Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Testmetoder för oorganiska polyfosfat i bakterier

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

Vi beskriver en enkel metod för snabb kvantifiering av oorganiska polyfosfat i olika bakterier, inklusive gramnegativa, grampositiva och mykobakteriella arter.

Abstract

Oorganiska polyfosfat (polyP) är en biologisk polymer som finns i celler från alla domäner i livet, och krävs för virulens och stressreaktion hos många bakterier. Det finns en mängd metoder för att kvantifiera polyP i biologiska material, av vilka många är antingen arbetsintensiva eller okänsliga, begränsar deras användbarhet. Vi presenterar här en strömlinjeformad metod för polyP kvantifiering i bakterier, använder en kvarts membran kolumn utvinning optimerad för snabb behandling av flera prover, rötning av polyP med den polyP-specifika exopolyphosphatase ScPPX, och upptäckt av den resulterande gratis fosfat med en känslig ascorbic syra-baserade kolorimetriska analys. Proceduren är enkel, billig och ger tillförlitlig polyP kvantifiering i olika bakteriearter. Vi presenterar representativa polyP kvantifiering från gramnegativa bakterien (Escherichia coli), den grampositiva mjölksyrabakterier (Lactobacillus reuteri) och mykobakteriella arten (Mycobacterium smegmatis). Vi har även ett enkelt protokoll för nickel affinitet rening av mg mängder av ScPPX, som för närvarande inte är kommersiellt tillgängliga.

Introduction

Oorganiska polyfosfat (polyP) är en linjär biopolymer av phosphoanhydride-länkade fosfat enheter som finns i alla domäner i livet1,2,3. I olika bakterier är polyP avgörande för stressreaktion, motilitet, biofilm bildning, cellcykeln kontroll, antibiotikaresistens och virulens4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studier av polyP metabolism i bakterier har därför potential att ge grundläggande insikter i förmågan hos bakterier kan orsaka sjukdom och trivs i olika miljöer. I många fall är metoderna för kvantifiera polyP i bakterieceller dock en begränsande faktor i dessa studier.

I området i närheten finns det flera metoder som används för att mäta polyP i biologiskt material. Dessa metoder omfattar vanligtvis två distinkta steg: extrahera polyP och kvantifiera polyP närvarande i dessa extrakt. Den nuvarande guldmyntfoten metod, utvecklat för jästen Saccharomyces cerevisiae av Bru och kollegor12, extrakt polyP tillsammans med DNA och RNA med hjälp av fenol och kloroform, följt av etanol nederbörd, behandling med deoxyribonuclease (DNase) och ribonunkleas (RNase) och nedbrytning av den resulterande rena polyP med S. cerevisiae polyP-nedbrytande enzymet exopolyphosphatase (ScPPX)13 att ge gratis fosfat, som då kvantifieras med hjälp av en malakit green-baserade kolorimetriska analys. Detta förfarande är mycket kvantitativa men arbetsintensiva, begränsa antalet prover som kan bearbetas i en enda experiment, och är inte optimerad för bakteriell prover. Andra har rapporterat utvinna polyP från en mängd olika celler och vävnader med hjälp av kiseldioxid pärlor (”glassmilk”) eller kiseldioxid membran kolumner6,14,15,16,17, 18. Dessa metoder inte effektivt extrahera kort kedja polyP (mindre än 60 fosfat enheter)12,14,15, även om detta är av mindre intresse för bakterier, som allmänt anses syntetisera primärt långkedjiga polyP3. Äldre metoder av polyP extraktion med starka syror19,20 används inte längre, eftersom polyP är instabil under sura förhållanden12.

Det finns också en mängd rapporterade metoder för att kvantifiera polyP. Bland de vanligaste är 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), ett fluorescerande färgämne mer vanligtvis används för att färga DNA. DAPI-polyP komplex har olika fluorescens excitation och utsläpp maxima än DAPI-DNA komplex21,22, men det finns avsevärda störningar från andra cellulära komponenter, inklusive RNA, nukleotider och inositol fosfater12,15,16,23, minska specificitet och känslighet av polyP mätningar som görs med denna metod. Alternativt, polyP och adenosindifosfat (ADP) kan omvandlas till adenosintrifosfat (ATP) med hjälp av renat Escherichia coli polyP kinase (PPK) och den resulterande ATP kvantifieras med hjälp av luciferas14,17 ,18. Detta tillåter att upptäcka mycket små mängder av polyP, men kräver två enzymatisk reaktion steg och både luciferin och mycket ren ADP, som är dyra reagenser. ScPPX specifikt smälter polyP in gratis fosfat6,12,13,24, som kan upptäckas med hjälp av enklare metoder, men ScPPX hämmas av DNA och RNA12, vilket kräver DNAS och RNase behandling av polyP-innehållande extrakt. Varken PPK eller ScPPX är kommersiellt tillgängliga, och PPK rening är relativt komplex25,26.

PolyP i cell lysates eller extrakt kan också visualiseras på polyakrylamidgeler av DAPI negativ färgning27,28,29,30, en metod som tillåter bedömning av Kedjanslängd, men är låg genomströmning och dåligt kvantitativa.

Vi rapporterar nu en snabb, billig, medium-genomströmning polyP analysmetod som tillåter snabb kvantifiering av polyP nivåer i olika bakteriearter. Denna metod börjar av lyseringslösning bakterieceller vid 95 ° C i 4 M guanidin fluoresceinisothiocyanat (GITC)14 om du vill inaktivera cellulära fosfataser, följt av en kvarts membran kolumn utvinning optimerad för snabb behandling av flera prover. Det resulterande polyP-innehållande extraktet är sedan smälta med ett stort överskott av ScPPX, vilket eliminerar behovet av DNAS och RNase behandling. Vi inkluderar ett protokoll för okomplicerad nickel affinitet rening av mg mängder ScPPX. Slutligen är polyP-derived gratis fosfat kvantifieras med en enkel, känslig, askorbinsyra-baserade kolorimetriska analys24 och normaliserade till cellulära totalprotein. Denna metod effektiviserar mätning av polyP i bakterieceller, och vi visar dess användning med företrädare arter i gramnegativa bakterier, grampositiva bakterier och mykobakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. renande jäst Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Omvandla E. coli protein överuttryck stammen BL21(DE3)31 med plasmiden pScPPX26 av elektroporation32 eller kemisk omvandling33.
  2. Inokulera 1 L lysogeny buljong (LB) innehållande 100 µg mL-1 ampicillin i en 2 L unbaffled kolv med en enda koloni av BL21(DE3) som innehåller pScPPX2 och inkubera över natten vid 37 ° C utan skakningar, till en absorbans vid 600 nm (en600) cirka 0,3, mätt i en spektrofotometer.
  3. Starta den kulturen som skakar (180 rpm) och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C, under vilken tid cellerna växer till en A600 av 0,4 - 0,5.
  4. Lägg till isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till en slutkoncentration av 1 mM och en ytterligare 100 µg mL-1 ampicillin och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C med skakningar vid 180 rpm.
    Obs: Detta överuttryck protokoll genererar en stor mängd löslig ScPPX. Dock ScPPX överuttryck är väldigt förlåtande, och en mängd andra gemensamma protein överuttryck protokoll har använts att framgångsrikt rena ScPPX.
  5. Överföra cellerna till en 1 L centrifug flaska och skörda dem genom centrifugering för 20 min på 5000 x g vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och överföra cellpelleten till en 50 mL konisk tub.
    Obs: Cell pellets kan lagras på obestämd tid med vid-80 ° C.
  6. Tina pelleten på is och sedan blandas det i 9 mL 50 mm HEPES, 0,5 M NaCl och 5 mM Imidazol (pH 8) för en total volym på ca 10 mL.
  7. Lägga till (slutliga koncentrationer) 1 mg mL-1 lysozym, 2 mM MgCl2och 50 enheter mL-1 för en RNA - och DNA-förnedrande Amiiiiin (se Tabell av material) och inkubera i 30 min på is.
    Obs: ScPPX binder nukleinsyror (inga data anges), så nukleotid är viktigt under reningen.
  8. Med en någon sonikator med en microtip (se Tabell för material), lyse celler av 2 cykler av ultraljudsbehandling på is på 50% effekt, pulserande 5 s på och 5 s off, med 2 min vila mellan cykler.
    Obs: Använd lämpligt hörselskydd under ultraljudsbehandling. Likaså att fallet med överuttryck, en mängd cell lysis metoder är godtagbara för ScPPX rening.
  9. Ta bort olösligt skräp genom centrifugering den lysate i 20 min vid 20 000 x g vid 4 ° C. Filtrera den resulterande supernatanten (cirka 10 mL) genom ett 0,8 µm porstorlek storlek cellulosaacetat spruta filter.
  10. Ladda den lysate på en nickel-debiteras 5 mL kelaterande kolumn (se Tabell för material) med antingen en Peristaltisk pump eller en stor spruta.
  11. Skölj kolonnen med 50 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 5 mM Imidazol (pH 8).
  12. Skölj kolonnen med 50 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol (pH 8).
  13. Eluera ScPPX med 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl och 0,5 M Imidazol (pH 8), Samlande 15 1 mL fraktioner. Testa dessa eluering fraktioner för protein innehåll med de Bradford protein assay34 (se Tabell av material) och kör en SDS-PAGE gel35 för att bekräfta vilka fraktioner innehåller renade ScPPX (molekylvikt = 45 kDa).
  14. Pool fraktioner som innehåller ren ScPPX och justera koncentrationen av poolade proteinet till ca 2 mg mL-1 med 50 mM HEPES och 0,5 M NaCl. Högre protein koncentrationer kan utlösa i nästa steg.
  15. Utbyta den renade ScPPX in lagring buffert (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glycerol) genom dialys. Placera poolade ScPPX fraktioner i en förseglad längd av 12 000-14 000 Da molekylvikt cutoff dialys membran slangar (se Tabell av material) och suspendera i 1 L förvaring buffert med kontinuerlig omrörning vid 4 ° C för minst 4 h. Upprepa detta med färska lagring buffert för sammanlagt 3 buffert förändringar.
  16. Överföra det rena, dialyseras proteinet till ett centrifugrör eller rör och Centrifugera i 20 min vid 20 000 x g vid 4 ° C för att ta några olösliga aggregat. Försiktigt överför supernatanten till en ren 15 mL koniska rör.
  17. Justera koncentrationen av den renade ScPPX till 1 mg mL-1 med lagring buffert, Lägg 0,1% (w/v) proteas-fri bovint serumalbumin (BSA; slutlig koncentration) och store för upp till 6 månader vid 4 ° C.
    Obs: ScPPX förlorar mer än 90% av dess aktivitet när det är fryst13.

2. skörd prover för polyfosfat utvinning

  1. Odla bakterier på villkor av intresse för bestämning av polyP innehållet. För detta protokoll, växa Lactobacillus reuteri36 över natten vid 37 ° C utan att skaka i äppelsyra enzym induktion (MEI) medium37 utan cystein (MEI-C).
  2. Skörda tillräckligt med celler genom centrifugering i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör till totalt 50 – 100 µg av cellulära protein (se steg 3 nedan). För E. coli, är 1 mL av en logg fas kultur på en A600 av 0,2 - 0,4. För L. reuteriär 1 mL av en övernattning kultur. Justera vid behov för andra arter av intresse.
  3. Helt ta bort supernatanten från cell pellets.
  4. Återsuspendera cell pellets i 250 µL GITC lyseringsbuffert (4 M guanidin isotiocyanat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) och lysera genom inkubation vid 95 ° C i 10 min. Store lysates vid-80 ° C.
    Obs: Överensstämma med Lys tid, eftersom utökade inkubation vid hög temperatur kan leda till nedbrytning av polyP genom hydrolys38. Lysates kan lagras på obestämd tid vid-80 ° C.
    FÖRSIKTIGHET: Guanidin isotiocyanat är ett chaotropic salt och bör hanteras med handskar och omhändertas som farligt avfall.

3. mätning av proteinhalten i Cell Lysates

  1. Förbereda BSA standarder som innehåller 0, 0,1, 0,2 och 0,4 mg mL-1 för BSA i GITC lyseringsbuffert.
    Obs: Det är viktigt att göra standarderna som BSA i GITC, eftersom GITC påverkar färgutvecklingen Bradford analysens. BSA standarder kan lagras på obestämd tid vid-20 ° C.
  2. Alikvotens 5 µL av tinade, väl blandad cell lysates och BSA standarder till separata brunnar i plattan en tydlig 96 brunnar.
  3. Tillsätt 195 µL Bradford reagens34 i varje brunn och Mät absorbansen vid 595 nm (en595) i en tallrik läsare (se Tabell för material).
  4. Beräkna mängden protein i varje brunn genom jämförelsen till BSA standardkurvan, använda formeln y = mx + b, där y är en595x är µg av BSA, m är lutningen på standardkurvan och b är y-skärningspunkten av standardkurvan. Multiplicera det resulterande värdet med 0,05 att bestämma den totala mg protein i varje prov.

4. extrahera polyfosfat

  1. Tillsätt 250 µL av 95% etanol till varje GITC-lyserat prov och vortex att blanda.
  2. Applicera blandningen en kiseldioxid membran spin kolumn och Centrifugera i 30 s vid 16,100 x g.
  3. Kassera genomströmmande och sedan lägga till 750 µL av 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% etanol och Centrifugera i 30 s vid 16,100 x g.
  4. Kassera genomflöde och Centrifugera under 2 minuter vid 16,100 x g.
  5. Placera kolumnen i en ren 1,5 mL mikrofugrör och tillsätt 150 µL av 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Odla i rumstemperatur i 5 min, sedan eluera polyP genom centrifugering för 2 min vid 8000 x g.
    Obs: Om så önskas, eluat kan lagras vid-20 ° C i minst 1 vecka.

5. smälta polyfosfat

  1. Förbereda standarder som innehåller 0, 5, 50 eller 200 µM kaliumfosfat i 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Obs: Kalium fosfat standarder kan lagras på obestämd tid i rumstemperatur.
  2. Alikvotens 100 µL av varje standard fosfat och extraherade polyP prover i separata brunnar i en tydlig 96 brunnar-plattan.
  3. Förbereda en master mix som innehåller (per prov): 30 µL 5 x ScPPX reaktion buffert (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM ammoniumacetat, pH 7.5)13och 19 µL av H2O 1 µL av renat ScPPX (1 mg mL-1).
  4. Tillsätt 50 µL av huvudmixen till varje brunn plattan med 96 brunnar. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
    Obs: Om så önskas, smält polyP proverna kan förvaras vid-20 ° C på obestämd tid.

6. att upptäcka gratis fosfat24

  1. Förbereda upptäckt lösning bas genom upplösning 0.185 g av antimon kaliumtartrat i 200 mL vatten, att lägga 150 mL 4 N H2så4, sedan lägga 1.49 g av ammonium heptamolybdate. Rör för att upplösa och sedan föra till en slutlig volym av 456 mL. Filtrera lösningen för att ta bort partiklar och förvara skyddat från ljus vid 4 ° C i upp till 1 månad.
  2. Förbereda en stamlösning 1 M askorbinsyra. Förvaras skyddat från ljus vid 4 ° C i upp till 1 månad.
  3. Förbered en färsk fungerande lager upptäckt lösning varje dag genom att blanda 9,12 mL upptäckt lösning bas med 0,88 mL 1 M askorbinsyra. Låt den Upptäck lösningen att komma till rumstemperatur före användning.
  4. Tillsätt 50 µL upptäckt lösning i varje prov och standard i plattan med 96 brunnar och odla i rumstemperatur i ca 2 min att tillåta färgutveckling.
  5. Mät absorbansen vid 882 nm med en spektrofotometer och beräkna fosfat koncentrationen av varje prov som jämförelse till kalium fosfat standardkurvan.
    FÖRSIKTIGHET: Upptäckt lösningen innehåller giftiga salter och starka syror. Använd handskar och behandla överflödig lösning som giftigt avfall.

7. beräkning av cellulära polyfosfat innehåll

  1. Konvertera fosfat koncentrationerna bestäms i steg 6,5 nanomol polyP-derived fosfatnivån i varje hela cell lysate enligt följande formel:
    nmol polyP = 1,5 x (µM fosfat / 10)
    Obs: Standard kurva-baserade metoden i steg 6 bestämmer koncentrationen av fosfat (i µM) i varje 100 µL polyP prov aliquoted i steg 5.2. För att konvertera denna koncentration till ett antal nmol, 100 µL divideras med 106 ge en volym i L, multiplicerat med koncentrationen (µmol L-1) och sedan multiplicerat med 1 000 (antalet nmol i en µmol). Detta minskar till koncentrationen divideras med 10. Den totala extrakt volymen bereddes i steg 4 är 150 µL, så det är nödvändigt att multiplicera det resulterande värdet med 1,5 till beräkna nmol av fosfat i hela extraktet.
  2. Normalisera cellulära polyP innehåll till totala cellular protein genom att dividera nmol polyP med den mg totalprotein i varje prov som anges i steg 3,4. PolyP nivåer uttrycks i koncentrationen av enskilda polyP-derived gratis fosfat.
    Obs: I vissa fall mängden polyP-derived fosfat i ett prov kan falla utanför det linjära området av fosfat standardkurvan (steg 6,5). Om nivåerna av polyP är mycket höga, överskott polyP-innehållande eluatet från steg 4,6 kan vara utspätt 1:10 eller 1: 100, som behövs, och sedan mäts igen enligt beskrivningen i steg 5 till 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De viktigaste stegen i protokollet är kartlagt i förenklad form i figur 1.

För att demonstrera användningen av detta protokoll med gramnegativa bakterier, vildtyp E. coli MG165539 vuxit till mitten av log fas i LB rikt medium vid 37 ° C under skakning (200 rpm), sedan sköljas och inkuberas i en ytterligare 2 h i morpholinopropanesulfonate-buffrade (moppar) minimal medium40 som innehåller 4 g L-1 glukos och 0,1 mM K2HPO4, ett tillstånd som är kända för att inducera produktion av polyP14,29. Som visas i figur 2A, upptäckte vi inga polyP i vildtyp E. coli odlas i LB och 192 ± 14 (medelvärde ± standardavvikelse [SD]) nmol polyP mg-1 totalt protein i moppar, överensstämmer med tidigare rapporter14,29 . Som förväntat, en ∆ppk mutant6, som saknar polyP kinase41, produceras ingen polyP i antingen medium, produceras en ∆ppx mutant6, som saknar exopolyphosphatase42, ungefär samma mängd polyP som vild-typen, och en ∆phoB mutant29som är defekt i fosfat transport, producerade betydligt mindre polyP än vildtyp14,29,43.

För att demonstrera användningen av detta protokoll med grampositiva bakterier, vildtyp L. reuteri ATCC PTA 647536 och en syngena ppk1 null mutant sakna polyP kinase, konstruerade med oligo-riktade recombineering44, var odlas över natten i MEI-C vid 37 ° C utan att skaka. Som visas i figur 2B, det vildtyp ackumulerade 51 ± 6 nmol polyP mg-1 totalt proteinet under dessa förhållanden, medan ppk1 mutant innehöll mindre än hälften av detta belopp. L. reuteri innehåller en andra polyP kinase, kodas av den ppk2 gen45, som förmodligen står för polyP presentera i ppk1 null mutant.

För att demonstrera användningen av detta protokoll med mykobakterier, var Mycobacterium smegmatis stam SMR546 odlas till mitten av log fas i Hartmans-de Bont (HdB) medium47, sedan sköljas och utspädda fem gånger i HdB eller HdB med 2% etanol. Dessa kulturer var sedan inkuberas över natten vid 37 ° C under skakning (180 rpm). Som visas i figur 2 c, i avsaknad av etanol, ackumulerade M. smegmatis 141 ± 52 nmol polyP mg-1 totalt protein, medan etanol behandling resulterade i en trefaldig ökning till 437 ± 102 nmol polyP mg-1 totalt protein. Detta resultat var väntat, eftersom etanol har tidigare rapporterats att upphöja polyP nivåer i M. smegmatis48.

Figure 1
Figur 1: Diagram över polyfosfat utvinning och mätning förfarande. De grundläggande stegen i protokollet polyP kvantifiering illustreras. Bakteriecell pellets är lyserat vid 95 ° C i GITC (guanidin isothiocyanat). Små portioner av lysates är analyseras för proteinhalten med Bradford-analys. PolyP extraheras med hjälp av kiseldioxid membran kolumner och sedan smälta med ScPPX. Det resulterande gratis fosfatet kvantifieras med askorbinsyra analys. Totala polyP-derived fosfat är normaliserad till totalt protein för varje prov. En595 = absorbans vid 595 nm. En882 = absorbans vid 882 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa resultat med olika bakterier. (A), E. coli MG1655 vildtyp och syngena ∆ppk, ∆ppxoch ∆phoB mutanter odlades vid 37 ° C under skakning (200 rpm) till en600 = 0,2 - 0,4 i rika LB medium (svarta cirklar) och sedan flyttats till minimalmedium (moppar innehåller 4 g L-1 glukos och 0,1 mM K2HPO4) för 2 h (vita cirklar; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (cirklar) och en syngena ppk1 null mutant (trianglar) har vuxit över natten vid 37 ° C i MEI-C medium utan skakningar (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 var odlas vid 37 ° C under skakning (180 rpm) till en600 = 1 i HdB medium med (slutna fyrkanter) eller utan (öppna rutor) 2% etanol (n = 3, ± SD). PolyP nivåer uttrycks i koncentrationen av enskilda polyP-derived gratis fosfat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs här förenklar och påskyndar kvantifiering av polyP nivåer i olika bakterier, med en typisk uppsättning 24 prov tar ca 1,5 h fullt bearbeta. Detta möjliggör snabb screening av prover och analys av muterade bibliotek och förenklar kinetiska experiment mäter ansamling av polyP över tid. Vi har visat att protokollet fungerar effektivt på företrädarna för tre olika phyla: proteobacteria, firmicutes, och actinobacteria, som är ökända för sin motståndskraftig, svårt att lysera cellväggar49.

Detektion av polyP av matsmältning med ScPPX är mer specifika och mer känsliga än fluorescens upptäckten med DAPI, och är billigare och mer tekniskt okomplicerad än konvertering av polyP till ATP med hjälp av PPK. Även om ScPPX hämmas av DNA och RNA12, har vi övervinna detta med hjälp av ett mycket stort överskott av enzym (1 µg per prov) att uppnå fullständig uppslutning även i bakterier som innehåller mer än 6000 nmol polyP mg-1 protein29. Andra publicerade metoder användning 10 till 15 ng av ScPPX per reaktion12,24. Våra protokoll för ScPPX rening ger oftast mer än 5 mg av ren ScPPX per liter överuttryck kultur, vilket räcker för fler än 5 000 analyser. Vi har funnit att flera olika protokoll för nickel affinitet rening av hans-taggade proteiner fungerar väl för att rena ScPPX i ökad utsträckning från pScPPX2 (inga data anges), och det finns en mängd olika sådana protokoll som är tillgängliga för att passa labs med varierande tekniska kapacitet.

Tidigare protokoll använder ScPPX matsmältning för polyP upptäckt har ofta åberopade malakit green-baserade kolorimetriska analyser att kvantifiera gratis fosfat6,12. Dessa analyser är känsliga, men vanligtvis kräver noggrant tidsinställda sekventiell tillägg av två eller tre separata reagenser att göra noggranna mätningar24,50,51. Askorbinsyra-baserad detektionssystemet används här24 har en bredare linjära rad detektering än malakitgrönt utan förlust av känslighet, endast innebär tillägg av en enda reagens och inte kräver exakt timing.

I området i närheten finns det flera steg som är avgörande för framgång i detta protokoll. Första, bakteriell prover bör vara lyserat i GITC omedelbart efter skörd, att säkerställa att polyP nivåer inte ändrar efter tidpunkten för provtagning och för att snabbt inaktivera cellulära fosfataser. För det andra inte Inkubera GITC lysates vid 95 ° C i mer än 10 min, och lagra dem omedelbart efteråt vid-80 ° C att minimera möjliga polyP hydrolys. För det tredje, var försiktig när pipett prover till 96 brunnar att antingen protein eller fosfat mätningarna inte plaska eller droppa något från ett prov till en annan. De kolorimetriska analyserna, särskilt för fosfat, är mycket känsliga, och små mängder föroreningar starkt kan förvränga resultaten. Slutligen har vissa reagenser som används i detta protokoll (dvs. ScPPX, upptäckt lösning) begränsad hållbarhetstid liv. Förbereda färska ScPPX varje 6 månader och färsk upptäckt lösning varje månad.

En begränsning av vår metod är att kiseldioxid kolumner inte binder polyP mindre än 60 fosfat enheter länge mycket väl12,14,15. Även om bakterier syntetisera vanligen mestadels långkedjiga polyP3, rekommenderar vi preliminära experiment med polyakrylamid gelelektrofores27,30 att bedöma Kedjanslängd i en viss bakterieart innan du använder vårt förfarande. För arter där kortkedjade polyP utgör en betydande del av polyP poolen, våra protokoll är inte lämpliga och vi rekommenderar utvinna polyP av en annan metod (t.ex., fenol-kloroform utvinning12), och skulle också rekommendera komplettera ScPPX rötning med kommersiellt tillgängliga S. cereviseae har pyrophosphatase (PPA1)24, eftersom ScPPX inte smälta pyrofosfat13 och detta en proportionellt högre inverkan på mätningarna av kortare-kedjan polyP. Som ett alternativ till ScPPX, sur hydrolys38 kunde användas till att hydrolysera polyP gratis fosfat, men detta skulle kräva ytterligare DNase, RNase och rening åtgärder för att säkerställa att endast polyP-derived fosfat som mättes. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda alternativa extraktionsmetod för att testa om effektiviteten av polyP extraktion med GITC varierar mellan stammar eller villkor, särskilt med bakterier kända för att ha tjocka cellväggar, såsom mykobakterier. Om nivåerna av polyP nedanför detektionsgränsen för denna analys är viktigt för studier av en viss art, kan det vara nödvändigt att använda en annan identifiering schema som använder PPK för att konvertera polyP till ATP, vilket kan påvisas extremt känsligt med hjälp kommersiellt tillgängliga luciferas-baserade analyser14,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Projektet stöddes av University of Alabama i Birmingham Institutionen för mikrobiologi start medel och NIH grant R35GM124590 (att MJG) och NIH bidrag R01AI121364 (FW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

Immunologi och infektion fråga 143 polyfosfat stressreaktion exopolyphosphatase gramnegativa bakterier grampositiva bakterier mykobakterier
Testmetoder för oorganiska polyfosfat i bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter