær Pancreas acini, som isolerede acinar klynger er næppe imødekommenhed over for lentiviral infektion og meget skrøbelig. Den transgene strategi ansat tilbyder den samme fordel af doxycyclin-afhængige lentiviral vektorer for stram kontrol af genekspression. Desuden, den transgene strategi udnyttes med primære pancreas acini bærer den yderligere fordel af en meget højere omprogrammering effektivitet i forhold til viral-induceret omprogrammering af brystkirtler LD celler. Ud over de forskellige iboende plasticitet forbundet til celler, der stammer fra forskellige væv, kan den højere sats af pancreas omprogrammering være afledt fra den højere effektivitet af udtryk i forbindelse til ensartet og autonome YAP udtryk i alle eksplanterede celler. Især, har vi vist, at eksogene YAP er ikke længere nødvendig efter generation af ySCs (yMaSC kolonier og yDucts), uden at det påvirker deres selvfornyelse kapacitet. Dette er fordi ySCs genaktivere endogene YAP/TAZ og bruge dem til selvfornyelse, når eksogene YAP er slukket1.
Vi valideret forestillingen om, at ySCs faktisk opstå fra differentierede celler ved at kontrollere cellen i oprindelsen af vores omprogrammering eksperimenter gennem genetiske afstamning sporingen valideringer1.
Omfattende karakteriseringaf ySCs viser at YAP-induceret omprogrammering genererer normale somatiske SCs1 som jeg) på niveauet transkriptom ySCs vise massive overlapninger med indfødte SCs; II) ySCs vise differentiering potentielle og kan generere en multilineage afkom altid begrænset til identiteten af deres væv af oprindelse; III) ySCs er ikke-transformeret og ikke-tumorfremkaldende når transplanterede i vivo.
Her vi også beskrive procedurer for at opretholde og udvide i kultur både yMaSCs og yDucts som organoids indlejret i 100% basalmembranen matrix hydrogels. Disse betingelser giver mulighed for selv-organisering af ySCs i tre-dimensionelle organoids, der sikrer opretholdelsen af stemness egenskaber langsigtede i kultur, gør det muligt at udvide disse stamceller befolkninger på viljen til downstream analyser og applikationer. Af ukendte årsager, kunne vi ikke få yMaSC organoids ved at placere inficeret LD celler direkte i organoid kultur betingelser 7 dage efter doxycyclin behandling i plast vævskultur plade; med andre ord, er det mellemliggende vækst skridt i Brystkirtlerne koloni betingelser afgørende. I vores hænder kræver selv indfødte MaSCs brystkirtler koloni betingelser før passaging i organoid kultur. Desuden opnås den mest effektive organoid udvækst når vi undgå skaber de primære kolonier i enkelt celler, men snarere overføre de intakte kolonier i organoid kultur betingelser.
Organoid kultur betingelser også bærer fordel af at give mulighed for at cryopreserve ySCs, forudsat at organoids inddrives fra deres matricer, undgå celle dissociation før kryopræservering i kvælstof bad.
YAP omprogrammering procedure præsenteret kan konvertere forskellige differentieret celletyper stammer fra forskellige voksen væv i deres tilsvarende væv-specifikke stamceller (vi har testet den ved hjælp af brystkirtler, pancreas og neuronale celler)1. Til forskel fra iPSCs eller andre omprogrammering bestræbelser, kan YAP/induceret SCs bevare minderne om deres væv af oprindelse. Bemærk, nedtrapning differentiering af somatiske celler i cellerne begavet med stilk-lignende egenskaber er den eneste form for celle skæbne plasticitet og omprogrammering observeret in vivo, for eksempel efter vævsskader og understøtter sårheling5,17 , 18 , 19 , 20. det er bemærkelsesværdigt, at BJÆFFE og TAZ er i vid udstrækning undværes for normal homøostase, men afgørende for væv reparation i flere væv11,21. Konsekvent med en fysiologisk funktion af omprogrammering trin her beskrevet, har YAP/TAZ for nylig vist sig at være påkrævet i tarm regenerering i musemodeller af colitis ulcerosa patienter ved at forårsage en konvertering af voksne intestinale celler i en reparation epitel, der viser funktionerne i føtal gut19. YAP omprogrammering således udvider de nuværende induceret celle plasticitet strategier ved at give et middel til at generere somatiske stamceller, en stat, der har hidtil udfordrende for at fange in vitro. Denne fremgangsmåde, hvis udvides også til menneske-afledte celler, måske har bred relevans fra regenerativ medicin programmer til studiet af den somatiske stemness tilstand og til udbygning af somatiske stamceller celler in vitro.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker F. Camargo for gaven af Millie-YAPS127A mus; R26-rtTAM2 mus (stock #006965) blev købt fra The Jackson laboratorium. Vi takker Chiara Frasson og Giuseppe Basso hjælp til FACS procedurer. Dette arbejde støttes af AIRC særlige Program molekylære klinisk onkologi '' 5 promille '' og en AIRC PI-tilskud til Pia og ved Epigenetik flagskibsprojekt CNR-Miur tildeler S.P. Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale DENOVOSTEM nr. 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
