Summary
Vi beskriver en modell av heterotopisk abdominal hjertetransplantasjon hos rotter, noe som innebærer endringer av dagens strategier, noe som fører til en forenklet kirurgisk tilnærming. I tillegg beskriver vi en ny avvisningsmodell ved injeksjon av vitale hjertemuskelceller, slik at ytterligere transplantasjon immunologiske analyser hos rotter.
Abstract
Heterotopiske hjertetransplantasjon hos rotter har vært en vanlig modell for ulike immunologiske studier i mer enn 50 år. Flere modifikasjoner har blitt rapportert siden den første beskrivelsen i 1964. Etter 30 år med å utføre heterotopisk hjertetransplantasjon hos rotter, har vi utviklet en forenklet kirurgisk tilnærming, som lett kan undervises og utføres uten videre kirurgisk trening eller bakgrunn.
Etter disseksjon av den stigende aorta og lungearterien og ligation av overlegne og dårligere caval og lungeårer, blir donorhjertet høstet og deretter gjennomsyret av iskald saltvannsløsning supplert med heparin. Etter klemming og snitting av mottakerens bukkar, blir donoren som stiger opp aorta og lungearterien anastomosert til mottakerenabdominal aorta og dårligere vena cava, henholdsvis ved hjelp av kontinuerlige suturer.
Avhengig av ulike donormottakerkombinasjoner tillater denne modellen analyser av enten akutt eller kronisk avvisning av allografts. Den immunologiske betydningen av denne modellen forsterkes ytterligere av en ny tilnærming til injeksjon i øret av vitale hjertemuskelceller og påfølgende analyse av drenering av cervikal lymfatisk vev.
Introduction
Heterotopiske hjertetransplantasjon er en ofte brukt eksperimentell modell for ulike undersøkelser om transplantasjontoleranse, akutt og kronisk allograft avvisning, iskemi-reperfusjonsskade, maskinperfusjon eller hjerteremodellering. Blant andre fordeler kan graft-funksjonen overvåkes ikke-invasivt ved palpasjon og podesvikt fører ikke til en vital svekkelse av mottakeren i motsetning til andre organer, som nyrer eller lever.
I 1964 beskrev Abbott et al. opprinnelig heterotopisk abdominal hjertetransplantasjon hos rotter1. Senere, i 1966, ble ende-til-side-teknikken for anastomoses beskrevet av Tomita et al.2. Grunnlaget for den brukte modellen ble rapportert av Ono og Lindsey i 19693. I løpet av de siste tiårene har flere modifikasjoner blitt publisert for å skape ulike typer losset, delvis lastet eller lastet venstre ventrikulære hjertetransplantater, inkludert kombinert heterotopisk hjerte-lungetransplantasjon4,5,6. For immunologiske analyser utføres en ikke-volumlastet hjertetransplantasjon oftest. I dette tilfellet kommer blodstrømmen retrogradly inn i donoren stigende aorta og deretter koronararteriene. Venøs drenering skjer langs koronar sinus inn i høyre atrium og ventrikkel (Figur 1A-B). Derfor er venstre ventrikkel utelukket fra blodstrømmen, bortsett fra marginale mengder blod fra thebesiske årer. Dette gjør det også til en nyttig modell for å studere de patofysiologiske mekanismene under venstre ventrikulær hjelpeapparatbehandling7.
Heterotopiske hjertetransplantasjon er utført i ulike arter, inkludert mus, kaniner, griser og har til og med blitt brukt som en uni- eller kikkertrik hjelpeenhet hos mennesker8,,9,10,11. Rotten representerer fortsatt et populært eksperimentelt dyr for transplantasjonsmodeller, spesielt siden graft overlevelsestidene for ulike rottestammekombinasjoner har blitt godt definert tidligere, og et stort antall immunologiske reagenser er tilgjengelige12,13. I motsetning til mus, rotter er større gjør kirurgi og tilgang til lymfatisk vev for immunologiske analyser mer gjennomførbare12. Videre vil innføringen av kommersiellkloning teknologier hos rotter de siste årene mest sannsynlig føre til en tilbakevendende interesse for eksperimentelle rottemodeller14.
Generelt kan heterotopiske hjertetransplantater festes til mottakerkarene enten ved å utføre cervical eller abdominal anastomose. Noen studier tyder imidlertid på at en femoral anastomose letter forbedret overvåking på grunn av bedre tilgang for manuell palpasjon eller transfemoral ekkokardiografi og dermed tillater en mer presis påvisning av graft svikt15,16.
Det har vist seg at det ikke er noen forskjell angående driftstid, komplikasjonshastighet, utfall og pode overlevelsestid mellom begge anastomoseteknikker17. Klart, tilgjengeligheten av et tilstrekkelig antall drenering lymfeknuter må nevnes som en fordel for cervical anastomose; Lengre treningsperioder kreves imidlertid. I motsetning er abdominal anastomose mindre komplisert og like verdifull for immunologiske undersøkelser, spesielt når kombinert med resultater fra en ny metode for in-ear injeksjon av allogen hjertemuskelceller og påfølgende cervical lymphadenectomy. En kombinasjon av begge modellene tilbyr et bredt spekter av post-intervensjonsimmunologiske analyser.
Følgende protokoll refererer til drift i par kirurger for å redusere iskemitid. Alle eksperimenter kan imidlertid utføres av en enkelt person. Oppsettet av instrumenter og materialer for hjerteexplantation og implantasjon vises i figur 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreopplevelser er utført i henhold til retningslinjene fra det lokale etikkdyreutvalget i de regionale myndighetene for forbrukervern og matsikkerhet i Niedersachsen (LAVES, Oldenburg, Tyskland) med godkjennings-ID-ene 12/0768 og 17/2472.
1. Hjerte explantation og perfusjon
MERK: Da graftdonorer ble det brukt hunn- eller hannrotter i en alder av 7-22 uker.
- Bedøve donorrotten ved induktinføring av isofluran (induksjon ved 5 % og vedlikehold ved 3 % med en O2-strøm på 1 l/min). Injiser 5 mg Carprofen subkutant per kg kroppsvekt for perioperativ analgesi og se etter fravær av tåklemmingsrefleksen.
- Påfør øyesmøremiddel et og fjerne mage- og thoraxpelsen ved hjelp av en mekanisk klipper.
- Plasser donoren i en supine posisjon, fest lemmer ved foten av operasjonsbordet med elastiske bånd og steriliser huden med 70% etanol eller et annet tilstrekkelig alternativ.
- Øk huden i langsgående retning og etter påføring av lokalbedøvelse (f.eks. lidokain 0,2 %) utføre en median lapatokomi ved hjelp av saks.
- Sett inn retraktorer, mobiliser tarmen til venstre for donoren, og utsett den dårligere vena cava med steriliserte bomullspinner.
- For antikoagulasjon injiserer du 500 I.U. av heparin oppløst i 1 ml iskald isotonisk saltvannsløsning intravenøst ved å punktere den dårligere vena cava. Stopp blødningen på punkteringsstedet ved lyskompresjon med en bomullspinne etter tilbaketrekking av nålen (figur 3A).
- Inkismembranen og utfør lateral thoracotomy til begge sider av donoren.
- Fest den mobiliserte ventralveggen på thoraxen på operasjonsbordet.
- Fjern perikardiet og vagalnerven ved sløv forberedelse ved hjelp av to mikronålholdere.
- Utfør transseksjon av bukkar for å ekssanguinate donor og losse hjertet.
- Sett den stumpe grenen av en sonde spiss saks inn i transvers perikardial sinus og skille stigende aorta og lungearterien så distale som mulig under lys caudal trekkraft av hjertet med en fuktet komprimering (Figur 3B).
- Plasser en enkelt 5-0 ligatur rundt den overlegne og dårligere vena cava og lungevenene og stram den så dorsal som mulig (Figur 3C).
- Sever vevsdorsal til ligaturen og trekk ut hjertet (figur 3D).
- Perfuse det utplantede hjertet med en 18 G kanyle fra et intravenøst kateter gjennom stigende aorta og lungearterien med 30 ml iskald, isotonesaltvannsløsning supplert med 1000 I.U. heparin og plasser hjertet i et 15 ml rør fylt med saltvannsløsning på is(figur 3E-F).
2. Hjerteimplantasjon
MERK: Som mottakere ble det brukt 10-14 uker gamle hunn- eller hannrotter. Donorer og mottakere var omtrent vekttilpasset.
- Utfør anestesi av mottakerrotten ved også bruk av inhalasjon (induksjon ved 5 % og vedlikehold ved 1,5-2 % med en O2-strøm på 1 l/min). Injiser 5 mg Carprofen subkutant per kg kroppsvekt for perioperativ analgesi og se etter fravær av tåklemmingsrefleksen.
- Påfør øyesmøremiddel, fjern bukpelsen, fest lemmer og steriliser huden analogt med donorpreparatet. For optimalt postoperativt utfall, utfør operasjonen på en varmematte for å forhindre intraoperativ hypotermi.
- Etter langsgående snitt i huden, bruk en lokal bedøvelse, som lidokain (0,2%), på abdominal fascia. Åpne bukhulen ved median laparotomy og sett inn retraktorer.
- Mobiliser tarmen til øvre venstre side av mottakeren og legg den i en varm, fuktet komprimering.
- Etter å ha mobilisert tolvfingertarmen og proksimal jejunum, henholdsvis ved hjelp av det kirurgiske mikroskopet (eller forstørrelsesbriller) med en 5-7x forstørrelse, utsett abdominal aorta og dårligere vena cava ved stump forberedelse med bomullspinner. Ikke skill bukkarene.
- Løft bukkarene ved hjelp av to mikronåleholdere uten å skade lumbale vener og plasser Cooley vaskulær klemme (Figur 4A).
- Punktere bukkarene med en 30-45° buet 27 G kanyle (Figur 4B).
- Forstørre punkteringsstedet ved hjelp av Potts saks for å skape et langsgående snitt som samsvarer med størrelsen på lumen på donorfartøyene (Figur 4C-D)og perfuse mottakerkarene med saltvannsoppløsning for å fjerne blodpropper og forhindre postoperativ trombose.
- Plasser transplantatet i situs og fikser donoren stigende aorta til mottakeren abdominal aorta med to enkle avbrutte masker (8-0 monofilament ikke-resorbable sutur) på kranial og caudal hjørne av langsgående snitt (Figur 4E).
- Anastomose den stigende aorta av donor med abdominal aorta av mottakeren av en løpende 8-0 monofilament sutur i to trinn: først plassere grafttil høyre for mottakerfartøyene og utføre første halvdel av anastomose (Figur 4E). Deretter plasserer du transplantatet til venstre for mottakerfartøyene og utfører andre halvdel av anastomose (figur 4F).
- Fikser donorlungearterien til dårligere vena cava analogt med aortal anastomose (8-0 monofilament ikke-resorbable sutur). Sutur første halvdel av venøs anastomose fra den intraluminale siden av fartøyet (Figur 4G-H).
- Skyll anastosene med saltvann direkte før du strammer knutene for å forhindre perifer emboli.
- Plasser en hemostatisk gasbind rundt begge anastomoses og forsiktig frigjøre Cooley vaskulær klemme slik at reperfusjon av graftet kan begynne. Håndter blødninglangs anastosene ved lyskompresjon med steriliserte bomullspinner.
MERK: Transplantatet skal begynne å slå etter rundt 60 s. - Erstatt tarmen på en meander som mote. Pass på at det ikke er noen misrotasjoner av den mesenteriske radixen for å forhindre intestinal nekrose eller mekanisk obstruksjon.
- Lukk magemusklene/fascia og huden separat ved hjelp av kontinuerlige 3-0 polyfilament kjører suturer.
3. Postoperativ behandling
- For postoperativ analgesi, forsyne mottakerne med en ekstra subkutan injeksjon på 5 mg Carprofen per kg kroppsvekt på den første postoperative dagen (POD). I tillegg tilsett 1 g metamizol til 500 ml drikkevann til den tredje POD.
- Begynn å overvåke hjertetransplantatfunksjonen ved daglig abdominal palpasjon på den tredje POD.
MERK: Ved podefeil før den tredje POD, bør en kirurgisk i stedet for en immunologisk svikt vurderes. Dette avhenger imidlertid av den valgte stammekombinasjonen og den respektive immunologiske modellen (f.eks. hyperakutt avvisning etter tidligere immunisering). - Etter graft avvisning, ekstrahert vev som drenering retroperitoneal lymfeknuter kranie av anastosene, milten, blodet, thymus og pode for ytterligere immunologiske analyser via flyt cytometri eller immunohistochemistry.
4. Enzymatisk fordøyelse av hjertet og subkutan injeksjon av hjerteceller i øret
- Utfør hjerteeksplantation og perfusjon analogt med heterotopisk hjertetransplantasjon (se trinn 1).
- Makuler hjertet i 3 mm x 3 mm blokker ved hjelp av en steril skalpell eller steril saks og inkuber det i 30 min ved 37 °C i kulturmedium som inneholder 0,5 mg/ml kollagennase.
MERK: Det er viktig å bruke kulturmedium som inneholder penicillin, streptomycin og glutamin uten fosterkalvserum (FCS), spesielt ettersom FCS hemmer kollagennasefordøyelsen. - Legg det fordøyde vevet til en storpored sil, mens du fjerner kulturmediet og hakker grundig for å få en suspensjon av vitale hjertemuskelceller, for det meste døde enkelthjerteceller og gjenværende blodceller. Vask cellesuspensjonen to ganger med steril isotonisk saltvannsløsning.
MERK: Sentrifugeringsinnstillinger: 10 min, 200 x g, 20 °C - Filtrer suspensjonen ved hjelp av en 40 μm cellesil og samle vitale cellecongeries ved å skylle cellesilen med 5-10 ml isotonisk saltvannsløsning.
- Etter sentrifugering, resuspender hjertemuskelcellene i saltvannsoppløsning oppløst ved en konsentrasjon på 5x105 celler /ml og trekk celleoppløsningen opp i en 1 ml sprøyte.
- Utfør anestesi analogt med protokollen som er beskrevet for mottakerens narkose (se trinn 2) for heterotopisk hjertetransplantasjon.
- Plasser mottakeren i sidestilling og fest øret med en finger ved hjelp av dobbeltsidig tape (Figur 5A).
- Injiser 20 μL av hjertemuskelcelleoppløsningen (som inneholder 1 x 104 celler) via en 27 G kanyle s.c. nær de visuelle kapillærkarene i mottakerens øre (figur 5B).
- Etter en definert observasjonsperiode (avhengig av den valgte stammekombinasjonen og styrken av avvisning), trekker du ut de drenerende cervikale lymfeknutene og utfører ytterligere analyser som flow cytometri eller kokulturer (figur 5C).
MERK: Videre kan histologisk analyse av pinna utføres for å bestemme celleinfiltrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere har ulike immunologiske problemer blitt adressert på grunnlag av modellen, som ble validert i arbeidsgruppen av mer enn 500 transplantasjoner med en overlevelsesrate på mer enn 95%13,18,19,20,21,22,23,24. Totale driftstider (inkludert graft explantation og implantasjon) vanligvis ikke overstiger 60 minutter, mens kombinert kaldt og varmt iskemi ganger var rundt 30 minutter. Stammekombinasjonene som ble brukt var hovedsakelig basert på Lewis (Lew) bakgrunn. Syngenske transplantasjoner overlevde opptil 100 dager uten tegn på podesvikt, men betydelig vekt- og størrelsesreduksjon på graft explantation. Senest utførte vi heterotopisk hjertetransplantasjon i to forskjellige donor-mottaker kombinasjoner simulere en rask og en langvarig avvisning modell: Lew.1a → Lew wt fører til rask avvisning (gjennomsnittlig overlevelse tid på 7,4 dager) og Lew.1u-7B→ Lew.1a fører til en mer langvarig avvisning (gjennomsnittlig overlevelse tid på 42,5 dager) (Figur 6). Makroskopisk viste de avviste transplantatene en trombose ledsaget av en livid misfarging og hevelse, mens ikke-avviste grafts viser distinkt atrofi, mest sannsynlig som følge av en losset venstre ventrikkel. Videre utarbeidet vi kryostat deler av transplanterte hjerter for å oppdage celleinfiltrasjon ved hjelp av en alkalisk fosfatase-antialkalisk fosfatase (APAAP) farging metode. Enkeltrammer med en 50x forstørrelse ble slått sammen til ett sammensatt bilde, noe som gir en oversikt over hele transplantatet og fordelingen av infiltrerende celler. Histologiske analyser viste en økt infiltrasjon av (f.eks. CD4+, TCR+, eller NKR-P1A/B+) immunceller i de allogene transplantatene, mens synletransplantater i stor grad var fri for celleinfiltrasjon (Figur 7A-C).
Cervikal lymphadeneektomi og restimuleringsanalyser av drenering av lymfeknuteceller etter injeksjon av hjertemuskelceller i ovennevnte belastningskombinasjoner viste tydelige belastningsspesifikke immunresponser mot allogen hjertevev og tillot ytterligere immunologiske analyser, som cytokinprofilering (figur 8A-C).
Figur 1: Skjematisk presentasjon av ende-til-side-anastomos og den resulterende blodstrømmen gjennom hjertet. Etter anastomosing donor stigende aorta ende-til-side til mottakeren abdominal aorta og analogt lungearterien til mottakeren dårligere vena cava (A), blodstrømkommer koronararteriene via stigende aorta. Venøs drenering oppstår via sinuscoronarius inn i høyre atrium og ventrikkel og gjennom lungearterien inn i mottakeren dårligere vena cava (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nødvendige kirurgiske instrumenter og materialer. (A) Explantation: 1: elastisk lem bånd, 2: retractors, 3: 5-0 ligatur, 4: sonde spiss saks, 5-6: mikro nåle holdere, 7: saks, 8: kirurgisktang, 9: mikro tang, 10: øyesmøremiddel, 11: komprimerer, 12: bomull vattpinner, 13: perfusjon base, 14: saltvannløsning på is. (B) Implantasjon: 1: elastisk lembånd, 2: retractors, 5-6: mikro nåleholdere, 7: saks, 8: tang, 9: mikrotang, 10: øyesmøremiddel, 11: komprimerer, 12: bomullspinner, 15: mikrosaks, 16: mikrotang, 17: Pottsaks, 18: nålholder, 19: buet kanyle, 20: Cooley vaskulær klemme, 21: 8-0 monofilament suturer, 22: hemostatisk gasbind, 23: 3-0 polyfilament suturer, 24: Petriskål, 25: Carprofen (5 mg/ml), 26: lokalbedøvelse (lidokain 0,2%), 27: saltvannsløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hjerteexplantation. Etter heparinisering (A) utføres thorakokki og stigende aorta og lungearterien er kuttet så distale som mulig (B). Med en enkelt ligatur lunge og begge caval årer er okkludert (C) og hjertet er fjernet fra thorax hulrom (D). (E) viser hjertet før og (F) etter perfusjon med 30 ml saltvannsoppløsning som inneholder heparin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hjerteimplantasjon. Etter utstilling av bukkar og plassering av en Cooley vaskulær klemme (A) karene er kanylert (B) og en langsgående snitt utføres ved hjelp av Potts saks (C-D). Donoren som stiger opp aorta er fiksert med en knute hver på kranial og caudal hjørne av snittet av mottakeren abdominal aorta (E) og anastomose utføres ved kontinuerlig kjører suturer (E-F). Legg merke til at transplantatet er plassert på høyre side av fartøyene i første halvdel av anastomose (E)og på venstre side av fartøyene i andre halvdel av anastomose (F) og den påfølgende venøse anastomose. Første halvdel av venøs anastomose utføres av en intraluminal sutur (G). Etter å ha fullført andre halvdel av venøs anastomose, er transplantatet klart for reperfusjon (H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Injeksjon i øret av allogene hjertemuskelceller. Etter å ha festet mottakerens øre på en finger ved hjelp av dobbeltsidig tape (A) er allogen vitale hjertemuskelceller injisert subkutant nær visuelle kapillærfartøy (B). Etter en observasjonsperiode som drenerer cervikale lymfeknuter (*) ekstraheres (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Hjerteoverlevelse i forskjellige synniske og allogene donormottakerkombinasjoner. Kaplan-Meier-analysen viser overlevelsen av syngenic (n= 10 rask avvisningsmodell; n = 5 langvarig avvisningsmodell) og allogen grafts (n = 11 rask avvisningsmodell; n = 14 langvarig avvisningsmodell). I den langvarige avvisningsmodellen nådde seks av 14 mottakere slutten av observasjonsperioden (60 dager) uten podefeil, noe som førte til en langvarig podeoverlevelse i denne gruppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Histologisk analyse av syngenske og allogene hjertetransplantater. (A-B) viser infiltrasjon av CD4+ celler ved hjelp av APAAP farging metoden i en syngenic graft (A) og en allogen graft ved avvisning (B). (C) presenterer økningen av celleinfiltrasjon i allogen grafts sammenlignet med syngenic grafts (fungerer som referansegruppe) for ulike immuncelleundergrupper. Klassifiseringen som ble brukt på kvantifisering av celleinfiltrasjon ble modifisert fra Hirschburger et al.25: 0 = infiltrasjon som kan sammenlignes med syngenic grafts; 0,5 = liten økning av fargede celler i isolerte vevsseksjoner; 1 = økning av entallfargede celler over hele vevsseksjonen; 1.5 = økning av beistecelleklynger jevnt fordelt over hele vevsdelen; 2 = sterk; 2,5 = veldig sterk; 3 = sterkeste økning av beistecelleklynger i hele vevsdelen. De histologiske delene av transplantatene ble analysert ved hjelp av en 50x forstørrelse. Fem grafts per gruppe (henholdsvis syngenic og allogenic) ble inkludert i analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Analyse av drenering av lymfeknuteceller etter injeksjon av allogene hjertemuskelceller. Spesifikk restimulering (med 2 x 105 splenocytter av den respektive donorstammen) på 2 x 105 lymfocytter høstet fra enten drenering av cervikale eller mesenteriske lymfeknuter (LN) av raskt avvisning av Lew wt og langvarig avvisning Lew.1a-mottakere viste signifikant redusert spredning av drenerende lymfeknuteceller hos Lew.1a-mottakere (A), mens proliferativ kapasitet generelt fortsatt var observerbar etter uspesifikk stimulering med CD3/CD28 antistoff (B). Overraskende, cytokin profilering avslørte en økning av inflammatoriske cytokiner i lymfeknuter av langvarigavvisende mottakere (C). Resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM på minst 4 dyr per gruppe. Signifiseres med * for p-verdier ≤ 0,05 og **** for p-verdier ≤ 0,0001. (Dette tallet er endret fra Beetz et al.24). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tidligere beskrevne metoden for heterotopisk hjertetransplantasjon hos rotter er hovedsakelig basert på beskrivelsen av Ono og Lindsey i 19693. Siden da har flere modifikasjoner blitt introdusert i ulike arter som fører til et bredt mangfold av denne modellen. Ved å kombinere flere av disse endringene og introdusere vår egen erfaring som følge av over 30 år med å utføre heterotopisk hjertetransplantasjoner i laboratoriet, skapte vi en mulig kirurgisk tilnærming, som ikke krever lange treningsperioder eller kirurgisk bakgrunn. I det følgende vil vi diskutere generelle begrensninger i denne modellen og understreke kritiske trinn i protokollen. Videre vil vi understreke fordelene ved å kombinere heterotopisk hjertetransplantasjon med en ny metode for in-ear injeksjon av hjertemuskelceller.
Anestesi og generelle komplikasjoner
Selv om det har blitt rapportert at isoflurananestesi er bedre enn injeksjonanestesi om tidlig overlevelse etter heterotopisk hjertetransplantasjon, representerer intraoperativ respirasjonsdepresjon fortsatt en av de vanligste komplikasjonene og krever dermed en forsiktig narkosebehandling26. I stedet for henholdsvis seritret graft explantation og implantasjon, anbefaler vi å begynne utarbeidelsen av mottakeren og bukkarene umiddelbart etter thoracotomy av donordyret, spesielt fordi operasjonstider på mindre enn en time er forbundet med et bedre resultat angående graft og mottakeroverlevelse26,27. Foruten allerede nevnt komplikasjoner som hypotermi på grunn av lange driftstider og manglende oppvarmingmatter, og intestinal nekrose eller obstruksjon ved ufysiologisk plassering av tarmen, representerer en parese av hinderlemmer en ytterligere komplikasjon, som kan forebygges av atraumatisk vaskulær klemming og grundig spyling av anastomos for å unngå perifer emboli28,29.
Ligatur av lunge- og cavalårer og blødningskomplikasjoner
For å redusere varm iskemitid, bruker vi en enkelt ligatur for både caval og alle fire lungeårer. Som en mulig komplikasjon som følge av en for proksimal/ ventral plassering av ligaturen, må forstyrrelsen av venøs tilbakestrømning ved okklusjon av sinuscoronarius nevnes. Ved alvorlig blødning etter fjerning av Cooley-klemmen og synlig juling av transplantatet, må ligaturen kontrolleres umiddelbart. Vi observerte denne typen komplikasjon, spesielt hvis disseksjon en lungeårer ble utført for nær ligaturen mens du fjerner transplantatet fra thoraxhulen. Ellers er alvorlig blødning hovedsakelig forårsaket av insuffisiens av vaskulære anastoser. I tillegg er en koronararterie som går langs stigende aorta som ofte kuttes under explantation beskrevet for å forårsake dødelig blødning ved reperfusjon27.
Iskemi tid og perfusjon
Uavhengig av transplantasjonsmodellen er det alltid uunnværlig å redusere iskemitid, spesielt ettersom hjertet betraktes som et sårbart organ angående iskemiskade. Ved å utføre kirurgi med to kirurger, er vi i stand til å oppnå et minimum varm og kald iskemisk tid og derfor gi avkall på bruk av kardioplegiske løsninger for å redusere iskemi-reperfusjonsskade30. Vanligvis spiller perfusjon av transplantatet en nøkkelrolle og er viktig for å kjøle ned transplantatet og fjerne blodceller, noe som kan resultere i trombose eller emboli. Mens lavt perfusjonstrykk fører til utilstrekkelig perfusjon og dermed til en ufullstendig fjerning av blodceller, kan høyt perfusjonstrykk forårsake endotelskade31,32. Vi anbefaler perfusjon av pulmonal arterien samt stigende aorta til koronararteriene er synlig spylt klart.
Snitt av mottakerfartøy
Et kritisk skritt i protokollen utgjør snittet på mottakerfartøyene uten å forårsake skade på fartøyenes bakre vegg: Schmid et al. beskrev fordelen av aortomy eller venotomy utføre en liten tverrgående snitt etterfulgt av langsgående utvidelse i kranial og caudal retning, noe som ytterligere fører til en redusert stenose rate av aortal anastomosis33. I vår modell punkteres mottakerfartøyene ved hjelp av en liten kanyle. Etterpå forstørres punkteringsstedet ved hjelp av Potts saks for å skape et langsgående snitt. For en bedre gjennomførbarhet anbefaler vi at du bøyer kanylens spiss til en vinkel på 30-45° som fører til redusert risiko for å skade fartøyenes bakre vegg. Vi observerte ikke klinisk relevante vaskulære stenoses hos noen av våre mottakere. Lignende fordeler ved å åpne mottakerfartøy ved å punktere abdominal aorta og dårligere vena cava med kanyle har blitt beskrevet av Shan et al.34.
Mestring av modellen av heterotoponihjertetransplantasjon
I løpet av det siste tiåret har modellen blitt utført av forskere i avdelingen med liten eller ingen kirurgisk bakgrunn. Som nevnt ovenfor opererer vi i par kirurger, mens den mer erfarne forskeren har ansvaret for å garantere suksessen til transplantasjonen og samtidig forbedre ferdighetssettet til den uerfarne forskeren. Etter en kort treningsperiode på omtrent ti podeeksplantasjer og implantasjoner hos døde dyr, er den uerfarne forskeren ansvarlig for å utføre hjerteeksplantasjen og bistå podeimplantasjonen hos omtrent ti levende dyr. Deretter utfører den uerfarne forskeren aktivt vaskulære anastomos, slik at etter omtrent ti ytterligere transplantasjoner, er den tidligere uerfarne forskeren vanligvis i stand til å utføre alle kritiske trinn av modellen.
Ved bruk av dette opplæringskonseptet viste tidligere publikasjoner fra vår avdeling ved hjelp av heterotopisk hjertetransplantasjon hos rotter ingen forskjeller angående sykelighet, dødelighet eller podefunksjon til tross for flere forskjellige team av kirurger13,,18,19,20,21,22,23,24.
Av notatet representerer utførelse av vaskulære anastomos det mest kritiske trinnet i denne protokollen og solide organtransplantasjonsmodeller generelt. Vi anbefaler derfor lengre treningsperioder ved hjelp av døde dyr til anastomoser utføres nøyaktig og raskt, spesielt hvis en erfaren forsker ikke er tilgjengelig for veiledning hos levende dyr.
Generelle fordeler og ulemper med modellen
Mens spontan toleranse induksjon er ofte beskrevet som et fenomen i levertransplantasjon og også observert i nyretransplantasjon, hjertet anses som et ganske immungenorgan og dermed muliggjør pålitelig avvisning i transplantasjon modeller35,36. I motsetning til disse funnene, kan vi også legge merke til langsiktig overlevelse og fravær av avvisning etter heterotopisk hjertetransplantasjon i visse donor-mottaker kombinasjoner til tross for fullstendig store histokompatibilitet kompleks ulikhet.
En ofte nevnt kritikk av heterotopisk hjertetransplantasjon er subjektiviteten av podeovervåking ved manuell palpasjon. Derfor har modellen blitt utvidet til femoral anastomose teknikker for å lette tilgangen for palpasjon og innføre ytterligere overvåkingsteknikker som transfemoral ekkokardiografi15,16. På den annen side viste Mottram et al. at overvåkingen av transplantatet via palpasjon korrelerer godt med elektrokardiografiske målinger37. Dermed synes manuell palpasjon i heterotopiske hjertetransplantasjoner tilstrekkelig for overvåking av graft-funksjonen i en akutt avvisningsmodell.
Som en konsekvens av heterotopisk plassering og venstre ventrikulær lossing, fungerer hjertet ikke under anatomiske eller fysiologiske forhold forutsatt at dette ikke påvirker immunologiske analyser. I motsetning til denne antagelsen, det hadde vist seg at hjerte remodeling som følge av venstre ventrikkel lossing under venstre ventrikulær hjelpe apparat terapi fører til en redusert cytokin utgivelse38,39. På den annen side beskrev Tang-Quan et al. den lossede innstillingen som en mer hensiktsmessig tilnærming til immunologisk analyse, siden langvarig iskemisk skade på transplantatet som følge av perfusjon med delvis deoksygenert blod i venstre ventrikulær lastet modell ble observert40.
Selv om abdominal plassering av grafts tilbyr kirurgiske fordeler i form av praktisk, er det vanskelig å høste tilstrekkelig antall drenering retroperitoneal lymfeknuter ved graft avvisning svekke ytterligere analyser. Av denne grunn introduserte vi en ny metode for in-ear injeksjon av allogene hjertemuskelceller. Med opprinnelse fra parasitologisk forskning, har dette konseptet ikke blitt brukt til immunologiske analyser i transplantasjon, til tross for sin gjennomførbarhet41,42. Fordelen med denne modellen er muligheten for å identifisere og høste et betydelig antall dreneringlymfeknuter, noe som gir mulighet for å utføre komplekse immunologiske analyser. Merk at begge modellene kan kombineres i en mottaker som gir ytterligere innsikt i mekanismene for avvisning og toleranse i celle- og organtransplantasjon hos rotter.
Våre modeller av rottehjerte og hjertemuskelcelletransplantasjon representerer en praktisk og godt studert tilnærming og kan utføres uten videre kirurgisk trening eller bakgrunn. Overfor det faktum at nye kloning teknologier for rotter har blitt introdusert og utviklet nylig, disse modellene tilbyr store muligheter for transplantasjon immunologiske forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Britta Trautewig, Corinna Löbbert og Ingrid Meder for deres engasjement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F. Heart homotransplantation in the rat. Sapporo igaku zasshi. The Sapporo Medical Journal. 30 (4), 165-183 (1966).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), 238 (2007).
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al. Mechanisms of liver-induced tolerance. Current Opinion in Organ Transplantation. 22 (1), 71-78 (2017).
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
