Summary
Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.
Abstract
Elektroporation is een transfectie methode waarbij een elektrisch veld wordt toegepast op cellen om tijdelijke poriën in een celmembraan te creëren en de permeabiliteit ervan te vergroten, waardoor verschillende moleculen in de cel kunnen worden geïntroduceerd. In dit document wordt elektroporation gebruikt voor het introduceren van plasmiden aan ependymoglial cellen, die de ventriculaire zone van de volwassen zebravis telencephalon lijn. Een fractie van deze cellen toont stamcel eigenschappen en genereert nieuwe neuronen in de hersenen van de zebravis; Daarom is het bestuderen van hun gedrag essentieel om hun rol in neurogenese en regeneratie te bepalen. De introductie van plasmiden via electroporatie maakt lange termijn labeling en tracking van een enkele ependymoglial cel mogelijk. Bovendien kunnen plasmiden zoals CRE of of Cas9 worden geleverd aan enkelvoudige ependymoglial cellen, die genrecombinatie of genbewerking mogelijk maken en een unieke kans bieden om de autonome genfunctie van de cel te beoordelen in een gecontroleerde, natuurlijke Milieu. Ten slotte wordt dit gedetailleerde, stapsgewijze electroporatie protocol gebruikt om een succesvolle introductie van plasmiden tot een groot aantal enkelvoudige ependymoglial cellen te verkrijgen.
Introduction
Zebravis zijn uitstekende diermodellen om hersen regeneratie na een steekwond letsel te onderzoeken. In vergelijking met zoogdieren, op de evolutionaire ladder, minder geëvolueerde soorten zoals zebravis in het algemeen vertonen hogere tarieven van constitutieve neurogenese en bredere gebieden van volwassen neurale stamcellen residentie, wat leidt tot constante generatie van nieuwe neuronen in de hele de meeste hersengebieden in het volwassen leven. Deze functie lijkt te correleren met significant hogere regeneratieve capaciteit van zebravis in vergelijking met zoogdieren1, als zebravis hebben opmerkelijk potentieel om efficiënt te genereren nieuwe neuronen in de meeste hersenen letsel modellen bestudeerd2, 3,4,5,6,7,8. Hier wordt de zebravis telencephalon bestudeerd, omdat het een hersengebied is met prominente neurogenese in volwassenheid. Deze zones van volwassen neurogenese zijn homologe aan neurogene zones in de volwassen zoogdieren hersenen9,10,11.
Overvloedige neurogene gebieden in de zebravis telencephalon zijn aanwezig vanwege het bestaan van radiale glia zoals cellen of ependymoglia-cellen. Ependymoglial cellen fungeren als Resident volwassen neurale stamcellen en zijn verantwoordelijk voor het genereren van nieuwe neuronen in zowel de intact en regenereert hersenen3,5. Lineage tracing experimenten hebben aangetoond dat ventriculaire ependymoglia reageren op letsel, dan prolifereren en genereren van nieuwe neuroblasten die migreren naar de laesie site5. Door de gemuteerde aard van zebravis telencephalon lijnen de ependymogliale cellen het ventriculaire oppervlak en bouwen de ventrale ventriculaire wand. De dorsale ventriculaire wand wordt gevormd door een dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a). Belangrijker is dat zebravis ependymoglia de kenmerken van zowel de zoogdier radiaal glia als de Ependymale cellen belichaam. Lange radiale processen zijn een typisch kenmerk van radiale glia-cellen, terwijl cellulaire extensies en nauwe kruisingen (evenals hun ventriculaire posities) typische kenmerken zijn van Ependymale cellen12,13,14. Daarom worden deze cellen ependymoglial cellen genoemd.
Om in vivo gedrag van enkelvoudige ependymoglial cellen tijdens regeneratie te volgen, moeten ze op betrouwbare wijze worden gelabeld. Verschillende methoden van in vivo cellabeling voor fluorescerende microscopie zijn eerder beschreven, zoals endogene verslaggevers of lipofiele kleurstoffen15. Deze methoden, in tegenstelling tot elektroporation, kan vereisen langere tijd en vaak bieden niet de mogelijkheid van één cel labeling of permanente lange termijn tracering. Elektroporation, echter (naast het labelen van één cel), biedt de mogelijkheid om nieuw DNA in de host-cel te introduceren. Bovendien, in vergelijking met andere methoden van DNA-overdracht in de cellen, is elektroporation aangetoond dat het een van de meest efficiënte methoden16,17,18,19is.
Hier gepresenteerd is een electroporatie protocol dat is verfijnd met het oog op het labelen van enkele ependymoglial cellen in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol voorziet in de etikettering van enkelvoudige ependymoglial cellen om ze gedurende een lange periode van20 te kunnen volgen of om specifieke trajecten op autonome wijze te manipuleren21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren die in dit protocol worden gebruikt, zijn onder standaardomstandigheden gehouden en experimenten zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de EU en de regering van Opper-Beieren (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. bereiding van het plasmide mengsel voor Elektroporation
- Verdun de interesse van de plas smid in steriel water en voeg een snelle groene vlek voorraadoplossing [1 mg/mL] toe. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het plasmide ∼ 1 μg/μL is. Voeg de vlek toe met een concentratie van niet meer dan 3%, omdat het enige doel is om de oplossing te kleuren en de ventriculaire injectie te visualiseren.
- Meng de plasmide oplossing eenmaal voorbereid door meerdere malen op en neer te pipetteren of door met de vingers te tikken. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik.
Opmerking: Voor co-elektroporation van twee plasmiden in dezelfde cel, zorg ervoor dat de concentratie van elk afzonderlijk plasmide in het mengsel ten minste 0,8 ng/μL met een molaire verhouding van 1:1 om te verkrijgen van 80% – 90% co-elektroporation efficiëntie.
2. preparaten voor injectie en Elektroporation procedure
- Bereid de glazen capillairen (buitendiameter 1 mm, binnendiameter 0,58 mm) noodzakelijk voor de injectie in de naald trekinrichting.
- Om de juiste hoeveelheid plasmide te injecteren (zie hierboven), trek het capillair bij een temperatuur van 68,5 ° c met twee lichte en twee zware gewichten (Zie tabel van materialen voortrekker specificaties).
Opmerking: Als er een andere trekker wordt gebruikt, kalibreer dan het capillair om het juiste volume electroporatie mix te leveren. - Stel het injectie apparaat handmatig in op een injectiedruk van 200 hPa (door de Pi-knop te draaien) en constante druk van 0 hPa. Stel de injectie tijd handmatig in op handmatige modus en bedien de druk met voetpedaal.
- Stel het elektroporation apparaat in op "LV mode" met vijf pulsen bij 54 – 57 V (25 MS elk met 1 s intervallen). Sluit de elektroden aan op het apparaat.
- Bereid een aquarium met schoon viswater, waar de vis zal worden gewekt van anesthesie na de elektroporation procedure. Beluate het water door de lucht steen vast te houden aan de luchtpomp voor de volledige herstelperiode totdat de vis volledig is ontwaakt.
- Neem een reguliere keuken spons en maak een longitudinale snede in de spons om vis in te houden tijdens de injectie en elektroporation procedure (zie vorige publicatie3).
Opmerking: De keuken spons moet regelmatig worden gewassen of uitgewisseld om potentiële giftige chemicaliën te verwijderen. - Plaats een kleine hoeveelheid zeer geleidende multifunctionele echografie gel naast de injectie en elektroporation Setup.
Opmerking: Dit zorgt voor een adequate elektrische geleiding, en bijgevolg de distributie van elektroporated cellen in het gehele telencephalon.
3. zebravis anesthesie
- Voorafgaand aan de verdoving, bereid een stamoplossing van anesthesie met 0,2% MS222 in gedestilleerd water en pas de pH op 7 met tris-HCl-buffer. Verdun deze kolf 1:10 (d.w.z. tot 0,02% MS222) met behulp van viswater.
- Anesthetiseer de vis door ze in deze werkoplossing te houden totdat de beweging van het lichaam en de kieuwen verdwijnt (meestal voor een paar minuten).
4. injectie met plasmide oplossing
- Vul het voorbereide Glazen capillair met 10 μL plasmide oplossing met behulp van micro lader tips. Vermijd de vorming van luchtbellen in het capillair.
- Druk op menu/verander capillair op het injectie apparaat. Steek de naald in de naald houder en bevestig deze.
- Knip onder een stereomicroscoop met een vergroting van 3,2 x of 4x slechts de punt van het capillair met behulp van de fijne Tang. Schakel het injectie apparaat van de capillaire modus wijzigen in de Injecteer -modus, druk vervolgens op met een voetpedaal om ervoor te zorgen dat de plasmide oplossing gemakkelijk uit de naald en zonder belemmering loopt.
- Breng de vis van de veehouderij tank naar de container (plastic doos) met verdovings oplossing. Wacht een paar minuten totdat de beweging van de kieuwen afneemt.
- Plaats de vis in de voorbevoafde spons met de rugzijde naar boven gericht. Voer alle volgende injectie stappen uit onder de stereomicroscoop om de nauwkeurigheid van de procedure te garanderen.
- Met behulp van een ontleed micro-mes van roestvrijstaal met 40 mm snijkant en 0,5 mm dikte, maak een klein gaatje in de schedel van de vis aan de achterste kant van de telencephalon (Figuur 1b), net naast de grens met optiek Tectum.
Opmerking: Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd, omdat het gat moet zeer klein en oppervlakkig, penetreren alleen de schedel, om te voorkomen dat hersenbeschadiging. - Kantel de vis zo nodig en richt de punt van het Glazen capillair in de juiste hoek naar de schedel om de penetratie van de capillaire punt door het gat te vergemakkelijken.
- Steek de punt van het capillair voorzichtig door het gat in de schedel totdat het de telencephalic ventrikel bereikt (Zie Figuur 1b). Dit vereist penetratie via de dorsale Ependymale cellaag. Wees vooral voorzichtig om het capillair niet te diep in te steken om contact met het hersenweefsel te vermijden. Houd de capillaire precies tussen de hemisferen, blijven in de ventrikel net na het doorprikken van de dorsale Ependymale laag.
Opmerking: Dit is een zeer delicate stap. Nauwkeurigheid van deze procedure is verbeterd met behulp van pigmentatie Mutant lijnen zoals Brassy24, waardoor een betere visualisatie van de glazen capillaire positie tijdens de injectie. - Injecteer met de capillaire punt binnenkant van de ventrikel de plasmide oplossing door de druk met het voetpedaal ongeveer 10 sec., wat overeenkomt met ongeveer 1 μL plasmide oplossing.
Opmerking: Bij het verwisselen van de naald puller, haarvaten of injector moet het systeem worden gekalibreerd om altijd 1 μL plasmide oplossing te leveren. De kalibratie kan worden uitgevoerd door de diameter van de plasmide druppel die wordt uitgezet in een minerale olie (bijv. paraffineolie) te meten en vervolgens het volume van de druppeltje te berekenen. Na 10 s van de injectie moet er ~ 1 μL plasmide vloeistof in de minerale olie worden uitgezet. - Bevestig het succes van de vorige stap door de verspreiding van vloeistof in het ventrikel te observeren.
5. elektroporation
- Verwijder de vis uit de injectie opstelling terwijl u hem nog in de spons houdt.
- Dompel de binnenste kant van de punt van de elektroden in de ultrageluid gel.
- Bedek de vistelencephalon met een kleine hoeveelheid ultrasone gel.
- Positioneer de viskop tussen de elektroden, plaats de positieve elektrode aan de ventrale kant van het hoofd van de vis en de negatieve elektrode aan de rugzijde (figuur 1c), terwijl het lichaam van de vis nog steeds in de spons wordt gehouden. Hiermee wordt de richting van de stroom van de stroom die nodig is om te elektroporeren ependymoglia gepositioneerd in de subventriculaire zone.
- Druk de elektroden zachtjes en precies tegen de telencephalon (afbeelding 1c). De stroom met het voetpedaal toedienen. Houd de elektroden op zijn plaats totdat alle vijf pulsen zijn voltooid.
6. herstel van de vis
- Laat de vis in de eerder voorbereide, continu belualde tank herstellen totdat deze wakker wordt. Lidocaïne gel kan worden aangebracht op de schedel om eventueel ontwikkelde pijn te verlichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven elektroporation methode maakt de levering van plasmide DNA in ependymoglial cellen, die zich oppervlakkig bevinden in de zebravis telencephalon en net onder de dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a).
Als het resultaat van de elektroporation positief is, kan het label enkelvoudige ependymoglial cellen (rode cellen in Figuur 2a, b) worden waargenomen onder andere ependymoglial cellen (wit in Figuur 2a, b). Afhankelijk van de efficiëntie van het elektroporation proces, kan een hoger (Fig. 2a) of lager (Figuur 2b) aantal ependymoglial cellen worden geëtiketteerd. Niettemin levert dit protocol een hoger aantal gelabelde cellen op dan eerder gepubliceerde20, wat duidelijk is in Figuur 3a en Video 1. Het is vermeldenswaard dat de hoogste dichtheid van gelabelde cellen neigt te ontstaan meestal aan de innerlijke, ventriculaire kant van beide hersenhelften (Figuur 3a), als gevolg van de manier waarop de geïnjecteerde plasmide vloeistof verdeelt tussen de hemisferen. In Video 1wordt een halve bol van de zebravis telencephalon gepresenteerd in 3D, en de ependymoglial cellen met radiale processen kunnen vanaf de zijkant worden gezien. De cellen zijn co-elektroporated en gelabeld met twee plasmiden, tdTomato-mem (rood fluorescerend eiwit verankerd aan het celmembraan) en H2B-YFP plasmide (etiketteer stof). Celdeling van twee kernen omringd door gele cirkels moet worden genoteerd.
Mislukte elektroporation resulteert in een zeer laag aantal of geen gelabelde ependymoglial cellen. Dit resultaat kan over het algemeen worden verklaard door onnauwkeurige injectie, waarbij de punt van het capillair niet door de dorsale Ependymale cellaag dringt. In dit geval, plasmide oplossing verspreidt zich boven de dorsale Ependymale cellaag in plaats van het vullen telencephalic ventrikel. Dit leidt tot Ependymale cellen die uitsluitend worden gelabeld (Figuur 3b). Dorsale Ependymale cellen (blauwe pijlen in Figuur 3b) verschillen morfologisch van ependymoglial cellen (gele pijl in Figuur 3a). Hun Soma is groter en cuboid, en ze bezitten geen radiale, langwerpige processen. Dit blijkt uit het vergelijken van een zijaanzicht van de cellaag ependymoglial (figuur 4a, B). TdTomato-mem gelabelde cellen zijn hoogstwaarschijnlijk Ependymale cellen, die zich boven de laag van ependymoglia bevinden (figuur 4b). Daarentegen wordt in figuur 4aeen tdTomato-mem die plasmide uitdrukt, geïntroduceerd in individuele ependymogliale cellen. Dus, ze Express tdTomato-mem naast hun eerste labeling (in dit geval transgene GFAP: GFP vis lijn, hier in wit gezien).
Dit protocol maakt het mogelijk de etikettering en het daaropvolgende volgen van het gedrag van ependymoglial cellen in zebravis telencephalon na letsel over een korte-21 of lange termijn3 periode. Dit wordt bereikt door Live, in vivo beeldvorming en helpt bij het aanpakken van de kwestie van hun rol in regeneratie en neurogenese.
Figuur 1: schematische weergave van de coronale sectie van de geemde zebravis telencephalon. A) schema van een coronale sectie van zebravis telencephalon, waarbij de positie van ependymogliale cellen, die het ventriculaire oppervlak van de bekleding en de opbouw van de ventrale ventriculaire wand, worden belicht. De dorsale Ependymale laag overbrugt de twee hemisferen en bedekt het ventrikel (V), gelegen tussen twee cellagen: ependymoglial en Ependymale. Zwarte pijl en de weergave van het oog geven de weergave weer in figuren 2 en Figuur 3. B) aan de linkerzijde een foto van de kop van de zebravis, die de positie van telencephalon met een witte stippellijn accentueerde. Een glazen capillair wordt rood afgebeeld, samen met de doellocatie voor capillaire invoeging. Afgebeeld aan de rechterkant is een schematische weergave van zebravis hersenen met de positie van plasmide injectie in rood. Opgemerkt moet worden dat het Glazen capillair de telencephalon niet aanraakt en dat het plasmide net boven de telencephalon in de ventrikel wordt geïnjecteerd. T = telencephalon, OT = optische Tectum. (C) links afgebeeld is een foto van de zebravis-kop (zijaanzicht), en aan de rechterkant is een afbeelding van de kop (zijaanzicht) die de positie van elektroden weergeeft om de telencephalon te targeten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Micro grafieken met effectieve elektroporation uitkomsten. Driedimensionale weergave van a (a) groter of (B) kleiner aantal elektroporated ependymoglial cellen in de volwassen zebravis telencephalon, zoals van bovenaf gezien. De elektroporation werden gedaan in TG (GFAP: GFP) vis lijn uitdrukken GFP fluorescerende eiwit (afgebeeld in wit) in alle ependymoglial cellen. Individuele elektroporated cellen worden geëtiketteerd met pCS2-tdTomato-mem plasmide3. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: confocale micro Foto's die het verschil afbeelden tussen succesvolle en mislukte elektroporation. A) driedimensionaal confocale beeld van Babb-geclearde zebravis telencephalon (ref) met een groot aantal PCs-tdTomato-mem elektroporated ependymoglial cellen. De morfologie van de ependymoglial cellen met lange, langwerpige processen (gele pijlen) moet worden genoteerd. Beide telencephalic halfronden, gemarkeerd met gele onderbroken lijnen, kunnen worden waargenomen. B) confocale afbeelding van mislukte elektro Poration van PCS2-tdTomato-mem plasmide. Meestal worden dorsale Ependymale cellen geëtiketteerd, en weinig ependymoglial cellen Express tdTomato-mem plasmide. Het duidelijke verschil in de morfologie van Ependymale cellen (blauwe pijlen) moet worden genoteerd. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4:3D-laterale weergaven van elektroporated en niet-electroporated ependymoglial cellen. A) driedimensionale laterale representatie van elektroporated ependymoglial cellen, positief voor zowel TG (GFAP: GFP) en PCS2-tdtomato-mem (gele pijl). B) 3D laterale representatie van mislukte elektro poration. De locatie van de pCS2-tdTomato-mem positieve cellen boven de TG (GFAP: GFP) ependymoglia laag moet worden genoteerd. Hoogstwaarschijnlijk werden dorsale Ependymale laag cellen geëelektroporeerd (blauwe pijl). Schaal staven = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1:3D-film van zebravis telencephalon en electroporated ependymoglial cellen. Video toont een halve bol van de zebravis telencephalon in 3D. Ependymoglial cellen zijn co-elektroporated met twee plasmiden: tdTomato-mem (rood fluorescerende eiwit verankerd aan het celmembraan) en H2B-YFP plasmide (Labelling nuclei). Individueel gelabeld ependymoglia met radiale processen die van opzij kunnen worden waargenomen. Gele cirkels markeren ependymoglial cel met mitotische figuur gevisualiseerd door H2B-YFP gelabeld Chromatin. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit electroporatie protocol is een betrouwbare in vivo methode voor het labelen van individuele ependymoglial cellen. Het protocol moet mogelijk een verdere aanpassing voor het labelen van andere celtypen zoals neuronen of oligodendrocyten. Om tot een succesvolle etikettering te komen, kunnen plasmiden met verschillende promotors worden gebruikt. De promotor van Chicken-Beta actine, eF1alpha, CMV en ubiquitine zijn eerder gebruikt om de expressie van verschillende transgenen in ependymoglia en hun nakomelingen23te stimuleren. Er werd echter een verschillende kinetiek van transgenexpressie waargenomen die in de rekening moest worden opgenomen. Bijvoorbeeld, CMV Promoter gedreven transgen expressie is zeer snel (uitdrukking kan worden gezien na 24 h), terwijl eF1alpha langer duurt. Afgezien van het labelen, kan het electroporatie protocol worden gebruikt als een snel en ongecompliceerd platform voor het bewerken van genen met het gebruik van CRE of of crispr Cas9 technieken22. Bovendien kan het gebruik van Flip-cassette25-bevattende plasmiden en hun elektroporation in cel-typespecifieke CRE-lijnen dienen als een duidelijke uitbreiding van een methode die het mogelijk maakt om etikettering of genbewerking in de ependymoglial-nageslacht gegenereerd na electroporatie.
Dit protocol heeft verschillende kritieke stappen. Ten eerste, tijdens de injectie stap, moet de experimentele voorzichtig zijn dat de geïnjecteerde plasmide hoeveelheid gelijk is voor elke afzonderlijke vis, zodat het aantal gelabelde cellen vergelijkbaar blijft. Dit kan worden bereikt door de grootte van de glazen capillaire opening te regelen, wat betekent dat de snede van elke tip constant moet zijn tussen verschillende capillairen of de kalibratie moet worden uitgevoerd voor elk afzonderlijk capillair. Bovendien moet de duur van de injectie, gereguleerd door een voetpedaal, voor elke afzonderlijke injectie hetzelfde zijn. Ten tweede is de juiste positie van een gat in de schedel gemaakt met het micro-mes cruciaal voor de juiste dispersie van de plasmide vloeistof doorheen het telencephalon. Het is even belangrijk om de dorsale Ependymale cellaag te penetreren met de capillaire punt, zoals vermeld in het protocol. Bovendien is het ook essentieel dat het gecreëerde gat niet te groot is om te voorkomen dat het plasmide mengsel en de cerebrospinale vloeistof uit het telencephalon lekt. Een andere kritieke stap is de sterkte van de toegepaste elektrische stroom. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het elektroporation apparaat zo nauwkeurig mogelijk functioneert, zodanig dat de sterkte van de toegepaste stroom niet veel afwijkt van de spanning die op het scherm wordt weergegeven, wat niet altijd nauwkeurig is. Als deze waarden niet consistent zijn, is het noodzakelijk om de sterkte van de stroom op het elektroporation apparaat aan te passen, aangezien een toegediende stroom hoger dan de aanbevolen 54-57 V de overleving van vissen in gevaar kan brengen.
In vergelijking met de andere methoden voor een plasmide levering en celetikettering die vaak in het veld wordt gebruikt, heeft electroporatie duidelijke voordelen. Ondanks de hierboven genoemde kritische stappen gebeurt het zeer zelden dat er geen elektroporated cellen kunnen worden waargenomen of dat de dorsale Ependymale cellen per ongeluk worden geelektroporeerd. Over het algemeen is het succespercentage van dit electroporatie protocol 90%-95% en we observeren bijna geen Tunel + cellen na elektroporation. In tegenstelling tot lipofectie bijvoorbeeld, tijdens de elektroporation, kationische liposomen (bijvoorbeeld lipofectamine) worden niet gebruikt en dus toxiciteit verbonden met het gebruik ervan wordt volledig vermeden26. Eerder werd gemeld dat lipofectie en elektroporation hebben gelijke efficiëntie tarieven (20-50 cellen per telencephalon)27. Echter, dit geoptimaliseerde protocol levert over het algemeen 100-200 cellen per telencephalon. In vergelijking met virale vectoren, is bioveiligheid geen probleem met elektroporation.
Bovendien, vaak gebruikte aavs of lentivirussen niet te produceren detecteerbare expressie van transgenen in zebravis hersenen17,28. Tot slot, hoewel het CRE-Lox-systeem tegenwoordig veel wordt gebruikt in zebravissen, is plasmide elektroporation sneller, omdat het geen lange wachttijden vereist voor het kweken en kweken van vissen en het mogelijk maakt individuele celetikettering en tracering toe te staan. Een dergelijke techniek vereist echter zeer bekwame wetenschappers om succesvolle elektroporation en hoge overlevingspercentages van proefdieren te bereiken (we ervaren meestal overlevingspercentages van ~ 70%-80%). Dit percentage heeft ook de neiging om te schommelen afhankelijk van de experimenteur. Het leren van de procedure vereist praktijk en duurt meestal drie proeven. Dit is echter afhankelijk van de handmatige Behendigheid van het individu en kan in sommige gevallen langer duren.
Het gepresenteerde electroporatie protocol is een snelle, zeer efficiënte methode voor het elektroporeren van een groot aantal ependymoglial cellen met de nodige voorzorgsmaatregelen om optimale resultaten te verkrijgen. Elektroporation van de volwassen zebravis telencephalon is cruciaal voor het visualiseren van individuele ependymoglial cellen en het bestuderen van hun rol in neurogenese en regeneratie processen. Onlangs is er succes geboekt in de gelijktijdige verstoring van meerdere genen van de volwassen zebravis telencephalon door het bewerken van genen via de elektroporation en StagR Cas9 technieken22. Dit opent vele mogelijkheden en toekomstige toepassingen van elektroporation voor een breed scala van genetische manipulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Speciale dank aan James Copti voor het bewerken van het manuscript. We erkennen ook dankbaar financiering aan JN van de Duitse Research Foundation (DFG) door de SFB 870 en SPP "integratieve analyse van olfaction" en SPP 1738 "opkomende rollen van niet-coderende Rna's in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, plasticiteit & ziekte", SPP1757 " Glial heterogeniteit "en Excellence strategie in het kader van de Munich cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
