Summary
نحن نصف نموذجًا لزراعة قلب البطن غير المعوثي في الفئران ، مما يعني تعديلات على الاستراتيجيات الحالية ، مما يؤدي إلى نهج جراحي مبسط. بالإضافة إلى ذلك، نحن نصف نموذج الرفض الجديد عن طريق الحقن داخل الأذن لخلايا عضلة القلب الحيوية، مما يسمح بإجراء المزيد من التحليلات المناعية لعملية زرع في الفئران.
Abstract
كانت زراعة القلب الهيتروبية في الفئران نموذجًا شائعالاستخدام للدراسات المناعية المتنوعة لأكثر من 50 عامًا. وقد أُبلغ عن عدة تعديلات منذ الوصف الأول في عام 1964. بعد 30 عامًا من إجراء زراعة القلب الغيرية في الفئران ، طورنا نهجًا جراحيًا مبسطًا ، والذي يمكن تعليمه وإجراؤه بسهولة دون مزيد من التدريب الجراحي أو الخلفية.
After dissection of the ascending aorta and the pulmonary artery and ligation of superior and inferior caval and pulmonary veins, the donor heart is harvested and subsequently perfused with ice-cold saline solution supplemented with heparin. بعد لقط وتقنين الأوعية البطن المتلقية، المتبرع يصعد الشريان الأورطا والشريان الرئوي هي anastomosed إلى الشريان الأورطا البطن المتلقي والوريد الوريد افينا السفلي، على التوالي، وذلك باستخدام غرز الجري المستمر.
اعتمادا على مجموعات مختلفة بين المانحين والمتلقي، يسمح هذا النموذج بتحليل الرفض الحاد أو المزمن للالوجرافات. ومما يعزز الأهمية المناعية لهذا النموذج من خلال نهج جديد من حقن داخل الأذن من خلايا عضلة القلب الحيوية والتحليل اللاحق لاستنزاف الأنسجة اللمفاوية عنق الرحم.
Introduction
زرع القلب الهيتروتوبي هو نموذج تجريبي يستخدم بشكل متكرر للتحقيقات المختلفة المتعلقة بتحمل زراعة الأعضاء ، ورفض allograft الحاد والمزمن ، وإصابة نقص التروية وإعادة التروية ، وتضخم الآلة أو إعادة عرض القلب. من بين مزايا أخرى ، يمكن مراقبة وظيفة الكسب غير المشروع بشكل غير جراحي عن طريق الجس والفشل في الكسب غير المشروع لا يؤدي إلى ضعف حيوي للمتلقي على النقيض من الأعضاء الأخرى ، مثل الكلى أو الكبد.
في عام 1964، وصف أبوت وآخرون في البداية زرع قلب البطن التغايري في الفئران1. في وقت لاحق، في عام 1966، وصفت تقنية من طرف إلى طرف لanastomoses من قبل توميتا وآخرون2. تم الإبلاغ عن الأساس للنموذج المستخدم حاليا من قبل اونو وليندسي في عام 19693. خلال العقود الماضية، تم نشر العديد من التعديلات لإنشاء أنواع مختلفة من الطعوم القلب البطيني تفريغ، محملة جزئيا أو محملة بما في ذلك الجمع بين غير النوبة زرع القلب والرئة4،5،6. بالنسبة للتحليلات المناعية، يتم إجراء زراعة ترقيع القلب غير المحملة بالحجم الأكثر شيوعًا. في هذه الحالة، تدفق الدم يدخل إلى الوراء الشريان الأورطا الصاعد المانحة وبالتالي الشرايين التاجية. يحدث الصرف الوريدي على طول الجيوب الأنفية التاجية في الأذين الأيمن والبطين(الشكل 1A-B). لذلك ، يتم استبعاد البطين الأيسر من تدفق الدم ، بصرف النظر عن الكميات الهامشية من الدم من الأوردة البسية. وهذا أيضا يجعل من نموذج مفيد لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية خلال البطين الأيسر مساعدة الجهاز العلاج7.
وقد أجريت زراعة القلب الهيتروبية في أنواع مختلفة بما في ذلك الفئران والأرانب والخنازير وحتى تم استخدامها كجهاز مساعدة أحادي أو ثنائي في البشر8,9,10,11. لا يزال الجرذ يمثل الحيوان التجريبي الشعبي لنماذج زراعة الأعضاء ، خاصة وأن أوقات البقاء على قيد الحياة للكسب غير المشروع لتركيبات سلالات الفئران المختلفة كانت محددة بشكل جيد في الماضي وعدد كبير من الكواشف المناعية يمكن الوصول إليها12،13. على عكس الفئران ، الفئران هي أكبر مما يجعل الجراحة والوصول إلى الأنسجة اللمفاوية للتحليلات المناعية أكثر جدوى12. وعلاوة على ذلك، فإن إدخال تكنولوجيات الاستنساخ التجاري في الفئران في السنوات الأخيرة سيؤدي على الأرجح إلى الاهتمام المتكرر بنماذج الفئران التجريبية14.
بشكل عام ، يمكن توصيل طعوم القلب الغيرية بالأوعية المتلقية إما عن طريق إجراء انستوموز عنق الرحم أو البطن. ومع ذلك، تشير بعض الدراسات إلى أن الأناستوموسيس الفخذي يسهل تحسين الرصد بسبب الوصول الأفضل للملامسة اليدوية أو تخطيط صدى القلب وإعادة النظر في الصدى، وبالتالي يسمح بالكشف بشكل أكثر دقة عن فشل الكسب غير المشروع15،16.
وقد ثبت أنه لا يوجد فرق فيما يتعلق بوقت العملية ومعدل المضاعفات والنتيجة ووقت البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع بين كل من تقنيات anastomosis17. ومن الواضح أن توافر عدد كاف من الغدد الليمفاوية المستنزفة يجب أن يذكر كفائدة من الانسطوموسات العنقية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فترات تدريب أطول. في المقابل ، فإن أنسح البطن أقل تعقيدًا وقيمة بنفس القدر للتحقيقات المناعية ، خاصة عندما يقترن بنتائج طريقة جديدة لحقن خلايا عضلة القلب المتعددة الألياف واستئصال الغدد الليمفاوية اللاحقة في عنق الرحم. مزيج من كلا النموذجين يقدم مجموعة واسعة من التحليلات المناعية بعد التدخل.
البروتوكول التالي يشير إلى التشغيل في أزواج من الجراحين من أجل تقليل وقت نقص التروية. ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب من قبل شخص واحد. يتم عرض إعداد الأدوات والمواد لزراعة القلب وزرع في الشكل 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس المحلي لاستعراض الحيوانات الأخلاقية التابع للسلطات الإقليمية لحماية المستهلك وسلامة الأغذية في ساكسونيا السفلى (LAVES، أولدنبورغ، ألمانيا) بالموافقة على الـ IDs 12/0768 و 17/2472.
1. القلب explantation والتسريب
ملاحظة: كما المتبرعين الكسب غير المشروع، تم استخدام الفئران الإناث أو الذكور في سن 7-22 أسابيع.
- قم بإضفاء التّزّرعلى الجرذ انثّيب التّرّجّر باستنشاق الإيزوفران (الحث بنسبة 5% والصيانة بنسبة 3% مع تدفق O2 من 1 لتر/دقيقة). حقن 5 ملغ من Carprofen تحت الجلد لكل كيلوغرام من وزن الجسم للمسكن اتى الجراحة والتحقق من عدم وجود إصبع القدم قرصة سحب منعكس.
- تطبيق زيوت التشحيم العين وإزالة الفراء البطن والصدر باستخدام مقص الميكانيكية.
- ضع المتبرع في وضع ية، وأصلح الأطراف في قاعدة طاولة العملية بأربطة مرنة وتعقيم الجلد بالإيثانول بنسبة 70% أو بديل كاف ٍ آخر.
- تُقسّس الجلد في اتجاه طولي وبعد تطبيق مخدر موضعي (على سبيل المثال، الليدوكائين 0.2%) إجراء عملية التنظير الوسيط باستخدام مقص.
- إدراج المنقات، وتعبئة الأمعاء إلى يسار المتبرع، وفضح الوريد الوريد السفلي مع مسحات القطن المعقم.
- لتخثر, حقن 500 وحدة دولية من الهيبارين حل في 1 مل من الجليد الباردة حل الخط اللاي متساوي التوتر عن طريق الوريد عن طريق ثقب الوريد الوريد الوريد السفلي فينا. وقف النزيف في موقع ثقب عن طريق ضغط الضوء مع مسحة القطن بعد التراجع عن الإبرة(الشكل 3A).
- يُقنع الحجاب الحاجز ويُجري استئصال الصدر الجانبي على جانبي المتبرع.
- دبوس الجدار البطني المعبأة من الصدر على طاولة العملية.
- إزالة التاموروكارديوم والعصب المبهم عن طريق إعداد صريح باستخدام اثنين من أصحاب إبرة صغيرة.
- إجراء استئصال الأوعية البطنية من أجل exsanguinate المتبرع وتفريغ القلب.
- إدراج فرع صريح من مقص مدببة التحقيق في الجيوب الأنفية عبر الأقراص ويفصل الشريان الأورطا التصاعدي والشريان الرئوي كما distal ممكن تحت الجر السمرة الخفيفة للقلب مع ضغط الرطب(الشكل 3B).
- Place a single 5-0 ligature around the superior and inferior vena cava and the pulmonary veins and tighten it as dorsal as possible (Figure 3C).
- قطع الأنسجة الظهرية إلى الرباط واستخراج القلب(الشكل 3D).
- perfuse القلب مبشور مع قنية 18 G من القسطرة الوريدية من خلال الشريان الأورطي التصاعدي والشريان الرئوي مع 30 مل من الجليد الباردة، حل محلول محلول الأيزون اتلاني تكملها 1000 وحدة دولية من الهيبارين ووضع القلب في أنبوب 15 مل مليئة محلول المالحة على الجليد(الشكل 3E-F).
2. زرع القلب
ملاحظة: كمستلمين، تم استخدام الفئران الأنثوية أو الذكور القديمة من 10-14 أسبوعًا. وكان وزن المانحين والمتلقين تقريبا.
- إجراء التخدير من الفئران المتلقي باستخدام استنشاق الايفلوران أيضا (التعريفي في 5٪ والصيانة في 1.5-2٪ مع تدفق O2 من 1 لتر / دقيقة). حقن 5 ملغ من Carprofen تحت الجلد لكل كيلوغرام من وزن الجسم للمسكن اتى الجراحة والتحقق من عدم وجود إصبع القدم قرصة سحب منعكس.
- تطبيق زيوت التشحيم العين، وإزالة الفراء في البطن، وإصلاح الأطراف وتعقيم الجلد على نحو مماثل لإعداد المانحة. للحصول على النتيجة المثلى بعد الجراحة، قم بإجراء العملية على حصيرة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم داخل العملية.
- بعد الشق الطولي للجلد، ضعي مخدرًا موضعيًا، مثل الليدوكائين (0.2%)، على اللفافة البطنية. فتح تجويف البطن عن طريق عملية اللاباتورات الوسطى وإدراج المنقات.
- تعبئة الأمعاء إلى الجانب الأيسر العلوي من المتلقي ووضعها في ضغط دافئ ومبلل.
- بعد تعبئة الاثني عشر وjejunum القريبة ، على التوالي ، وذلك باستخدام المجهر الجراحي (أو النظارات المكبرة) مع التكبير 5-7x ، وفضح الأبهر البطني والوريد السفلي عن طريق إعداد صريح مع مسحات القطن. لا تفصل الأوعية البطنية.
- رفع الأوعية البطن باستخدام اثنين من أصحاب إبرة صغيرة دون إصابة الأوردة القطنية ووضع المشبك كولى الأوعية الدموية(الشكل 4A).
- ثقب الأوعية البطنية مع 30-45 درجة مقوسة 27 غ قنية(الشكل 4B).
- تكبير موقع ثقب باستخدام مقص بوتس لإنشاء شق طولي يطابق حجم تجويف الأوعية المانحة(الشكل 4C-D)وperfuse الأوعية المتلقية مع محلول المالحة من أجل إزالة الجلطات ومنع تجلط الدم بعد العملية الجراحية.
- وضع الكسب غير المشروع في الجلوس ومثبت المانح يصعد أورتا إلى أورتا البطن المتلقي من قبل اثنين من غرز بسيطة توقف (8-0 monofilament غير resorbable خياطة) في الزاوية القحفية وcaudal من شق طولي(الشكل 4E).
- Anastomose أورتا الصاعد للمتبرع مع أبهر البطن من المتلقي عن طريق تشغيل 8-0 خيوط monofilament في خطوتين: أولا، وضع الكسب غير المشروع على يمين الأوعية المتلقية وأداء النصف الأول من anastomosis(الشكل 4E). في وقت لاحق ، ضع الكسب غير المشروع على يسار الأوعية المتلقية وقم بالنصف الثاني من الانستوموس(الشكل 4F).
- تثبيت الشريان الرئوي المتبرع إلى الوريد الوريد البطني السفلي على نحو مماثل لanastomosis الشريان الأبهري (8-0 monofilament غير resorbable خياطة). خياطة النصف الأول من الانستوموموسيس ووينوس من الجانب intraluminal من السفينة(الشكل 4G-H).
- تدفق anastomoses مع المالحة مباشرة قبل تشديد عقدة لمنع الانسداد المحيطي.
- وضع شاش hemostatic حول كل من anastomoses والإفراج بعناية المشبك كولى الأوعية الدموية بحيث يمكن أن تبدأ reperfusion من الكسب غير المشروع. التعامل مع نزيف على طول anastomoses عن طريق ضغط الضوء مع مسحات القطن المعقم.
ملاحظة: يجب أن يبدأ الكسب غير المشروع في الضرب بعد حوالي 60 s. - استبدال الأمعاء في meander مثل الموضة. تأكد من عدم وجود سوء دوران للأشعة الميستيرية لمنع نخر الأمعاء أو الانسداد الميكانيكي.
- أغلق عضلات البطن/اللفافة والجلد بشكل منفصل باستخدام خيوط الجري المستمرة 3-0.
3. الرعاية بعد الجراحة
- للمسكن بعد الجراحة، قم بتزويد المتلقين بحقنة إضافية تحت الجلد من 5 ملغ من كاربروفين لكل كيلوغرام من وزن الجسم في أول يوم بعد الجراحة (POD). بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1 غرام من Metamizol إلى 500 مل من مياه الشرب حتى POD الثالث.
- ابدأ في مراقبة وظيفة ترقيع القلب عن طريق ملامسة البطن اليومية على POD الثالث.
ملاحظة: في حالة فشل الكسب غير المشروع قبل POD الثالث، يجب النظر في فشل جراحي بدلاً من فشل مناعي. ومع ذلك ، فإن هذا بالطبع يعتمد على مجموعة السلالة المختارة والنموذج المناعي لكل منهما (على سبيل المثال ، الرفض الحاد بعد التمنيع السابق). - بعد رفض الكسب غير المشروع ، واستخراج الأنسجة مثل استنزاف العقد الليمفاوية الرجعية الجمجمة من anastomoses ، الطحال ، الدم ، الغدة الصعترية والكسب غير المشروع لمزيد من التحليلات المناعية عن طريق قياس خلايا التدفق أو الكيمياء المناعية.
4. الهضم الأنزيمي للقلب والحقن تحت الجلد لخلايا القلب في الأذن
- إجراء زراعة القلب والتسريب على نحو مماثل لزراعة القلب الغيرتوب (انظر الخطوة 1).
- أجاد القلب في كتل 3 مم × 3 مم باستخدام مشرط معقم أو مقص معقم واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في وسط الثقافة الذي يحتوي على 0.5 ملغم/مل كولاجانز.
ملاحظة: من المهم استخدام الثقافة المتوسطة التي تحتوي على البنسلين والعقدتوميسين والغلوتامين دون مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) خاصة وأن FCS يمنع هضم الكولاجين. - إضافة الأنسجة المهضومة إلى منخل كبير pored، في حين إزالة المتوسطة الثقافة والمفروم تماما للحصول على تعليق خلايا عضلة القلب الحيوية، ومعظمهم من خلايا القلب الواحدة الميتة وخلايا الدم المتبقية. اغسل تعليق الخلية مرتين بمحلول محلول ملاهوي معقم.
ملاحظة: إعدادات الطرد المركزي: 10 دقيقة، 200 × ز، 20 درجة مئوية - تصفية التعليق باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وجمع التكوينات الخلية الحيوية عن طريق مسح مصفاة الخلية مع 5-10 مل من محلول محلول محلول ملاهوتوني.
- After centrifugation, resuspend the cardiac muscle cells in saline solution dissolved at a concentration of 5x105 cells/mL and draw the cell solution up into a 1 mL syringe.
- إجراء التخدير على نحو مماثل للبروتوكول الموصوف للنارخة المتلقي (انظر الخطوة 2) لزراعة القلب غير المتجانسة.
- ضع المستلم في وضع جانبي وأصلح الأذن بإصبع باستخدام شريط مزدوج الجانب(الشكل 5A).
- حقن 20 ميكرولتر من محلول خلايا عضلة القلب (الذي يحتوي على 1 × 104 خلايا) عبر 27 G قنية s.c. بالقرب من الأوعية الشعرية البصرية في أذن المتلقي(الشكل 5B).
- بعد فترة مراقبة محددة (اعتمادًا على تركيبة السلالة المختارة وقوة الرفض) ، استخرج الغدد الليمفاوية العنقية المنستنزفة وإجراء المزيد من التحليلات مثل قياس التدفق الخلوي أو الثقافات المشتركة(الشكل 5C).
ملاحظة: وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل النسيجي للpinna لتحديد تسلل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الماضي ، تم معالجة القضايا المناعية المختلفة على أساس النموذج ، الذي تم التحقق من صحته في مجموعة العمل بأكثر من 500 عملية زرع بنسبة بقاء تزيد عن 95٪13،18،19,،20،21،22،23،24. عادة ً لم يتجاوز إجمالي أوقات التشغيل (بما في ذلك زراعة الزرع والزرع) 60 دقيقة ، في حين أن أوقات نقص التروية الباردة والدافئة مجتمعة كانت حوالي 30 دقيقة. كانت مجموعات السلالة المطبقة تستند بشكل رئيسي إلى خلفية لويس (لو). نجت عمليات الزرع المنجينية لمدة تصل إلى 100 يوم دون علامات على فشل الكسب غير المشروع ، ولكن تقليل الوزن والحجم بشكل كبير على زراعة الطعوم. في الآونة الأخيرة ، قمنا بزرع القلب الغيرمدار في مجموعتين مختلفتين من المتبرعين والمتلقين يحاكيان نموذج رفض سريع ومطول: Lew.1a → Lew wt مما يؤدي إلى الرفض السريع (متوسط وقت البقاء على قيد الحياة 7.4 أيام) و Lew.1u-7B→ Lew.1a مما يؤدي إلى رفض أكثر طولا (متوسط وقت البقاء على قيد الحياة من 42.5 أيام)(الشكل 6). بمنظار ، أظهرت الطعوم المرفوضة تجلطًا مصحوبًا بتلون وتورم غاضب ، في حين أن الطعوم غير المرفوضة تظهر ضمورًا متميزًا ، على الأرجح نتيجة لبطين أيسر تفريغ. وعلاوة على ذلك، وضعنا أقسام cryostat من القلوب المزروعة من أجل الكشف عن تسلل الخلايا باستخدام طريقة تلطيخ الفوسفاتيز الفوسفاتاس القلوية المضادة للقلال (APAAP). تم دمج إطارات مفردة مع تكبير 50x إلى صورة مركبة واحدة ، مما يعطي نظرة عامة على الكسب غير المشروع الكامل وتوزيع الخلايا المتسللة. أظهر التحليل النسيجي زيادة تسلل (على سبيل المثال، CD4+، TCR+، أو NKR-P1A / B+)الخلايا المناعية في الطعوم المسببة للأصل ، في حين كانت الطعوم المنقانية خالية إلى حد كبير من تسلل الخلايا(الشكل 7A-C).
كشف استئصال الغدد الليمفاوية العنقي وإعادة التحفيز من استنزاف خلايا العقدة الليمفاوية بعد حقن الأذن من خلايا عضلة القلب في تركيبات سلالة المذكورة أعلاه الاستجابات المناعية متميزة سلالة محددة تجاه أنسجة القلب الألوجينية وسمح مزيد من التحليلات المناعية، مثل التنميط السيتوكين(الشكل 8A-C).
الشكل 1: العرض التخطيطي للأنسموس من طرف إلى آخر وتدفق الدم الناتج عبر القلب. بعد أنسطوس المتبرع يصعد الشريان الأورطا من طرف إلى آخر إلى الشريان الأورتيا البطني المتلقي وبالمثل الشريان الرئوي إلى الوريد السفلي السفلي المتلقي(A)،تدفق الدم يدخل الشرايين التاجية عبر الشريان الأورطا التصاعدي. يحدث الصرف الوريدي عبر الشريان التاجي الجيوب الأنفية في الأذين الأيمن والبطين وعبر الشريان الرئوي في الوريد السفلي للمتلقي(B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأدوات والمواد الجراحية المطلوبة. (A)Explantation: 1: شريط الأطراف المرنة، 2: الرنافذ، 3: 5-0 الرباط، 4: مقص مدبب، 5-6: أصحاب إبرة صغيرة، 7: مقص، 8: ملقط جراحية، 9: ملقط صغيرة، 10: زيوت التشحيم العين، 11: كمادات، 12: مسحات القطن، 13: قاعدة التروية، 14: محلول أملي على الجليد. (ب)زرع: 1: شريط الأطراف المرنة، 2: الجرارات، 5-6: أصحاب إبرة صغيرة، 7: مقص، 8: ملقط، 9: ملقط صغيرة، 10: زيوت التشحيم العين، 11: كمادات، 12: مسحات القطن، 15: مقص صغير، 16: ملقط صغيرة، 17: مقص بوتس، 18: حامل إبرة، 19: قنية مقوسة، 20: المشبك الوعائي كولي، 21: 8-0 خيوط monofilament، 22: شاش الهيمولاتيكي، 23: 3-0 خيوط البوليفيل، 24: طبق بيتري، 25: كاربروفين (5 ملغ/مل)، 26: مخدر موضعي (ليدوكائين 0.2%)، 27: محلول محلول ملايلي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مزرعة القلب. بعد الهيبارينية(A)، يتم إجراء عملية قطع الصدر وتقطع الشريان الأورطا التصاعدي والشريان الرئوي كما distal ممكن(B). مع واحد رباط الرئة والأوردة الكافالية على حد سواء هي انسداد(C)ويتم إزالة القلب من تجويف الصدر(D). (E)يظهر القلب قبل و (F)بعد التبرّق مع محلول ملافي 30 مل يحتوي على الهيبارين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: زرع القلب. بعد عرض الأوعية البطنووضع المشبك الوعائي كولي(A)يتم cannulated الأوعية(B)ويتم تنفيذ شق طولي باستخدام مقص بوتس(C-D). يركز المانح الصاعد الأبهر مع عقدة واحدة في كل من الزاوية القحفية وcaudal من شق أورتا البطن المتلقي(E)ويتم تنفيذ الانستوموز بواسطة خيوط تعمل باستمرار(E-F). لاحظ أن يتم وضع الكسب غير المشروع على الجانب الأيمن من الأوعية للنصف الأول من الانستوموموسيس(E)وعلى الجانب الأيسر من الأوعية للنصف الثاني من الأنستوموس(F)وanastomosis venous لاحقة. يتم تنفيذ النصف الأول من الانستوموس ووينوس بواسطة خياطة intraluminal(G). بعد الانتهاء من النصف الثاني من الانستوموموسيس وريدي ، والكسب غير المشروع على استعداد للتشفي(H). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: حقن في الأذن من خلايا عضلة القلب المسببة للألم. بعد تثبيت أذن المتلقي على إصبع باستخدام الشريط على الوجهين(A)يتم حقن خلايا العضلات القلبية الحيوية المسببة للبيئة تحت الجلد بالقرب من الأوعية الشعرية البصرية(B). بعد فترة مراقبة استنزاف الغدد الليمفاوية عنق الرحم(*) يتم استخراج(C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بقاء القلب في تركيبات مختلفة syngenic وallogenic المانحة والمتلقي. تحليل كابلان ماير يظهر بقاء syngenic (ن = 10 نموذج الرفض السريع؛ ن = 5 نموذج الرفض لفترات طويلة) والطعوم الألوجينية (ن = 11 نموذج الرفض السريع؛ ن = 14 نموذج الرفض لفترات طويلة). في نموذج الرفض المطول وصلت ستة من 14 مستلمًا إلى نهاية فترة المراقبة (60 يومًا) دون فشل في الكسب غير المشروع ، مما يؤدي إلى بقاء الكسب غير المشروع لفترة طويلة في هذه المجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التحليل النسيجي لترقيع القلب المنجيني والمسبب للأصل. (A-B)تظهر تسلل خلايا CD4+ باستخدام طريقة تلطيخ APAAP في الكسب غير المشروع syngenic(A)والكسب غير المشروع الألوجيني عند الرفض(B). (C)يعرض زيادة تسلل الخلايا في الطعوم الألوجينية بالمقارنة مع الطعوم syngenic (بمثابة مجموعة مرجعية) لمختلف المجموعات الفرعية للخلايا المناعية. تم تعديل التصنيف المطبق لقياس تسلل الخلايا من Hirschburger et al.25:0 = التسلل المماثل للطعوم المنقفية؛ 0.5 = زيادة طفيفة في الخلايا الملطخة في أقسام الأنسجة المعزولة؛ 1 = زيادة الخلايا الملطخة المفرد على قسم الأنسجة بأكملها؛ 1.5 = زيادة مجموعات الخلايا الملطخة موزعة بشكل موحد على قسم الأنسجة بأكملها؛ 2 = قوي؛ 2.5 = قوي جدا؛ 3 = أقوى زيادة في مجموعات الخلايا الملطخة في جميع أنحاء قسم الأنسجة بأكملها. تم تحليل الأقسام النسيجية للطعوم باستخدام التكبير 50x. وأُدرجت في التحليل خمسة طعوم لكل مجموعة (syngenic وallogenic، على التوالي). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تحليل خلايا العقدة الليمفاوية المستنزفة بعد حقن خلايا عضلة القلب الكلوية في الأذن. إعادة محددة للتحفيز (مع 2 × 105 الخلايا الجنبية من سلالة المانحة المعنية) من 2 × 105 الخلايا الليمفاوية التي تم حصادها من إما استنزاف الغدد الليمفاوية العنقية أو ميستيريا (LN) من رفض سريع لو wt وإطالة أمده أظهر المستلمون الرافضون لـ Lew.1a انخفاضًا كبيرًا في انتشار خلايا العقدة الليمفاوية المستنزفة في متلقي Lew.1a(A)، في حين أن القدرة التكاثرية بشكل عام كانت لا تزال ملحوظة بعد تحفيز غير محدد مع الأجسام المضادة CD3/CD28(B). ومن المدهش أن التنميط السيتوكين كشف عن زيادة السيتوكينات الالتهابية في الغدد الليمفاوية من المتلقين رفض لفترات طويلة(C). وتقدم النتائج على أنها متوسط ± SEM من ما لا يقل عن 4 الحيوانات لكل مجموعة. ويشار إلى أهمية مع * لقيم ف ≤ 0.05 و **** لقيم ف ≤ 0.0001. (تم تعديل هذا الرقم من بيتز وآخرون24). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعتمد الطريقة الموصوفة سابقًا لزراعة القلب الغيرتوب في الفئران بشكل رئيسي على وصف Ono و Lindsey في عام 19693. ومنذ ذلك الحين، أدخلت عدة تعديلات على أنواع مختلفة مما أدى إلى تنوع واسع في هذا النموذج. الجمع بين العديد من هذه التعديلات وإدخال تجربتنا الخاصة الناتجة عن أكثر من 30 عاما من إجراء عمليات زرع القلب الهيتروبية في المختبر، أنشأنا نهجا جراحيا ممكنا، والتي لا تتطلب فترات تدريب طويلة أو خلفية جراحية. وفي ما يلي، سنناقش القيود العامة لهذا النموذج ونؤكد على الخطوات الحاسمة للبروتوكول. وعلاوة على ذلك، سوف نؤكد على فوائد الجمع بين زرع القلب اللانوبة مع طريقة جديدة من حقن في الأذن من خلايا العضلات القلبية.
التخدير والمضاعفات العامة
على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن تخدير الإزوفدوران يتفوق على تخدير الحقن فيما يتعلق بالبقاء المبكر على قيد الحياة بعد زرع القلب الغيري، لا يزال الاكتئاب التنفسي داخل العملية يمثل واحدة من المضاعفات الأكثر شيوعًا، وبالتالي يتطلب إدارة مخدّرة دقيقة26. بدلا من الكسب غير المشروع المسلسل explantation والزرع، على التوالي، ونحن ننصح البدء في إعداد المتلقي والأوعية البطنية مباشرة بعد استئصال الصدر من الحيوان المانح، لا سيما لأن أوقات العملية أقل من ساعة واحدة ترتبط مع نتيجة أفضل فيما يتعلق الكسب غير المشروع والبقاء على قيد الحياة المتلقي26،27. بالإضافة إلى المضاعفات المذكورة بالفعل مثل انخفاض حرارة الجسم بسبب أوقات التشغيل الطويلة والحصير التدفئة المفقودة ، ونخر الأمعاء أو انسداد عن طريق وضع غير فسيفيس في الأمعاء ، يمثل زمن الأطراف المعيقة مضاعفات أخرى ، والتي يمكن الوقاية منها عن طريق لقط الأوعية الدموية الصادمة والتنظيف الشامل لـ anastomoses لتجنب الانسداد المحيطي28،29.
رباط الأوردة الرئوية والكهفية ومضاعفات النزيف
من أجل تقليل وقت نقص التروية الدافئ ، نستخدم رباطًا واحدًا لكل من الأوردة الرئوية الأربعة. كتعقيد محتمل ناتج عن وضع قريب /ventral للرباط ، يجب ذكر اضطراب التدفق الخلفي الوريدي عن طريق انسداد الشريان التاجي الجيوب الأنفية. في حالة حدوث نزيف حاد بعد إزالة المشبك كولي والضرب المرئي للكسب غير المشروع ، يجب التحقق من الرباط للتأكد من عدم كفاية على الفور. لاحظنا هذا النوع من المضاعفات خاصة إذا تم إجراء تشريح الأوردة الرئوية بالقرب من الرباط أثناء إزالة الكسب غير المشروع من التجويف الصدري. خلاف ذلك ، يحدث النزيف الحاد بشكل رئيسي بسبب عدم كفاية الأنستوموس الوعائي. بالإضافة إلى ذلك، يوصف الشريان التاجي الذي يمتد على طول الشريان الأورطا الصاعد الذي غالبا ً ما يتم قطعه أثناء المزرعة السابقة يسبب نزيفًا قاتلًا عند الاستئصال27.
نقص التروية الوقت والتروية
بغض النظر عن نموذج زرع، فإنه لا غنى دائما للحد من وقت نقص التروية، لا سيما وأن القلب يعتبر كجهاز ضعيف فيما يتعلق بتلف نقص التروية. من خلال إجراء عملية جراحية مع اثنين من الجراحين ، ونحن قادرون على تحقيق الحد الأدنى من الوقت الزتروي الدافئ والبارد ، وبالتالي التخلي عن استخدام حلول القلب والبلى من أجل الحد من تلف الإقفارية وإعادة التروية30. عموما، وانتفاخ الكسب غير المشروع يلعب دورا رئيسيا وضروري لتبريد الكسب غير المشروع وإزالة خلايا الدم، والتي يمكن أن تؤدي إلى تجلط الدم أو الانسداد. في حين أن انخفاض ضغط التروية يؤدي إلى عدم كفاية التروية وبالتالي إلى إزالة غير مكتملة لخلايا الدم ، يمكن أن تسبب ضغوط التروية العالية تلفًا في الانهوثيلية31،32. ننصح بتنقية الشريان الرئوي وكذلك الشريان الأورطا الصاعد حتى يتم مسح الشرايين التاجية بشكل واضح.
شق الأوعية المتلقية
خطوة حاسمة في البروتوكول يشكل شق الأوعية المتلقية دون التسبب في ضرر للأوعية الجدار الخلفي: وصف شميد وآخرون فائدة الأبهر أو الفصو ة إجراء شق عرضي صغير يليه توسيع طولي في الاتجاه القحفي والمخروطي ، مما يؤدي إلى انخفاض معدل تضيق الأنستوموسي الأبهري33. في نموذجنا، يتم ثقب الأوعية المتلقية باستخدام قنية صغيرة. بعد ذلك ، يتم توسيع موقع الثقب باستخدام مقص بوتس لإنشاء شق طولي. للحصول على جدوى أفضل ، نوصي بثني طرف القنية إلى زاوية 30-45 درجة مما يؤدي إلى انخفاض خطر إتلاف الجدار الخلفي للأوعية. لم نلاحظ الأنسوع الوعائية ذات الصلة سريريا في أي من المتلقين. وقد وصفت فوائد مماثلة لفتح الأوعية المتلقية عن طريق ثقب أورتا البطن والوريد الوريد السفلي مع قنية من قبل شان وآخرون34.
اتقان نموذج زرع القلب الغيرتوب
خلال العقد الماضي، تم تنفيذ النموذج من قبل الباحثين في القسم مع خلفية جراحية ضئيلة أو معدومة. كما ذكر أعلاه ، فإننا نعمل في أزواج من الجراحين ، في حين أن الباحث الأكثر خبرة هو المسؤول عن ضمان نجاح عملية الزرع وفي نفس التحسين التدريجي لمجموعة مهارات الباحث غير المتمرس. بعد فترة تدريب قصيرة من ما يقرب من عشرة مزارع غير المشروع وزرع في الحيوانات الميتة، الباحث غير الخبرة هو المسؤول عن أداء القلب إكسبلانتيشن والمساعدة في زرع الكسب غير المشروع في ما يقرب من عشرة الحيوانات الحية. في وقت لاحق ، يقوم الباحث غير المحنك بنشاط بإجراء anastomoses الوعائي ، بحيث بعد ما يقرب من عشر عمليات زرع أخرى ، يكون الباحث السابق غير المتمرس قادرًا عادة ً على تنفيذ جميع الخطوات الحرجة للنموذج.
تطبيق هذا المفهوم التدريب، والمنشورات السابقة من قسمنا باستخدام زرع القلب الغيرتوب في الفئران أظهرت أي اختلافات فيما يتعلق بالأمراض والوفيات أو وظيفة الكسب غير المشروع على الرغم من عدة فرق مختلفة من الجراحين13،18،19،20،21،22،23،24.
من الجدير بالذكر أن أداء أنستومموس الوعائي يمثل الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول ونماذج زرع الأعضاء الصلبة بشكل عام. لذلك نوصي بفترات تدريب مطولة باستخدام الحيوانات النافقة حتى يتم إجراء الأناسموسيس دقيقة وسريعة ، خاصة إذا لم يكن الباحث من ذوي الخبرة متاحًا للإرشاد في الحيوانات الحية.
المزايا والعيوب العامة للنموذج
في حين أن تحريض التسامح التلقائي يوصف في كثير من الأحيان بأنه ظاهرة في زراعة الكبد ويلاحظ أيضا في زرع الكلى، ويعتبر القلب كعضو مناعي نوعا ما، وبالتالي تمكن الرفض الموثوق في نماذج زرع35،36. على عكس هذه النتائج، يمكننا أن نلاحظ أيضا البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل وعدم الرفض بعد زرع القلب غير التقذفي في بعض تركيبات المانحة والمتلقية على الرغم من التفاوت الكامل تعقيد التوافق الأنسجة الرئيسية.
انتقاد كثيرا ما ذكر لزرع القلب الهذال هو الذاتية لمراقبة الكسب غير المشروع عن طريق الجس اليدوي. لذلك ، تم توسيع النموذج إلى تقنيات anastomosis الفخذية من أجل تسهيل الوصول إلى الملامسة وإدخال المزيد من تقنيات الرصد مثل تخطيط صدى القلب15،16. من ناحية أخرى، أظهر موترام وآخرون أن مراقبة الكسب غير المشروع عن طريق الملامسة ترتبط بشكل جيد مع قياسات تخطيط القلب الكهربائي37. وهكذا، يبدو التبوّل اليدوي في عمليات زرع القلب الغيرتوب كافية لرصد وظيفة الكسب غير المشروع في نموذج الرفض الحاد.
نتيجة للموضع غير المعترك والتفريغ البطيني الأيسر ، لا يعمل القلب في ظل ظروف تشريحية أو فسيولوجية على افتراض أن هذا لا يؤثر على التحليلات المناعية. خلافا لهذا الافتراض, كان قد ثبت أن إعادة عرض القلب الناتجة عن تفريغ البطين الأيسر خلال البطين الأيسر مساعدة الجهاز العلاج يؤدي إلى انخفاض السايتوكين الإفراج38,39. من ناحية أخرى ، وصف تانغ - كوان وآخرون الإعداد الذي تم تفريغه بأنه نهج أكثر ملاءمة للتحليل المناعي ، حيث لوحظ الضرر النقصي طويل الأجل للكسب غير المشروع الناتج عن التبرّح بالدم المنزوع الأكسجين جزئيًا في النموذج المحملة البطينية اليسرى40.
على الرغم من أن وضع البطن من الطعوم يوفر فوائد جراحية من حيث القابلية للتطبيق العملي ، فمن الصعب حصاد أعداد كافية من الغدد الليمفاوية الرجعية استنزاف على رفض الكسب غير المشروع إضعاف المزيد من التحليلات. لهذا السبب، قدمنا طريقة جديدة للحقن في الأذن من خلايا عضلة القلب المسببة للألم. لم يتم تطبيق هذا المفهوم من الأبحاث الطفيلية للتحليلات المناعية في الزرع ، على الرغم من جدواه41،42. ميزة هذا النموذج هو إمكانية تحديد وحصاد عدد كبير من الغدد الليمفاوية استنزاف، مما يوفر إمكانية إجراء تحليلات المناعة المعقدة. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن الجمع بين كلا النموذجين في أحد المتلقين الذي يقدم المزيد من الرؤى حول آليات الرفض والتسامح في زرع الخلايا والأعضاء في الفئران.
تمثل نماذجنا لزراعة قلب الفئران وخلايا عضلة القلب نهجًا عمليًا ومدروسًا جيدًا ويمكن إجراؤه دون مزيد من التدريب الجراحي أو الخلفية. وفي مواجهة حقيقة أن تكنولوجيات الاستنساخ الجديدة للفئران قد تم إدخالها وتطويرها مؤخراً، توفر هذه النماذج فرصاً هائلة للباحثين في علم المناعة المزروعين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نريد أن نشكر بريتا تراوتفيغ وكورينا لوببرت وإنغريد ميدر على التزامهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F.
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al.
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
