Summary
Beschikbaarheid van somatische SCs is van cruciaal belang voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en inzicht te krijgen in de eigenschappen van de SC. Hier presenteren we experimentele strategieën om te herprogrammeren, in vitro, gedifferentieerde volwassen cellen in hun overeenkomstige uitbreidbaar weefsel-specifieke stam/voorlopercellen door de voorbijgaande uitdrukking van de enkele transcriptionele co activator YAP.
Abstract
Hier presenteren we protocollen voor het isoleren van primaire gedifferentieerde cellen en zet die ze in de stengel/voorlopercellen (gcv) van het zelfde geslacht door voorbijgaande uitdrukking van de transcriptiefactor YAP. Met deze methode worden luminal gedifferentieerde (LD) cellen van de melkklier muis omgezet in cellen die moleculaire en functionele eigenschappen van borstklieren SCs. YAP ook bochten volledig gedifferentieerde alvleesklier exocrine cellen in de alvleesklier buis-achtige vertonen progenitoren. Op dezelfde manier aan endogene, natuurlijke SCs, kunnen YAP-geïnduceerde stam-achtige cellen ("ySCs") worden uiteindelijk uitgebreid als organoid culturen lange termijn in vitro, zonder verdere nood van ectopische YAP/TAZ, zoals ySCs zijn begiftigd met een erfelijke zichzelf vernieuwende SC-achtige toestand.
De herprogrammering procedure hier gepresenteerd biedt de mogelijkheid om te genereren en uit te breiden van in vitro voorlopercellen van verschillende weefsel bronnen vanaf van gedifferentieerde cellen. De eenvoudige uitbreiding van somatische cellen ex vivo heeft gevolgen voor regeneratieve geneeskunde, voor het begrijpen van mechanismen van tumor inleiding en, meer in het algemeen, voor de cel en ontwikkelingsbiologie studies.
Introduction
Weefsel-specifieke somatische stamcellen (gcv) staan kritisch tegenover voor weefsel vernieuwing en herstel na blessure. De mogelijkheid om gemakkelijk isoleren en onbeperkt uitbreiden ex vivo somatische SCs vertegenwoordigt een kritieke kwestie voor potentiële regeneratieve therapieën, evenals voor SC toepassingen in basisonderzoek en modellering van de ziekte. Vooruitgang in die richting, is echter beperkt gebleven door de moeilijkheid van het vastleggen van de toestand van de SC van verschillende epitheliale organen in vitro. Inderdaad, in verschillende volwassen weefsels resident SCs kunnen niet bestaan of niet gemakkelijk beschikbaar zijn of hun aantal en regeneratieve potentieel kunnen worden aangetast door veroudering of ziekte omstandigheden. In 2016, we begonnen te vullen deze kloof door te rapporteren die uitdrukking van een enkele transcriptionele coactivator, YAP (ja-geassocieerde proteïne) of de nauw verwante eiwit TAZ (transcriptionele activeren met een motief van PDZ), in terminaal gedifferentieerde cellen efficiënt creëert functioneel, uitbreidbaar, niet-tumorigene autologe cellen met populaties die zowel operationeel als moleculair niet te onderscheiden van hun overeenkomstige weefsel-specifieke SCs1. Een puls van aanhoudende YAP of TAZ activiteit voor paar dagen is voldoende voor het opwekken van het uiterlijk van de somatische SCs zelf te vernieuwen. Dit is een stabiele toestand, die niet langer afhankelijk van continue transgenic expressie, zoals het via cel generaties zonder verdere uitdrukking van ectopische YAP/TAZ1kan worden overgedragen. Het protocol gepresenteerd hier details de procedure gebruikt voor het genereren van DOVO epitheliale stam-/ voorlopercellen van de melkklier en alvleesklier, vanaf van gedifferentieerde cellen van deze weefsels. Deze procedure vult een zwarte doos in de huidige herprogrammering/transdifferentiatie-arena. Belangrijkste inspanningen in deze richtingen hebben tot nu toe inderdaad gecentreerd op cel overgang naar een geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) staat, gevolgd door de omzetting van deze embryonale en pluripotente SCs in meer gedifferentieerde cellen. IPSCs zijn echter tumorigene eenmaal ingevoerd in volwassen weefsels, het verhogen van de noodzaak van het ontwikkelen van protocollen voor hun volledige en efficiënte differentiatie2. Echter, deze differentiatie stap, zelfs indien mogelijk, komt ten koste van langdurige uitbreidbaarheid, zelforganisatie en orgel herbevolking potentieel. Dit zijn essentiële kenmerken voor regeneratie van het orgel dat in feite typische alleen van endogene weefsel-specifieke SCs en het momenteel beschreven YAP-geïnduceerde SCs (ySCs). Ook gedifferentieerde directe transdifferentiatie van één celtype in een ander met behulp van cocktails van verschillende transcriptie factoren ook genereren cellen dat het gebrek aan essentiële proliferatieve en stemness potentiële3.
De hier beschreven procedure maakt ook gebruik van de onlangs geïntroduceerde organoid-technologie, waarmee endogene SCs kunnen worden uitgebreid en gedifferentieerd ex vivo4. YAP-geïnduceerde SCs kunnen genereren organoid-vormende SCs zelfs in experimentele, biologische of ziekte omstandigheden waarin endogene SCs niet aanwezig zijn. Wij zou willen opmerken dat, op het verschil met andere herprogrammering procedures, het soort plasticiteit van de cel bijgebracht door YAP kan corresponderen met de enige vorm van de terugkeer naar een SC-achtige status die in levende weefsels voorkomt. Reacquisition van SC-achtige eigenschappen is geassocieerd met weefselherstel of oncogene activering5. Hoewel overbodig voor de homeostase van verschillende volwassen weefsels, zijn YAP en/of TAZ absoluut essentieel voor regeneratie, tumorgroei en uitbreiding van somatische SCs in vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd vast te houden aan onze institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de OPBA en het ministerie van volksgezondheid
1. generatie van YAP-geïnduceerde Mammary stam-achtige cellen (yMaSCs)
Opmerking: Alle composities van de media en oplossing voor sectie 1 worden gespecificeerd in tabel 1.
- Isolatie van primaire borstklier cel populaties
- Bereiden onder de motorkap van een cel cultuur: wegwerp scalpels hyaluronidase oplossing, dissociatie medium, hemolytische oplossing, Sorteer oplossing, collageen ik coating oplossing, Ca2 + drogen oplossing, wassen medium #1, wassen middellange #2, dispase de oplossing, borstklier 2D kweekmedium, ijs koud HBSS/Psalm
- Voor een typisch experiment, offeren 10 vrouwelijke muizen (ofwel CD-1 van C57BL/6 stam), 8-12 weken oud door cervicale dislocatie. Het steriliseren van de buik met overvloedige 70% ethanol oplossing vóór dissectie.
- Ontleden de borstklieren door het maken van een Y-vormige incisie langs de buikhuid en zorgvuldig het scheiden van de klieren van het buikvlies door zachtjes te trekken met een Dumont Tang. Plaats de ontleed klieren in een niet-cel zelfklevende schotel met 10 mL ijs koud HBSS/PS (20 klieren voor elk gerecht), om ervoor te zorgen niet te voeren over een fragment van de huid.
- Onder de motorkap van een weefselkweek, wassen elke klier eenmaal in 10 mL verse HBSS/PS en plaats ze in een lege niet-cel zelfklevende schotel (20 klieren voor elk gerecht). Gebruik geen weefselkweek platen, aangezien de cellen de neiging vast te houden aan hen veroorzaakt aanzienlijk verlies aan materiaal.
- Fijn blad voor de borstklieren met scalpels totdat een homogene mengeling van 1 mm3 fragmenten wordt verkregen. Het gehakt weefsel herstellen van elk gerecht in 10 mL dissociatie medium met een precisiepipet 25 mL serologische te voorkomen verstopping en spoel de suspensie in een conische tube van 50 mL pipetteren minstens 5 x gedesag weefsel klontjes.
Opmerking: Voor een efficiënte spijsvertering, goede hakken van het weefsel in stap 1.1.5 is van cruciaal belang. - Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met continue krachtig schudden. Na 1 h, Controleer het homogenaat en incubatie verlengen door 10 min als klontjes nog steeds aanwezig zijn. Spin down het verteerd weefsel bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 3 mL hemolytische oplossing en incubeer 3 min op ijs.
Opmerking: Hemolyse is een vrij agressieve behandeling, dus strikte timing is van cruciaal belang bij deze stap. - Cellen met 10 mL van wassen medium #1 wassen, spin down het verteerd weefsel bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 10 mL van de wash medium # 2 en plaat in 10 cm weefselkweek gerechten. Incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij 37 ° C in een cel cultuur incubator.
Opmerking: Deze stap kan verwijdering van de meerderheid van de fibroblasten, die aan de cultuur-schotel voldoen moet. - Herstellen van de celsuspensie van de gerechten en giet in een conische tube van 50 mL. Draai bij 400 x g gedurende 5 min en elimineren van de bovendrijvende substantie. De pellet in 10 mL van de Ca2 + chelaat oplossing door spinnen neer bij 400 x g gedurende 5 min telkens twee keer wassen. Resuspendeer de pellet in 5 mL 0,25% trypsine/EDTA en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 5 mL van de oplossing van de dispase op de bovenkant van de trypsine-oplossing en aan te vullen met DNase ik 1μg/mL. Pipetteer op en neer ten minste 5 x via een 1 mL-tip gedesag DNA klontjes en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, iedere 3 minuten te schudden.
- 10 mL van wassen medium #2 en filter in een nieuwe conische tube van 50 mL toevoegen door een 40 μm cel zeef. Spin down de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant, ervoor zorgend om al vloeistof te elimineren.
- Zuivering van de borstklier epitheliale cellen door FACS
- Voorbereiden van de antilichaam-mix door toevoeging van 10 μL Lin (muis lineage antilichaam cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), om een eindconcentratie van 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, om een eindconcentratie van 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, om een eindconcentratie van 10 ng/mL , 2.5 μL anti-CD29, om een eindconcentratie van 2,5 ng/mL.
Opmerking: van deze stap voor stap 1.3, altijd werken in het donker, om te voorkomen dat bleken van de fluorescently gelabelde antilichamen. Voor elke pellet: - Houd een klein aantal cellen (door dompelen een 100 μl tip in de pellet) in een aparte buis. Resuspendeer de cellen in 500 μL van de oplossing in een buis FACS sorteren en houd op ijs als het labelloze monster voor de FACS procedure.
- Resuspendeer elke pellet in 200 μL van wassen medium #1, 44,5 μL van antilichaam mix toevoegen, Pipetteer grondig en incubeer gedurende 30 min op ijs in het donker. Verdun de celsuspensie 10 ml van wassen medium #1, spin down bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 2 mL oplossing sorteren en filteren door middel van een GLB-zeef FACS tubeand overgaan tot FACS-scheiding van de bevolking van de cel (zoals in figuur 1B). Voordat u het multicolor FACS-protocol uitvoert, ervoor om te corrigeren voor de mogelijke spillover van elke fluorescerende in elk van de anderen. Om dit te doen, elke fluorophore-geconjugeerde antilichaam afzonderlijk met de celsuspensie broeden en meten van spectrale overlap waarden voor alle fluorophores en in alle detectoren, via één kleur controles, om een compensatie-matrix maken.
Opmerking: In dit experiment, diasorteerderweergave uitgerust met 85 μm mondstuk werkte. Een typische bereiding op basis van 10 vrouwelijke muizen zal opleveren ongeveer 800.000 LD cellen. Ga verder naar secundaire filtratie als bosjes tijdens FACS procedure vormen.
- Voorbereiden van de antilichaam-mix door toevoeging van 10 μL Lin (muis lineage antilichaam cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), om een eindconcentratie van 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, om een eindconcentratie van 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, om een eindconcentratie van 10 ng/mL , 2.5 μL anti-CD29, om een eindconcentratie van 2,5 ng/mL.
- Zaaien van primaire borstklier LD cellen
- Tijdens de procedure FACS jas een multi goed weefselkweek plaat met collageen ik coating oplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator. Verwijder de coating-oplossing en wassen met wash medium #1 net voordat plating.
- Wassen cellen verhaald FACS procedure met 10 mL wassen oplossing #1, spin down 400 x g gedurende 5 minuten en elimineren van de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de pellet van de cel in de borstklier 2D kweekmedium (500 µL per putje) en collageen behandeld plaat. Laat de cellen zitten in een cel cultuur incubator voor 48 uur te voorzien van de juiste cel gehechtheid en verspreiden.
Opmerking: Voor een typische sortering van 10 vrouwelijke muizen, 6-8 putjes van een 24-well multi goed plaat zal opleveren een optimale celdichtheid (100 000 cellen per putje).
- Inductie van yMaSCs (borstklier stamcellen YAP-geïnduceerde)
Opmerking: Vanaf deze stap verder, alle procedures moeten worden uitgevoerd onder BSL-2 voorwaarden.- Bereiden borstklier kolonie medium. Vers de kelder membraan matrix aan het medium toevoegen net voor het zaaien van de cel.
- Voor de inductie van YAP-geïnduceerde borstklier stamcellen (yMaSCs), transduce de primaire LD cellen door lentivirale infectie door het mengen van een volume van virale supernatans dat FUdeltaGW-rtTA, één volume van het supernatans dat FUW-tetO-YAP (of TAZ), met twee volumes van borstklieren serumvrij 2D kweekmedium 2 x concentraties van supplementen, in een totaal volume van 500 mL. Incubeer de cellen met lentivirale supernatant gedurende 48 uur. Raadpleeg de on line protocol22voor een typische lentivirale preparaat.
- Na infectie, wassen Adherente cellen en behandelen met borstklier 2D kweekmedium aangevuld met 2 µg/mL doxycycline voor het opwekken van exogene YAP (of TAZ) genexpressie. Gebruik cellen geïnfecteerd met lege, EGFP of YAPS94A waarin vectoren of cellen besmet met afleidbare YAP (of TAZ) vectoren, maar links zonder doxycycline als negatieve controles.
Opmerking: Succesvolle infectie kan worden gevalideerd door qRT-PCR met primers specifiek voor mens YAP transgenic, als eerder beschreven1. - Na 7 dagen van inductie met doxycycline, loskoppelen Adherente cellen door incubatie met 0,05% trypsine/EDTA (150 μl per putje) gedurende 10 minuten bij 37 ° C; Stop trypsinebehandeling door verdunning 1:5 in wassen normaal #2 (600 μl per putje) en cellen tellen. Resuspendeer de cellen in het medium van de borstklier kolonie (1 mL voor elk putje), aangevuld met 2 μg/mL doxycycline en zaad bij een dichtheid van de clonogenic van 1000 cellen per putje in 24-well ultralow bijlage platen.
Opmerking: Zorg ervoor dat het medium van de borstklier kolonie ijskoud op het moment van matrixoptelling kelder membraan. De kelder membraan matrix moet altijd worden opgeslagen bij-20 ° C bij aankomst, en ontdooid langzaam bij 4 ° C's nachts; eenmaal ontdooid, moet het altijd worden behandeld op het ijs, volgens de richtlijnen van de fabrikant. - Eenmaal YAP-uiten LD cellen beginnen prolifererende en groeien als MaSC-achtige kolonies in suspensie (yMaSC kolonies) (14 dagen na het zaaien), tellen en verwerken voor verdere analyse (Figuur 1 c).
Opmerking: Negatieve controle cellen (zoals in punt 1.4.3) blijft als afzonderlijke cellen. - Vullen van de cultuur met verse borstklier kolonie Medium elke 72 h tijdens de 14 dagen van de groei van de kolonie van de yMaSC; om dit te doen een aliquoot gedeelte van de borstklier kolonie medium zonder 5% kelder membraan matrix, aangevuld met 10 x concentratie van supplementen voor te bereiden en het toevoegen van 1:10 van het totale volume aan elk putje (bv 100 μl in 1 mL totale voedingsbodem), om te voorkomen dat buitensporige verdunning van de schorsing van de matrix.
- Sub kweken van yMaSCs
- Herstellen van de primaire kolonies van het medium van de borstklier kolonie, dan distantiëren en reseed.
Opmerking: yMaSC kolonies afgeleid van YAP-geherprogrammeerd LD cellen verwerven van zelf-vernieuwing capaciteit en kunnen met succes sub gekweekte zonder verdere doxycycline administratie (dwz, onafhankelijk van de expressie van transgene YAP/TAZ). - Bereiden, onder de motorkap van een cel cultuur, borstklieren kolonie medium zoals in stap 1.4.1 en borstklieren organoid medium.
- Elk monster verzameld en broeden in de overtollige hoeveelheid (10:1) ijs koud HBSS gedurende 1 uur op het ijs, om de solubilize van de kelder membraan-matrix. Wassen van de kolonies 3 x door centrifugatie bij 180 x g gedurende 5 min en resuspendeer in ijs koud HBSS. Incubeer kolonies in 0.05% trypsine/EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Pipetteer kolonies op en neer 10 x met een p1000 tip om ervoor te zorgen volledige dissociatie tot één celniveau.
- Graaf en reseed cellen in het medium (1 mL voor elk putje) van de borstklier kolonie zonder doxycycline bij een dichtheid van de clonogenic van 1000 cellen per putje in 24-well ultralow bijlage platen. Herhaal deze procedure elke 10-14 dagen passaging om te beoordelen zelf-vernieuwing.
- Voor de derde passage, passage yMaSC kolonies in organoid kweekomstandigheden, ter verbetering van de yMaSC uitbreiding en te voorzien in de vorming van mini-klieren, die zichzelf in een bilayered epitheel nauw die doet denken aan de melkklier in vivo organiseren histologische organisatie.
- Herstellen kolonies van de borstklier kolonie medium zoals in stap 1.5.3 tot 1.5.4. Resuspendeer kolonies in 100% groeifactor verminderd de kelder membraan matrix, overwegen om een maximum van 20-25 kolonies voor elk putje van de plaat van een 24-well ultralow bijlage in 150 µL van de matrix replate.
- Incubeer de platen in een cel cultuur incubator voor 40 minuten bij 37 ° C en laat de kelder membraan matrix stollen en vervolgens bedekken de gels met 500 μL van de borstklier organoid medium.
- Controleer na een paar dagen voor de vorming van de kolonies naar formulier ontluikende organoids (figuur 1E).
- Na 10-14 dagen, passage of proces de organoids voor verdere analyse.
- Passage organoids culturen, organoids herstellen door het verzamelen van elk monster en broeden in overtollige hoeveelheid (10:1) ijs koud HBSS gedurende 1 uur op het ijs, om de solubilize van de kelder membraan-matrix. Wassen van organoids 3 x door spin down bij 180 x g gedurende 5 min en resuspendeer in ijs koud HBSS.
- Incubeer organoids in 0.05% trypsine/EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Pipetteer organoids op en neer 10 x met een p1000 tip om ervoor te zorgen volledige dissociatie tot één celniveau.
- Reseed als de schorsing van een eencellige in een daling van 100% groeifactor verminderde kelder membraan matrix (150 μl voor elk putje van de plaat van een 24-well ultralow bijlage). Laat de kelder membraan matrix een gel te vormen door het broeden van 40 minuten bij 37 ° C in een cel cultuur incubator en bedekken de gels met 500 μL van de borstklier organoid medium.
Opmerking: yMaSC organoids kan worden cryopreserved door herstellende is van 100% kelder membraan matrix cultuur zoals in stap 1.5.13, het vermijden van trypsinebehandeling. Opslaan in het medium van de borstklier organoid aangevuld met 10% DMSO. - Snel bevriezen de yMaSC organoids bij-80 ° C en vervolgens in vloeibare stikstof wordt bewaard.
- Herstellen van de primaire kolonies van het medium van de borstklier kolonie, dan distantiëren en reseed.
2. productie van yDucts
Opmerking: Alle composities van de media en oplossing voor sectie 2 worden gespecificeerd in tabel 2.
- Isolatie van primaire alvleesklier acini
- Plaats dissectie Tang en schaar in 70% EtOH en bereiden onder een cel cultuur kap acinaire kweekmedium, 15 mL voor elke muis; acinaire herstel medium, 60 mL voor elke muis; PBS/PS; stockoplossing collagenase I; Collagenase ik oplossing A, 15 mL voor elke muis; staart van de rat collageen geneutraliseerd ik oplossing. Neutraliseren van rat staart collageen I bij pH = 7, door eerst aanpassen met 0,1 N NaOH buffer van het azijnzuur in die de collageen wordt ontbonden, en daarna bij 10N HCl. Dilute tot 2,5 mg/mL in PBS/PS. houden de Rat staart collageen ik en alle reagentia op ijs te neutraliseren. 6 tot 9 weken oude muizen van het juiste genotype te offeren.
- Plaats elke muis op zijn rug, en wassen van de buik met 70% ethanol oplossing. Een longitudinale incisie langs de buikwand te maken. Zoeken en ontleden van de alvleesklier (met behulp van de milt als een gids) en plaats het in een 10 cm niet-cel zelfklevende schotel in 10 mL ijs koud PBS/PS. Transfer de gerechten onmiddellijk onder de motorkap van een cel cultuur. Vanaf deze stap, werken altijd onder de motorkap van een cel cultuur.
- Overdracht van elke alvleesklier in een nieuwe niet-cel zelfklevende schotel eerder gevuld met 7 mL collagenase ik oplossing A.
- Snel blad voor elke alvleesklier met een paar wegwerp scalpels, te verkrijgen van de opschorting van een homogene weefsel van ongeveer 1 mm3 fragmenten.
Opmerking: Het is belangrijk op te merken dat deze procedure niet meer dan 2 min voor de levensvatbaarheid van de optimale cellen moet nemen. - Incubeer de schotel voor collagenase vertering bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator voor 10 min., iedere 3 minuten om te verzekeren van homogene weefsel spijsvertering schudden.
- Herstellen van het verteerd weefsel in een conische tube van 50 mL (één voor elke alvleesklier), wassen van de schotel met 10 mL acinaire Wash Medium en plaatst u deze in de dezelfde conische tube van 50 mL, pipetting verteerd weefsel op en neer niet meer dan 3 x.
- Spin down het verteerd weefsel gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.
Opmerking: Spin down de cellen bij 18 ° C tot lagere collagenase activiteit tijdens deze stap. - Resuspendeer de weefsel pellet in 7 mL collagenase ik oplossing A en giet deze oplossing in een nieuwe 10 cm niet-cel zelfklevende schotel.
- Incubeer de schotel voor een tweede ronde van collagenase spijsvertering bij 37 ° C gedurende 10 minuten zoals in stap 2.1.5, schudden elke 3 min om homogene weefsel spijsvertering verzekeren. In de tussentijd bereiden een schone 50 mL conische buis voor elke alvleesklier gegarneerd met een 100 μm cel zeef.
- Het verteerd weefsel herstellen en de 100 μm cel zeef passeren door de macerating van het weefsel met een steriele 10 mL spuit zuiger (zorg ervoor dat u zorgvuldig druk naar beneden van het weefsel, vermijden van shear krachten tangentieel op het oppervlak van de zeef). Wassen van de schotel met 10 mL van acinaire wassen medium, en dit 10 mL passeren de dezelfde 100 μm cel zeef.
- Spin down het verteerd weefsel gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Herstellen van de pellet met 10 mL van acinaire wassen medium. Breng de oplossing van de cel in een conische tube van 50 mL al die extra 10 mL verse acinaire wassen medium, het vermijden van buitensporige pipetteren voor resuspensie van de pellet.
- Spin down het verteerd weefsel gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Zorgvuldig resuspendeer de verteerd weefsel in 6 mL acinaire herstel voedingsbodem en verdelen in 2 putten van elk 3 mL 6-well multi goed weefselkweek plaat. Onder een stereomicroscoop zorgvuldig beoordelen de kwaliteit van de acinaire isolatie, die worden weergegeven als een homogene suspensie van acinaire clusters, met een kleine deel van afzonderlijke cellen (Zie figuur 2B); verwijderen van een grote weefsel bosjes uiteindelijk presenteren (meestal zichtbaar ook met het blote oog), waarbij ze uit de oplossing.
- Zaaien van primaire alvleesklier acini
- Incubeer de verteerd acinaire clusters bij 37 ° C in een cel cultuur incubator voor 2 h, zodat voor het herstel van de cel.
- Tijdens de cel herstel vacht 48-well multi wells met 100 μl van geneutraliseerde rat staart collageen ik en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een cel cultuur incubator toe een hydrogel kussen te vormen.
- Na 2 h van cel herstel, verzamelen acinaire celsuspensie in een conische buis, spin down gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de acini in de juiste hoeveelheid acinaire kweekmedium (150 μl voor elk putje van de plaat van een 48 goed weefselkweek). Zaad elke gedissocieerde alvleesklier in 16 putten te verkrijgen van een optimale dichtheid (100-120 acinaire clusters per putje).
- Verdun deze acinaire suspensie met een gelijk volume geneutraliseerde rat staart collageen ik oplossing, houden van buizen op ijs. Meng zorgvuldig en snel het zaad van de celsuspensie bovenop het collageen kussen beschreven in punt 2.2.2 (300 μL voor elk putje van de plaat van een 48 goed multi goed weefselkweek).
- Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een cel cultuur incubator toe een hydrogel te vormen.
- Inductie van alvleesklier organoids
- Overlay collageen hydrogels met 500 μL van acinaire kweekmedium aangevuld met 2 μg/ml doxycycline voor YAP-afhankelijke inductie van alvleesklier organoids van R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A muizen; negatieve controles worden geleverd door wt cellen gekweekt in dezelfde voorwaarden of R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A cellen gekweekt in afwezigheid van doxycycline.
- Cultuur acinaire cellen in acinaire kweekmedium aangevuld met 2 μg/mL doxycycline voor 5 tot 7 dagen vernieuwen kweekmedium (300 μl per putje) elke 48 uur en na organoid formatie van de morfologische veranderingen richting cyste vorming ductaal-achtige structuren ( Figuur 2C). Zodra organoids worden gevormd, cellen kunnen worden gepasseerd in de alvleesklier organoid kweekomstandigheden of geoogst voor verdere analyses (bv: RNA extractie, immunofluorescentie).
- Sub kweken van alvleesklier organoids
- Voor de beoordeling van de capaciteit van hun zelf-vernieuwing, passage klonaal YAP-geïnduceerde alvleesklier organoids (yDucts) in drie-dimensionale kelder membraan matrix hydrogels (alvleesklier organoid kweekomstandigheden) onafhankelijk van exogene YAP/TAZ levering (dwz. onafhankelijk van het beheer van de doxycycline).
- Bereiden van trypsine 0,05%/EDTA; 100% groeifactor verminderde kelder membraan matrix; Alvleesklier Organoid Medium en Collagenase ik oplossing B.
- Bereiden een conische 15 mL tube met 4 mL Collagenase ik oplossing B voor elk putje te worden gepasseerd.
- Negeren kweekmedium, zorgvuldig hydrogels uittreksel uit de putten door behoedzame aspiratie en overbrengen naar de conische buisjes.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, met continue krachtig schudden zodat volledige spijsvertering van de collageen-matrix (check elke 10 min totdat de hydrogel is volledig ontbindend) buizen. Spin down herstelde cellen bij 750 x g gedurende 2 min en bovendrijvende vloeistof verwijderen.
- Incubeer herstelde cellen in 1 mL trypsine 0,05%/EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Verdun trypsine met 9 mL PBS 1 x draaien van bij 750 x g gedurende 2 min en bovendrijvende vloeistof verwijderen.
- Resuspendeer de pellet cel in ijs koud groeifactor verminderde kelder membraan matrix en zaad in ultra-lage bijlage platen (meestal een druppel 150 μl in een put van een 24-well-plate).
- Laat de kelder membraan matrix hydrogel stollen door het broeden van de platen in een cel cultuur incubator 40 minuten bij 37 ° C en vervolgens bedekken met alvleesklier Organoid Medium (500 μL voor elk putje). yDucts zal groeien als de cyste-achtige organoids in 7-10 dagen (figuur 2D).
- Voor verdere passaging organoids kan worden verwijderd uit kelder membraan matrix door incubatie in ijs koud PBS 1 x voor 30 min, gevolgd door wassen 3 keer door de spin naar beneden bij 180 x g gedurende 5 min en hersuspensie in ijs koud PBS 1 x om te voorkomen dat de overdracht van de matrix. Organoids worden dan losgekoppeld met trypsine 0.05% voor 10 min te verkrijgen van een schorsing van de afzonderlijke cellen en reseeded in verse kelder membraan matrix en vervolgens bedekt met alvleesklier Organoid Medium (zoals in 2.4.7-2.4.8).
- yDuct organoids kan worden cryopreserved in vloeibare stikstof door herstellende is van 100% kelder membraan matrix cultuur zoals in stap 2.4.9, trypsinebehandeling, vermijden en opslaan in de alvleesklier Organoid Medium aangevuld met 10% DMSO.
- yDuct organoids zijn snel bevroren bij-80 ºC en vervolgens in vloeibare stikstof wordt bewaard.
Representative Results
Generatie van yMaSCs
Een overzicht van de experimentele strategie om te herprogrammeren primaire borstklier LD cellen door voorbijgaande expressie van YAP is in figuur 1Agepresenteerd. Primaire borstklier LD epitheliale cellen zijn gezuiverd door tl-geactiveerde cel sorteren van13. Figuur 1B vertegenwoordigt een typische sorteren procedure voor het verkrijgen van drie verschillende subpopulaties: basale cellen (EpCAMlageCD49fhogeCD61-), Luminal voorlopercellen (LP) cellen (EpCAMhogeCD49flageCD61+ ) en LD cellen (EpCAMhogeCD49flageCD61-). Voorzichtig van de drie subpopulaties gating is essentieel voor het isoleren van een zuivere voorbereiding van LD-cellen, die volledig worden gedifferentieerd en volledig groei gearresteerd toen zaadjes in de melkklier kolonievormende voorwaarden (Zie Figuur 1 c, deelvenster links). Omgekeerd, wanneer geïnduceerde uitspreken exogene YAP, LD cellen beginnen prolifererende om te vormen gemakkelijk herkenbaar dichte epitheliale kolonies in 5% kelder membraan matrix schorsing culturen (Figuur 1 c). De efficiëntie van herprogrammering, geattesteerd ongeveer 3% voor een typisch experiment, gescoord kan worden door het tellen van het aantal kolonies over het aantal afzonderlijke cellen oorspronkelijk geplaatste in kelder membraan matrix schorsing culturen (Figuur 1 d). Geherprogrammeerde luminal cellen (yMaSCs) kunnen dan worden passage in 100% kelder membraan matrix organoid kweekomstandigheden (zie schema in figuur 1A), zelf-organiserende in complexe organoid-achtige structuren die rond meerdere lumen ontwikkelen en weergeven van opmerkelijke zelf-vernieuwing vermogen zelfs in afwezigheid van doxycycline (dat wil zeggen in de afwezigheid van transgene YAP expressie) (figuur 1E). Histologisch, yMaSC afkomstige organoids weergeven een basale laag (K14 positieve), geconfronteerd met de kelder membraan matrix gereconstitueerd ECM en een luminal laag (K8 positieve), geconfronteerd met de lumen-achtige Holten binnen het organoid (figuur 1F). Deze architectuur is niet te onderscheiden van die van organoids gevormd door inheemse MaSCs (figuur 1F).
Generatie van yDucts
Een overzicht van de experimentele strategie om te herprogrammeren primaire alvleesklier acini door voorbijgaande expressie van YAP wordt gepresenteerd in figuur 2A. Hele acinaire clusters zijn geïsoleerd van het merendeel van de alvleesklier weefsel door een combinatie van milde dissociatie en grootte uitsluiting door middel van filtratie. Een typische preparaat wordt gepresenteerd in figuur 2B. Na isolatie, de clusters acinaire cel moeten worden weergegeven als een schorsing van exocrine acinaire eenheden van homogene grootte, met geen besmetting door endocriene eilandjes van Langerhans of fragmenten van de alvleesklier ductaal boom en minimale dissociatie aan afzonderlijke cellen. Besmetting door endocriene eilandjes of ductaal fragmenten is een indicatie van gebrekkig selectief filtratie (stap 2.1.10), mogelijk te wijten aan ruwe behandeling; ongewenste dissociatie van acinaire clusters aan afzonderlijke cellen mogelijk als gevolg van buitensporige collagenase behandeling of niet-gebufferde activiteit van Proteolytische enzymen uitgebracht door het weefsel, die kan worden afgeremd door extra SBTI behandeling.
Een typische acinaire herprogrammering experiment wordt gepresenteerd in figuur 2C; binnen 5-7 dagen van de cultuur in 3D collageen-I gebaseerd hydrogel in aanwezigheid van doxycycline, alvleesklier acini afgeleid van R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A muizen gemakkelijk omzetten in buis-achtige clusters (dat we met de naam yDucts), gecomponeerd door een dunne enkelgelaagde van epitheliale cellen die zich rond een groeiende centrale holte verspreiden. De herprogrammering efficiëntie, die ongeveer 70% voor een typisch experiment is, kan gemakkelijk worden gemeten door het aantal buis-achtige clusters scoren over het totale aantal geplaatste acini (figuur 2D). De negatieve controle cellen, oftewel R26-rtTAM2 / + cellen of R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A cellen links zonder doxycycline, onveranderlijk blijven als post mitotische acinaire clusters in deze kweekomstandigheden, zoals eerder gemeld1 ,14,15. Geherprogrammeerde yDucts kan vervolgens worden gepasseerd op het niveau van één cel in voorwaarden16 van de cultuur van de Matrigel gebaseerde organoid (zie schema in figuur 2A), opmerkelijke zelf-vernieuwing vermogen zelfs in afwezigheid van doxycycline (d.w.z. weergeven in afwezigheid van transgene YAP expressie) (figuur 2E).
Figuur 1: Isolatie van primaire borstklier LD cellen en inductie van borstklieren stamcellen. (A) schematische weergave van de experimentele procedure aangenomen om te herprogrammeren primaire borstklier LD cellen. (B) vertegenwoordiger FACS-verhuur van staanpaaltsen ter illustratie van een typische sorteren procedure LD cellen te zuiveren. i) gedissocieerde cellen zijn gated volgens voorwaartse en zijdelingse scatter voor levende cellen (P1, blauw); II) bevolking P1 is dan meer gated volgens haar Lin-profiel: de subpopulatie Lineage-negatieve cellen (P2; grijs) is geselecteerd, met uitzondering van geslacht-positieve hematopoietische cellen; III) bevolking P2 is wordt onderverdeeld in een EpCAMhoog (P3; geel + groen) en een EpCAMlaag (P6; rood) subpopulaties; IV) P3 en P6 zijn vervolgens meer gated volgens hun CD61/CD49f-profiel in drie subpopulaties: EpCAMlageCD49fhogeCD61- basale cellen (P7; rood), EpCAMhogeCD49flageCD61+ LP cellen (P8; geel) en EpCAMhogeCD49flageCD61- LD cellen (P9; groen). (C) afbeeldingen zijn illustratief voor de mogelijkheid van LD cellen, besmet met de aangegeven constructies, vormen borstklier kolonies 15 dagen na het zaaien in de borstklier kolonie medium. YAP-uiten cellen linksaf naar de kolonie-vormende cellen, overwegende dat negatieve controle cellen (EGFP-geïnfecteerde) blijven slechts als afzonderlijke cellen groei-gearresteerd. Schaal bar = 50 μm. (D) kwantificering van de kolonievormende vermogen van de aangegeven cellen, zoals in (C). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + s.d. en zijn vertegenwoordiger van vijf onafhankelijke experimenten, elk met zes technische replicatieonderzoeken. (E) representatieve afbeelding van YAP-geherprogrammeerd borstklier stamcel-achtige cellen (yMaSCs) na 12 dagen in organoid kweekomstandigheden in verse driedimensionale 100% kelder membraan matrix hydrogel in de afwezigheid van Doxycycline. Schaal bar = 100 μm. (F) beelden van het representatieve immunofluorescentietest voor de basale markering K14 (groen) en de luminal markering K8 (rood) van organoids ontleend aan de aangegeven cellen, na 12 dagen in organoid cultuuromstandigheden. Schaal bar = 10 μm. Dit cijfer is gereproduceerd van Panciera et al., 20161. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Isolatie van primaire alvleesklier acinaire cellen en alvleesklier progenitoren-inductie. (A) schematische weergave van de experimentele procedure aangenomen om te herprogrammeren primaire alvleesklier exocrine acinaire cellen. (B) representatieve afbeelding van primaire alvleesklier acini net na de isolatie procedure (stap 2.1.14). De acinaire voorbereiding moet worden weergegeven als een homogene suspensie van acinaire clusters, met minimale aanwezigheid van afzonderlijke cellen. Schaal bar = 400 μm. (C) representatieve beelden van primaire alvleesklier acini afgeleid van R26-rtTAM2 (bovenste panelen)of R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (lagere panelen) muizen en gekweekt in 3D-collageen ik-op basis van hydrogel voor 5 dagen met of zonder Doxycycline (doxy), zoals aangegeven. Alleen converteren primaire acini YAP-uiten naar cellen groeien als de cyste-achtige organoid na toevoeging van Doxycycline. Schaal bars = 70 μm. (D) kwantificering van het vermogen van de alvleesklier acini vormen ductaal organoids op transgene YAP overexpressie zoals in (C). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + s.d. en representatief zijn voor vijf onafhankelijke experimenten, uitgevoerd met vier technische replicatieonderzoeken. (E) representatieve afbeelding van YAP-reprogramed ductaal-achtige cellen (yDucts) na drie passages in verse driedimensionale 100% kelder membraan matrix hydrogel bij gebrek aan Doxycycline. Schaal bar = 130 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Isolatie van primaire borstklier cellen | |
| CA2 + chelaat oplossing | Bewaren bij 4 ° C |
| EDTA | 0,02% w/V |
| PBS | |
| Collageen ik coating oplossing | |
| Azijnzuur, 0.02N, pH 3,23 | |
| Rat staart collageen (coating) | 1:50 |
| Dispase oplossing | Bewaren bij 4 ° C |
| Dispase | 5 mg/ml |
| PBS | |
| Dissociatie Medium | |
| DMEM:F12 | |
| Hyaluronidase-stockoplossing | 400 U/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Stockoplossing collagenase ik | 600 U/mL |
| Hemolytische oplossing | Bewaren bij 4 ° C |
| NH4Cl oplossing | 1 onderdelen |
| TrisBase 20.6 g/L | 9 onderdelen |
| Breng pH op 7,2 | |
| HBSS/PS | Bewaren bij 4 ° C |
| HBSS | |
| Pen/Strep | 2 x |
| Hyaluronidase-stockoplossing | Filteren van 0,2 µm, bewaren bij 4 ° C |
| Hyaluronidase van boviene teelballen (poeder) | 2.000 U/mL |
| Natriumfosfaat Buffer 1 M pH7.3 | |
| NH4Cl oplossing | Bewaren bij T. amb. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7.1 g/L |
| Breng pH op 7,65 | |
| Sorteren van de oplossing | Filteren van 0,2 µm, bewaren bij 4 ° C |
| BSA | 0,1% |
| EDTA | 1 mM |
| HEPES pH 7 | 25 mM |
| PBS | |
| Wassen van Medium #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Wassen van Medium #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| Pen/Strep | 1 x |
| Borstklier 2D kweekmedium | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| heparine | 4 mg/mL |
| L-Glutamine | 1 x |
| lymfkliertest bFGF | 10 ng/mL |
| lymfkliertest EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Inductie en Passaging van yMaSCs | |
| Borstklier kolonie Medium | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| heparine | 4 µg/mL |
| L-Glutamine | 1 x |
| Matrigel (Voeg onmiddellijk vóór het zaaien) | 5% |
| lymfkliertest bFGF | 20 ng/mL |
| lymfkliertest EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Borstklier Organoid Medium | |
| Geavanceerde DMEM:F12 | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| heparine | 4 µg/mL |
| HEPES | 1 x |
| menselijke Noggin | 100 ng/mL |
| lymfkliertest bEGF | 20 ng/mL |
| lymfkliertest EGF | 50 ng/mL |
| R-Spondin 1 | 1 µg/mL |
Tabel 1: generatie van yMaSCs. Samenstelling van alle verschillende kweekmedia en oplossingen nodig zijn voor de isolatie van primaire borstklier LD cellen en inductie van yMaSCs (deel 1)
| Isolatie van primaire alvleesklier acini | |
| Acinaire kweekmedium | |
| BPE | 50 µg Mo/mL |
| BSA | 0,1% |
| Dexamethason | 1 µg/mL |
| FBS | 0,1% |
| ITS-X | 1 x |
| Pen/Strep | 1 x |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Waymouth van Medium | |
| Acinaire Wash Medium | |
| BSA | 0,1% |
| Pen/Strep | 1 x |
| RPMI Medium | |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Acinaire herstel Medium | |
| Acinaire kweekmedium | |
| FBS | 30% |
| Collagenase ik oplossing A | |
| Acinaire Wash Medium | |
| Stockoplossing collagenase ik | 360 U/mL |
| PBS/PS | Bewaren bij 4 ° C |
| PBS (Phosphate buffered saline) | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Stockoplossing collagenase ik | Opslag bij-20 ° C |
| Collagenase, type ik (poeder) | 6.000 U/mL |
| PBS | |
| Passaging van de alvleesklier organoids | |
| Collagenase ik oplossing B | |
| PBS 1 x | |
| Stockoplossing collagenase ik | 240 U/mL |
| Alvleesklier Organoid Medium | |
| Geavanceerde DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| gastrine | 10 nM |
| menselijke FGF10 | 100 ng/mL |
| menselijke Noggin | 100 ng/mL |
| lymfkliertest EGF | 50 ng/ml |
| N-Acetylcysteïne | 1.25 mM |
| Nicotinamide | 10 mM |
| Pen/Strep | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 mg/mL |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
Tabel 2: generatie van yDucts. Samenstelling van alle verschillende kweekmedia en oplossingen nodig zijn voor de isolatie van primaire acinaire cellen en inductie en passaging van yDucts (deel 2)
Discussion
Hier presenteren we protocollen te herprogrammeren ex vivo terminaal gedifferentieerde epitheliale cellen van de verschillende weefsels in hun overeenkomstige weefsel-specifieke voorlopercellen (of ySCs) door voorbijgaande expressie van YAP, zoals gemeld eerder1. We beschikken over twee procedures gedetailleerde: een herprogrammering van de cellen FACS-gezuiverd door middel van lentivirale vectoren en een tweede men welk vermijdt virale infectie en maakt gebruik van transgene YAP expressie toe te staan. Elk protocol presenteert een efficiënte strategie te isoleren en cultuur primaire gedifferentieerde cellen en een strategie te dwingen exogene YAP genexpressie in gedifferentieerde cellen, het genereren van DOVO somatische weefsel-specifieke uitbreidbaar stamcellen (Zie regelingen in cijfers 1A en 2A).
We laten zien dat de isolatie strategieën hier gepresenteerd effectief een zuivere bevolking van gedifferentieerde cellen isoleren, zoals blijkt uit het feit dat we nooit een uitvloeisel van negatieve controlemonsters (cijfers 1 c en 2 C ontdekt).
De lentivirale vectoren in deze studie gebruikt voor de herprogrammering van de primaire borstklier LD cellen zijn doxycycline afleidbare, het aanbieden van de mogelijkheid van een strakke controle van de transgenic expressie; Hierdoor inschakelen en uitschakelen exogene YAP uitdrukking bij zal. Bijzondere aandacht moet worden geplaatst in het vermijden van het gebruik van een overmatige virale titer, als dit kan schadelijk zijn in termen van efficiëntie te herprogrammeren. In het geval van primaire acinaire cellen overstapten we op een volledig transgene aanpak te verkrijgen een YAP-afhankelijke herprogrammering met minimale manipulaties. Deze laatste strategie is ook bijzonder geschikt voor primaire alvleesklier acini, zoals geïsoleerde acinaire clusters nauwelijks vatbaar voor lentivirale infectie en erg kwetsbaar zijn. De transgene strategie in dienst biedt hetzelfde voordeel van doxycycline-afhankelijke lentivirale vectoren voor strakke controle op de genexpressie. Bovendien draagt de transgene strategie uitgebuit met primaire alvleesklier acini het extra voordeel van een veel hogere herprogrammering efficiëntie ten opzichte van de virale-geïnduceerde herprogrammering van de borstklier LD cellen. Buiten de verschillende intrinsieke plasticiteit gekoppeld aan cellen uit verschillende weefsels verkregen materialen, zou kunnen het hogere tarief van de alvleesklier herprogrammering worden afgeleid uit de hogere efficiëntie van expressie die is gekoppeld aan uniforme en autonome YAP uitdrukkingswijze, in alle transplanteren cellen. Met name hebben wij aangetoond dat exogene YAP niet langer nodig na generatie van ySCs (yMaSC kolonies en yDucts), is zonder de capaciteit van hun zelf-vernieuwing. Dit komt omdat ySCs endogene YAP/TAZ activeren en hen voor zelf-vernieuwing gebruiken als exogene YAP1is uitgeschakeld.
We het idee dat ySCs inderdaad ontstaan van gedifferentieerde cellen door het beheersen van de cel van de oorsprong van onze herprogrammering experimenten door genetische afkomst-tracing validaties1gevalideerd.
Karakterisering van het uitgebreidevan de ySCs toont dat YAP-geïnduceerde herprogrammering normale somatische SCs1 als ik genereert) op het niveau van de transcriptomic, ySCs weer massale overlappingen met inheemse SCs; II) ySCs differentiatie potentiële weergeven en kan leiden tot een multilineage nageslacht altijd beperkt tot de identiteit van hun weefsel van oorsprong; III) ySCs zijn niet-getransformeerd en niet-tumorigene wanneer getransplanteerd in vivo.
Hier beschrijven we ook procedures om te behouden en uit te breiden in cultuur zowel yMaSCs als yDucts als organoids ingebed in 100% kelder membraan matrix hydrogels. Deze voorwaarden voorzien in de zelforganisatie van ySCs in driedimensionale organoids die zorgen voor het behoud van de eigenschappen van de stemness op lange termijn in cultuur, inschakelen om uit te breiden deze stammen risicopopulaties zal voor downstream analyses en toepassingen. Om onbekende redenen, wij verzuimd te verkrijgen yMaSC organoids door het plaatsen van besmet LD cellen rechtstreeks in organoid kweekomstandigheden 7 dagen na behandeling met doxycycline in kunststof weefselkweek plaat; met andere woorden, is de groei van de tussenliggende stap in borstklier kolonie voorwaarden essentieel. In onze handen vereisen zelfs inheemse MaSCs borstklier kolonie voorwaarden voor passaging in organoid cultuur. Bovendien, de meest efficiënte uitvloeisel van de organoid wordt verkregen wanneer we vermijden distantiëren van de primaire kolonies in afzonderlijke cellen, maar eerder Breng de intact kolonies in organoid cultuuromstandigheden.
Organoid kweekomstandigheden dragen ook het voordeel dat de mogelijkheid om te cryopreserve ySCs, mits de organoids hun matrices, vermijden van cel dissociatie vóór cryopreservatie in stikstof bad worden verhaald.
De procedure ingediend te herprogrammeren YAP kunt converteren verschillende gedifferentieerde celtypes uit verschillende volwassen weefsels verkregen met hun bijbehorende weefsel-specifieke stamcellen (we hebben getest met behulp van de borstklier, alvleesklier en neuronale cellen)1. Bij verschil van iPSCs of andere herprogrammering inspanningen, kunnen YAP/veroorzaakte SCs handhaven de herinneringen van hun weefsel van oorsprong. Van de nota, ambtshalve differentiatie van somatische cellen in cellen begiftigd met stam-achtige eigenschappen is de enige vorm van cel lot plasticiteit en herprogrammering waargenomen in vivo, bijvoorbeeld na weefselbeschadiging en ter ondersteuning van de wond genezing van5,17 , 18 , 19 , 20. het is opmerkelijk dat YAP en TAZ grotendeels overbodig voor normale homeostase zijn maar cruciaal belang voor weefselherstel in meerdere weefsels11,21. Consistent met een fysiologische functie van de herprogrammering stappen die hier worden beschreven, is YAP/TAZ onlangs gebleken intestinale regeneratie in muismodellen van colitis ulcerosa patiënten door het veroorzaken van een conversie van volwassen intestinale cellen in vereist zijn een herstellende epitheel waarin functies van de foetale gut19. YAP herprogrammering dus breidt de huidige geïnduceerde cel plasticiteit strategieën door middel van een middel voor het genereren van somatische stamcellen, een staat die tot nu toe heeft zijn uitdagend te vangen in vitro. Deze aanpak, misschien als uitgebreid tot mens-afgeleide cellen, hebben brede relevantie van toepassingen van de regeneratieve geneeskunde aan de studie van de somatische stemness staat en stammen voor uitbreiding van somatische cellen in vitro.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken F. Camargo voor de gave van tetO-YAPS127A muizen; R26-rtTAM2 muizen (voorraad #006965) werden aangekocht van het Jackson Laboratory. Wij danken Chiara Frasson en Giuseppe Basso voor hulp bij FACS procedures. Dit werk wordt ondersteund door AIRC speciale programma moleculaire klinische oncologie '' 5 promille '' en een AIRC PI-subsidie S.P en door epigenetica vlaggeschipproject CNR-Miur verleent aan S.P. Dit project heeft ontvangen financiering van de Europese Onderzoeksraad (EOR) van de Europese Unie Horizon 2020 voor onderzoek en innovatieprogramma (subsidieovereenkomst DENOVOSTEM nr. 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
