Summary
Sıçanlarda heterotopik karın kalp transplantasyonunun bir modelini açıklayarak, basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşıma yol açan mevcut stratejilerde değişiklik ima ediyoruz. Ayrıca, hayati kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyonu ile yeni bir ret modeli tarif, sıçanlarda daha fazla nakil immünolojik analizler sağlayan.
Abstract
Sıçanlarda heterotopik kalp nakli 50 yılı aşkın bir süredir çeşitli immünolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir model olmuştur. 1964'teki ilk açıklamadan bu yana çeşitli değişiklikler bildirilmiştir. Sıçanlarda heterotopik kalp naklinin 30 yıl sonra, daha ileri cerrahi eğitim veya arka plan olmadan kolayca öğretilebilen ve yapilebilen basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşım geliştirdik.
Artan aort ve pulmoner arter indiksiyonu ve superior ve inferior kaval ve pulmoner venlerin ligasyonundan sonra donör kalp hasat edilir ve daha sonra heparin ile takviye buz gibi tuzlu çözeltiile perfüzyon. Alıcı karın damarlarının kenetlenme ve kesici haleledilmesinden sonra, aort ve pulmoner arter ilerleyen donör, sürekli çalışan dikişler kullanılarak sırasıyla alıcı abdominal aort ve inferior vena kavaya anastomozlanır.
Farklı donör alıcı kombinasyonlarına bağlı olarak, bu model allogreftlerin akut veya kronik reddinin analizini sağlar. Bu modelin immünolojik önemi daha hayati kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyon ve servikal lenfatik doku drenaj sonraki analizi yeni bir yaklaşım ile geliştirilmiştir.
Introduction
Heterotopik kalp transplantasyonu transplantasyon toleransı, akut ve kronik allogreft ret, iskemi-reperfüzyon yaralanması, makine perfüzyonu veya kardiyak remodelling ile ilgili farklı araştırmalarda sıkça kullanılan deneysel bir modeldir. Diğer avantajların yanı sıra, greft fonksiyonu palpasyon ve greft yetmezliği ile noninvaziv olarak izlenebilir böbrekler veya karaciğer gibi diğer organların aksine alıcının hayati bir bozulmaya yol açmaz.
1964 yılında, Abbott ve ark. başlangıçta sıçanlarda heterotopik karın kalp nakli açıklanan1. Daha sonra, 1966 yılında, anastomozlar için uçtan uca tekniği Tomita ve ark.2tarafından tanımlanmıştır. Şu anda kullanılan model için zemin Ono ve Lindsey tarafından 1969yılında3 bildirilmiştir. Son yıllarda, çeşitli değişiklikler kombine heterotopik kalp-akciğer nakli4dahil olmak üzere boşaltılmış, kısmen yüklü veya yüklü sol ventrikül kalp greftleri farklı oluşturmak için yayınlanmıştır4 ,5,6. İmmünolojik analizler için hacimsiz yüklü kalp grefti transplantasyonu en sık yapılır. Bu durumda, kan akımı retrograd aort ve daha sonra koroner arterler artan donör girer. Venöz drenaj sağ atriyum ve ventrikül içine koroner sinüs boyunca oluşur (Şekil 1A-B). Bu nedenle, sol ventrikül kan akımı dışında, Dışında Thebesian damarlarından kan marjinal miktarda. Bu da sol ventrikül yardımcı cihaz tedavisi sırasında patofizyolojik mekanizmaları incelemek için yararlı bir model yapar7.
Heterotopik kalp nakli fareler, tavşanlar, domuzlar da dahil olmak üzere çeşitli türlerde yapılmıştır ve hatta insanlarda tek veya biventriküler yardımcı cihaz olarak kullanılmıştır8,9,10,11. Sıçan hala organ nakli modelleri için popüler bir deneysel hayvan temsil eder, farklı sıçan suş kombinasyonları için greft sağkalım süreleri geçmişte iyi tanımlanmış ve immünolojik reaktifler çok sayıda erişilebilir beri12,13. Farelerin aksine, sıçanlar daha büyük yapma cerrahi ve immünolojik analizler için lenfatik doku erişimi daha uygulanabilir12. Ayrıca, son yıllarda sıçanlarda ticari klonlama teknolojilerinin tanıtımı büyük olasılıkla deneysel sıçan modelleri yinelenen bir ilgi yol açacaktır14.
Genel olarak, heterotopik kalp greftleri servikal veya abdominal anastomoz yaparak alıcı damarlara bağlanabilir. Ancak, birkaç çalışma femoral anastomoz manuel palpasyon veya transfemoral ekokardiyografi için daha iyi erişim nedeniyle gelişmiş izleme kolaylaştırır ve böylece greft yetmezliği daha kesin bir tespit sağlar öneririz15,16.
Her iki anastomoztekniğiarasında operasyon süresi, komplikasyon oranı, sonuç ve greft sağkalım süresi arasında bir fark olmadığı gösterilmiştir. Açıkçası, drenaj lenf düğümleri yeterli sayıda durumu servikal anastomoz bir yararı olarak belirtilmelidir; ancak, daha uzun eğitim süreleri gereklidir. Buna karşılık, abdominal anastomoz daha az karmaşık ve immünolojik araştırmalar için eşit derecede değerli, özellikle allojenik kalp kası hücrelerinin kulak içi enjeksiyon ve sonraki servikal lenfadenektomi yeni bir yöntem sonuçları ile kombine. Her iki modelin bir kombinasyonu girişim sonrası immünolojik analizler geniş bir yelpazede sunuyor.
Aşağıdaki protokol, iskemi süresini azaltmak için cerrah çiftleri halinde çalışma anlamına gelir. Ancak, tüm deneyler tek bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir. Kalp eksplantasyonu ve implantasyonu için alet ve malzemelerin kurulumu Şekil 2A-B'degösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyimleri, Aşağı Saksonya'nın (LAVES, Oldenburg, Almanya) tüketici koruma ve gıda güvenliği için yerel Etik Hayvan İnceleme Kurulu'nun yönergelerine uygun olarak 12/0768 ve 17/2472 onay lı olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Kalp eksplantasyonu ve perfüzyonu
NOT: Greft donörolarak 7-22 haftalık kadın veya erkek sıçanlar kullanıldı.
- Donör sıçanı isofluran emdirerek anestezi edin (%5'te indüksiyon ve 1 L/dk O2 akışı ile %3'te bakım). Perioperatif analjezi için vücut ağırlığı başına 5 mg Carprofen deri altı enjekte edin ve ayak ucutu yoksunluk refleksinin yokluğunu kontrol edin.
- Göz yağlayıcı uygulayın ve mekanik bir makas kullanarak karın ve torasik kürk çıkarın.
- Bir supine pozisyonda donör yerleştirin, elastik bantları ile operasyon masasının tabanında ekstremite düzeltmek ve% 70 etanol veya başka bir yeterli alternatif ile cildi sterilize.
- Cildi uzunlamasına yönde ve lokal anestezi uygulamasından sonra (örn. lidokain %0,2) makas kullanarak ortanca laparotomi gerçekleştirin.
- Retraktörler takın, donörün solundaki bağırsağı harekete geçirin ve sterilize edilmiş pamuklu bezlerle inferior vena kavayı ortaya çıkarın.
- Antikoagülasyon için, 500 I.U. heparin enjekte 1 mL buz gibi iyotonik tuzlu çözeltisi intravenöz inferior vena kava delinerek çözülmüş. İğnenin geri çekilmesinden sonra pamuklu bir bez le hafif sıkıştırma ile delinme yerindeki kanamayı durdurun(Şekil 3A).
- Diyaframı incise ve donörün her iki tarafına lateral torakotomi yapmak.
- Toraksın harekete geçirilmiş ventral duvarını operasyon masasına sabitle.
- İki mikro iğne tutucu kullanarak künt preparat ile perikard ve vagal sinir çıkarın.
- Donör exsanguinate ve kalp boşaltmak için karın damarlarının trazeksiyon gerçekleştirin.
- Transvers perikardiyal sinüs içine bir sonda sivri makas künt dalı yerleştirin ve ıslak bir kompres ile kalbin hafif kaudal çekiş altında mümkün olduğunca distal olarak artan aort ve pulmoner arter ayrı(Şekil 3B).
- Superior ve inferior vena kava ve pulmoner venlerin etrafına tek bir 5-0 ligatür yerleştirin ve mümkün olduğunca dorsal olarak sıkın(Şekil 3C).
- Doku dorsal'ı ligatüre doğru koparın ve kalbi ayıklayın(Şekil 3D).
- Ekteki kalbe, artan aort ve pulmoner arterden gelen 18 G kanülile, 30 mL buz gibi buz soğuğu, 1000 I.U. heparin ile takviye edilmiş izoton salin çözeltisi ve kalbi tuzlu çözeltiile buz üzerinde doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin(Şekil 3E-F).
2. Kalp implantasyonu
NOT: Alıcı olarak 10-14 haftalık dişi veya erkek sıçanlar kullanılmıştır. Bağışçılar ve alıcılar yaklaşık ağırlık uyumlu idi.
- Isofluran inhalasyonu (%5'te indüksiyon ve 1 L/dk O2 akışı ile %1,5-2 oranında bakım) kullanarak alıcı farenin anestezisini gerçekleştirin. Perioperatif analjezi için vücut ağırlığı başına 5 mg Carprofen deri altı enjekte edin ve ayak ucutu yoksunluk refleksinin yokluğunu kontrol edin.
- Göz yağlayıcı uygulayın, karın kürkkaldırmak, uzuvları düzeltmek ve donör hazırlık benzer şekilde cildi sterilize. Optimal postoperatif sonuç için, intraoperatif hipotermiyi önlemek için bir ısıtma paspas üzerinde operasyon gerçekleştirin.
- Derinin uzunlamasına kesiden sonra abdominal fasyayayayali lidokain (%0.2) gibi lokal anestezi uygulayın. Median laparotomi ile karın boşluğuaçın ve retraktör ler takın.
- Alıcının sol üst tarafına bağırsak seferber ve sıcak, ıslak kompres yerleştirin.
- Duodenum ve proksimal jejunum seferber sonra, sırasıyla, cerrahi mikroskop kullanarak (veya büyüteç gözlük) 5-7x büyütme ile, pamuk lu bez ile künt hazırlık ile abdominal aort ve inferior vena kava maruz. Karın damarlarını ayırmayın.
- Lomber damarları yaralamadan iki mikro iğne tutucukullanarak karın damarlarını yükseltin ve Cooley vasküler kelepçeyi yerleştirin (Şekil 4A).
- 30-45° kemerli 27 G kanül(Şekil 4B)ile karın damarlarını delin.
- Donör damarların lümenbüyüklüğüne(Şekil 4C-D)uyan uzunlamasına bir kesi oluşturmak ve pıhtıları çıkarmak ve postoperatif trombozönlemek için alıcı damarları tuzlu çözelti ile perfüzyon yapmak için Potts makası kullanarak delinme alanını büyütün.
- Grefti situsa yerleştirin ve aort artan donörü alıcı karın aortuna iki basit kesme dikişle sabitle (8-0 monofilament rezorbable sütür) uzunlamasına kesikranial ve kaudal köşesinde(Şekil 4E).
- Anastomoz bir çalışan 8-0 ile alıcının karın aort ile donörün yükselen aort monofilament sütür iki adımda: birincisi, grefti alıcı damarların sağına yerleştirin ve anastomozun ilk yarısını gerçekleştirin (Şekil 4E). Daha sonra, grefti alıcı damarların soluna yerleştirin ve anastomozun ikinci yarısını gerçekleştirin (Şekil 4F).
- Donör pulmoner arteri inferior vena kavasına benzer şekilde aort anastomozuna sabitletirin (8-0 monofilament resüsite edilemeyen sütür). Venöz anastomozun ilk yarısını damar ın intraluminal tarafından diker (Şekil 4G-H).
- Periferik emboli önlemek için düğüm sıkma önce doğrudan tuzlu ile anastomoz flush.
- Hem anastomozların etrafına hemostatik gazlı bez yerleştirin ve greftin reperfüzyonunun başlayabilmesi için Cooley vasküler kelepçeyi dikkatlice bırakın. Sterilize pamuk lu bezler ile hafif sıkıştırma ile anastomozlar boyunca kanama yıkın.
NOT: Greft yaklaşık 60 s sonra dayak başlamalıdır. - Bağırsaklarını moda gibi kıvrımlı bir şekilde değiştirin. Bağırsak nekrozu veya mekanik tıkanıklığı önlemek için mezenterik radiks hiçbir malrotasyonlar olmadığından emin olun.
- Sürekli 3-0 polifilament çalışan dikişleri kullanarak karın kaslarını/fasyayı ve deriyi ayrı ayrı kapatın.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Postoperatif analjezi için, ilk ameliyat sonrası gün vücut ağırlığı kg başına 5 mg Carprofen ek bir deri altı enjeksiyon ile alıcılar tedarik (POD). Ayrıca, üçüncü POD kadar içme suyu 500 mL 1 g Metamizol ekleyin.
- Üçüncü POD'da günlük abdominal palpasyon ile kalp grefti fonksiyonunu izlemeye başlayın.
NOT: Üçüncü POD'dan önce greft yetmezliği olması durumunda immünolojik bir yetmezlik yerine cerrahi bir cerrahi olgu düşünülmelidir. Ancak, bu tabii ki seçilen suş kombinasyonu ve ilgili immünolojik modele bağlıdır (örneğin, önce bağışıklama sonrası hiperakut ret). - Greft reddinden sonra, akan sitometri veya immünohistokimya yoluyla daha fazla immünolojik analiz için anastomozların drenaj retroperitoneal lenf düğümleri, dalak, kan, timus ve greft gibi dokuları ayıklayın.
4. Kalp enzimatik sindirim ve kulakta kalp hücrelerinin deri altı enjeksiyonu
- Heterotopik kalp nakline benzer şekilde kalp eksplantasyonu ve perfüzyon uyguluyor (bkz. adım 1).
- Kalbi steril bir neşter veya steril makas kullanarak 3 mm x 3 mm bloklar halinde parçala ve 0,5 mg/mL kollajenaz içeren kültür ortamında 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Özellikle FCS kollajenaz sindirimi inhibe ederken, fetal baldır serumu (FCS) olmadan penisilin, streptomisin ve glutamin içeren kültür ortamının kullanılması önemlidir. - Büyük gözenekli elek için sindirilmiş doku ekleyin, kültür orta ve iyice hayati kalp kas hücrelerinin bir süspansiyon almak için kıyma kaldırırken, çoğunlukla ölü tek kalp hücreleri ve kalan kan hücreleri. Hücre süspansiyonuna steril isotonik tuzlu solüsyon ile iki kez yıkayın.
NOT: Santrifüj ayarları: 10 dk, 200 x g, 20 °C - Süspansiyonu 40 μm'lik hücresüz kullanarak filtreleyin ve hücre süzgecini 5-10 mL İzotonik tuzlu çözelti ile yıkarak hayati hücre kongerilerini toplayın.
- Santrifüjden sonra, 5x105 hücre/mL konsantrasyonda çözünmüş ve hücre çözeltisini 1 mL şırıngaya doğru çeker.
- Heterotopik kalp nakli için alıcı narkoz için açıklanan protokole benzer anestezi uygulayın (bkz. adım 2).
- Alıcıyı yanal bir konuma yerleştirin ve kulağı çift taraflı bant kullanarak parmakla düzeltin(Şekil 5A).
- 27 G kanül s.c. ile kardiyak kas hücresi solüsyonunun 20 μL'sini (1 x 104 hücre içeren) alıcının kulağına görsel kılcal damarlara yakın bir şekilde enjekte edin(Şekil 5B).
- Tanımlanmış bir gözlem döneminden sonra (seçilen gerinim kombinasyonuna ve ret gücüne bağlı olarak), drenaj lı servikal lenf düğümlerini ayıklayın ve akış sitometrisi veya ko-kültürler gibi daha fazla analiz yapın(Şekil 5C).
NOT: Ayrıca hücre infiltrasyonunu belirlemek için pinnahistolojik analizi yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geçmişte, farklı immünolojik sorunlar model temelinde ele alınmıştır, hangi fazla bir sağkalım oranı ile 500'den fazla organ nakli ile çalışma grubunda doğrulandı13, 1818,,19,20,21,22,23,24. Toplam çalışma süreleri (greft eksplantasyonu ve implantasyonu dahil) genellikle 60 dakikayı geçmezken, kombine soğuk ve sıcak iskemi süreleri 30 dakika civarındaydı. Uygulanan gerinim kombinasyonları esas olarak Lewis (Lew) arka planına dayanıyordu. Singenik nakli greft yetmezliği belirtileri olmadan 100 güne kadar hayatta kaldı, ancak greft eksplantasyonu üzerine önemli ağırlık ve boyut küçültme. En son, heterotopik kalp naklini hızlı ve uzun süreli bir ret modeli simüle eden iki farklı donör-alıcı kombinasyonunda gerçekleştirdik: Lew.1a → Lew wt hızlı reddedilmeye yol açar (ortalama hayatta kalma süresi 7.4 gün) ve Lew.1u-7B→ Lew.1a daha uzun süreli bir ret (ortalama hayatta kalma süresi 42.5 gün)(Şekil 6). Makroskopik olarak, reddedilen greftler mor bir renk değişikliği ve şişlik eşliğinde bir tromboz gösterirken, reddedilmemiş greftler büyük olasılıkla boş bir sol ventrikül sonucu belirgin atrofi ler göstermektedir. Ayrıca, alkalen fosfataz-antialkalin fosfataz (APAAP) boyama yöntemi ile hücre infiltrasyonlarını saptamak için nakledilen kalplerin kriyostat bölümlerini hazırladık. 50x büyütmeli tek çerçeveler tek bir kompozit görüntüyle birleştirilerek, tam greft ve infiltrasyon hücrelerinin dağılımına genel bir bakış verildi. Histolojik analizlerde allojenik greftlerde immün hücrelerin (örneğin CD4+ ,TCR+veya NKR-P1A/B+ )infiltrasyonu artmış, sinjengretler ise hücre infiltrasyonundan arınmıştır(Şekil 7A-C).
Servikal lenfadenektomi ve yukarıda belirtilen suş kombinasyonlarında kalp kası hücrelerinin kulak enjeksiyonu sonra drenaj lenf nodu hücrelerinin yeniden stimülasyon tahlilleri allojenik kardiyak dokuya karşı farklı suş özgü immün yanıtlar ortaya ve daha fazla immünolojik analizler izin, sitokin profilleme gibi(Şekil 8A-C).
Şekil 1: Uçtan uca anastomozların şematik sunumu ve ortaya çıkan kan akışı kalpten geçer. Alıcı abdominal aort ve benzer şekilde alıcı inferior vena kava(A)için aort uç-yan yükselen donör anastomosing sonra , kan akımı artan aort yoluyla koroner arterler girer. Venöz drenaj sağ atriyum ve ventrikül içine sinüs koronerus yoluyla oluşur ve alıcı inferior vena kava içine pulmoner arter yoluyla (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Gerekli cerrahi aletler ve malzemeler. (A) Eksplantasyon: 1: elastik ekstremite bandı, 2: retraktörler, 3: 5-0 ligatür, 4: sonda sivri makas, 5-6: mikro iğne tutucular, 7: makas, 8: cerrahi forseps, 9: mikro forseps, 10: göz yağlayıcı, 11: kompres, 12: pamuk bezleri, 13: perfüzyon tabanı, 14: salin çözeltisi. (B) İmplantasyon: 1: elastik ekstremite bandı, 2: retraktörler, 5-6: mikro iğne tutucular, 7: makas, 8: forceps, 9: mikro forceps, 10: göz yağlayıcı, 11: kompres, 12: pamuk swabs, 15: mikro makas, 16: mikro makas, 17: Potts makas, 18: iğne tutucu, 19: kemerli kanül, 20: Cooley vascular kelepçe, 21: 8-0 monofilament sütür, 22: hemostatik gazlı bez, 23: 3-0 polifilament sütür, 24: Petri kabı, 25: Carprofen (5 mg/mL), 26: lokal anestezik (lidokain %0.2), 27: tuzlu çözelti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kalp eksplantasyonu. Heparinizasyon dan sonra(A),torakotomi yapılır ve artan aort ve pulmoner arter mümkün olduğunca distal olarak kesilir (B). Tek bir ligatür pulmoner ve her iki kavin ile tıkanmış(C) ve kalp torasik kavitenin uzaklaştırılması (D). (E) heparin içeren 30 mL tuzlu çözeltisi ile perfüzyon dan sonra kalbi gösterir ve (F) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kalp implantasyonu. Abdominal damarların sergilenmesine ve Cooley vasküler kelepçenin(A)yerleştirildikten sonra damarlar kannüle edilir (B) ve Potts makası(C-D)kullanılarak uzunlamasına bir kesi yapılır. Aort yükselen donör alıcı abdominal aort insizyon kranial ve kaudal köşesinde her bir düğüm ile sabitlenir (E) ve anastomoz sürekli çalışan dikişler tarafından yapılır(E-F). Greftin anastomozun ilk yarısı için damarların sağ tarafına (E) ve anastomozun ikinci yarısı için damarların sol tarafına (F) ve sonraki venöz anastomoza yerleştirildiğini unutmayın. Venöz anastomozun ilk yarısı intraluminal sütür(G)ile yapılır. Venöz anastomozun ikinci yarısını bitirdikten sonra greft reperfüzyona hazırdır (H). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Allojenik kalp kası hücrelerinin kulak içi enjeksiyonu. Çift taraflı bant(A)allojenik hayati kardiyak kas hücreleri kullanarak bir parmak üzerinde alıcının kulak sabitleme sonra subkutan olarak görme kılcal damarlar yakın enjekte edilir (B). Servikal lenf düğümleri drenaj bir gözlem döneminden sonra (*) ayıklanır (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Farklı sinjenik ve allojenik donör alıcı kombinasyonlarında kalp sağkalımı. Kaplan-Meier analizi sinjenik (n=10 hızlı ret modeli; n=5 uzun süreli ret modeli) ve allojenik greftlerin (n=11 hızlı ret modeli; n=14 uzun süreli ret modeli) sağkalımını göstermektedir. Uzun süreli ret modelinde 14 alıcıdan altısı greft yetmezliği olmadan gözlem süresinin sonuna (60 gün) ulaşarak bu grupta uzun greft sağkalımlarına yol açtı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Sinjenik ve allojenik kalp greftlerinin histolojik analizi. (A-B) bir sinjenik greft(A)ve ret üzerine bir allojenik greft APAAP boyama yöntemi ni kullanarak CD4+ hücrelerin infiltrasyon göstermek (B). (C) farklı immün hücre alt kümeleri için sinjenik greftlere (referans grubu olarak hizmet veren) göre allojenik greftlerde hücre infiltrasyonuartışını gösterir. Hücre infiltrasyonlarını ölçmek için uygulanan sınıflandırma Hirschburger ve ark.25: 0 = sinjenik greftlerle karşılaştırılabilir infiltrasyondan modifiye edilmiştir; 0.5 = izole doku kesitlerinde lekeli hücrelerin hafif artışı; 1 = tüm doku bölümü üzerinde tekil lekeli hücrelerin artış; 1.5 = tüm doku bölümüne eşit olarak dağılmış lekeli hücre kümelerinin artması; 2 = güçlü; 2.5 = çok güçlü; 3 = tüm doku bölümü boyunca lekeli hücre kümelerinin en güçlü artış. Greftlerin histolojik bölümleri 50x büyütme ile analiz edildi. Analize grup başına beş greft (sırasıyla sinjenik ve allojenik) dahil edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Allojenik kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyonu sonrası drenaj lenf nodu hücrelerinin analizi. Spesifik re-stimülasyon (ilgili donör suş 2 x 105 splenositler ile) 2 x 105 lenfositler ya drenaj servikal veya mezenterik lenf düğümleri hasat (LN) hızlı reddeden Lew wt ve uzun süreli reddi Lew.1a alıcılar Lew.1a alıcılar(A)drenaj lenf düğümü hücrelerinin çoğalması önemli ölçüde azaltılmış gösterdi, genel olarak proliferatif kapasite cd3/CD28 antikor ile spesifik uyarılma sonra hala gözlemlenebilir oldu ise(B). Şaşırtıcı bir şekilde, sitokin profilleme uzun süre reddeden alıcıların lenf düğümlerinde inflamatuar sitokinler bir artış ortaya (C). Sonuçlar grup başına en az 4 hayvanın ortalama ± SEM'i olarak sunulmaktadır. Önem p değerleri ≤ 0.05 ve **** için p-değerleri ≤ 0.0001 ile gösterilir. (Bu rakam Beetz ve ark.24'tendeğiştirilmiştir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıçanlarda heterotopik kardiyak transplantasyonun daha önce açıklanan yöntemi esas olarak 1969 yılında Ono veLindsey'intanımına dayanmaktadır 3 . O zamandan beri, çeşitli türlerde çeşitli değişiklikler bu modelin geniş bir çeşitlilik yol açmaktadır. Bu değişikliklerin birçoğunu birleştirerek ve 30 yılı aşkın heterotopik kalp naklinin laboratuvarda yapılmasından kaynaklanan kendi deneyimimizi sunarak, uzun eğitim süreleri veya cerrahi arka plan gerektirmeyen uygulanabilir bir cerrahi yaklaşım oluşturduk. Aşağıda, bu modelin genel sınırlamalarını tartışacağız ve protokolün kritik adımlarının altını çizeceğiz. Ayrıca, heterotopik kalp naklini kalp kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyonu ile yeni bir yöntemle birleştirmenin faydalarını vurgulayacağız.
Anestezi ve genel komplikasyonlar
Isofluran anestezisinin heterotopik kalp nakli sonrası erken sağkalım açısından enjeksiyon anestezisine üstün olduğu bildirilmesine rağmen, intraoperatif solunum depresyonu hala en sık görülen komplikasyonlardan birini temsil eder ve bu nedenle dikkatli bir narkoz yönetimi gerektirir26. Seri greft eksplantasyonu ve implantasyonu yerine, sırasıyla, biz donör hayvan Torakotomi hemen sonra alıcı ve karın damarlarının hazırlanması na sıyrık başlamanızı tavsiye, özellikle bir saatten az ameliyat süreleri greft ve alıcı sağkalım ile ilgili daha iyi bir sonuç ile ilişkili olduğu için26,27. Zaten uzun çalışma süreleri ve eksik ısıtma paspaslar nedeniyle hipotermi gibi bahsedilen komplikasyonlar ın yanı sıra, bağırsak nekrozu veya bağırsak fizyolojik yerleştirme tarafından tıkanıklık, engel uzuvların bir paresis başka bir komplikasyon temsil eder, hangi atravmatik vasküler kenetlenme ve periferik emboli önlemek için anastomozların iyice kızarma önlenebilir.,29
Pulmoner ve kaval venlerin ligatürü ve kanama komplikasyonları
Sıcak iskemi süresini azaltmak için hem kaval hem de dört pulmoner ven için tek bir ligatür kullanırız. Ligaturun çok proksimal/ventral yerleştirilmesinden kaynaklanan olası bir komplikasyon olarak, sinüs korkorokrinin tıkanması ile venöz geri akımın bozulmasından söz edilmelidir. Cooley kelepçesinin çıkarılmasından ve greftin gözle görülür dayak atFEdilmesinden sonra şiddetli kanama durumunda ligatür derhal yetmezlik kontrolü ne kadar dır. Özellikle pulmoner venlerin diseksiyonu torasik kaviteden grefti çıkarırken ligatura çok yakın yapıldıysa bu tip komplikasyonları gözlemledik. Aksi takdirde, şiddetli kanama esas olarak vasküler anastomozların yetersizliğinden kaynaklanır. Ayrıca, genellikle eksplantasyon sırasında kesilir artan aort boyunca çalışan bir koroner arter reperfüzyon üzerine ölümcül kanamaya neden olduğu tarif edilir27.
İskemi süresi ve perfüzyon
Transplantasyon modeli ne olursa olsun, özellikle kalp iskemi hasarı açısından hassas bir organ olarak kabul edilir gibi, iskemi süresini azaltmak için her zaman vazgeçilmezdir. İki cerrah ile ameliyat yaparak, minimum sıcak ve soğuk iskemik zaman elde edebiliyoruz ve bu nedenle iskemi-reperfüzyon hasarı azaltmak için kardiyoplegic çözümlerin kullanımı ndan sonra30. Genel olarak, greft perfüzyon önemli bir rol oynar ve greft soğutmak ve tromboz veya emboli neden olabilir kan hücrelerini kaldırmak için gereklidir. Düşük perfüzyon basınçları yetersiz perfüzyonve böylece kan hücrelerinin eksik kaldırılmasına yol açarken, yüksek perfüzyon basınçları endotel hasarına neden olabilir31,32. Pulmoner arterin yanı sıra artan aortperfüzyonu koroner arterler gözle görülür bir şekilde temizlenene kadar öneriyoruz.
Alıcı gemilerin kesilmesi
Protokoldeki kritik bir adım, alıcı damarların arka duvara zarar vermeden kesilmesini oluşturur: Schmid ve ark. aortomi veya venotominin küçük bir enine kesi gerçekleştirmesinin yararını ve ardından kranial ve kaudal yönde uzunlamasına genişlemeyi takiben, aort alastomozunun stenoz oranının düşmesine yol açmaktadır33. Bizim modelimizde, alıcı damarlar küçük bir kanül kullanılarak delinmiş. Daha sonra, delik site uzunlamasına bir kesi oluşturmak için Potts makas kullanılarak büyütülür. Daha iyi bir fizibilite için, kanun ucunu 30-45° bir açıya bükmenizi öneririz ve bu da damarların arka duvarına zarar verme riskinin azalmasına yol açabilir. Alıcılarımızın hiçbirinde klinik olarak ilgili vasküler stenoses gözlemlemedik. Bir kanül ile karın aort ve inferior vena kava delinerek alıcı damarları n açılması benzer faydaları Shan ve ark.34tarafından tarif edilmiştir .
Heterotopik kalp nakli modelinde ustalaşma
Son on yılda, model çok az veya hiç cerrahi arka plan ile bölümünde araştırmacılar tarafından yapılmıştır. Yukarıda da belirtildiği gibi, biz cerrah çiftleri olarak faaliyet, daha deneyimli araştırmacı transplantasyon başarısını garanti ve aynı zamanda yavaş yavaş deneyimsiz araştırmacı beceri seti geliştirmek sorumlu ise. Ölü hayvanlarda yaklaşık on greft eksplantasyonu ve implantasyonkısa bir eğitim süresinden sonra, deneyimsiz araştırmacı kalp eksplantasyonu gerçekleştirmek ve yaklaşık on canlı hayvanda greft implantasyonuna yardımcı olmakiçin sorumludur. Daha sonra, deneyimsiz araştırmacı aktif vasküler anastomozlar gerçekleştirir, böylece yaklaşık on daha fazla transplantasyon sonra, eski deneyimsiz araştırmacı genellikle modelin tüm kritik adımları gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.
Bu eğitim konseptinin uygulanması, sıçanlarda heterotopik kalp nakli kullanılarak bölümümüzden yapılan geçmiş yayınlarda, cerrahların birkaç farklı takımına rağmen morbidite, mortalite veya greft fonksiyonu ile ilgili hiçbir fark saptanmamagöstermiştir13,18,19,20,21,22,23,24.
Vasküler anastomozların gerçekleştirilmesi bu protokolde ve genel olarak katı organ nakli modellerinde en kritik adımı temsil eder. Bu nedenle, anastomozlar doğru ve hızlı bir şekilde yapılana kadar ölü hayvanları kullanarak uzun süreli eğitim süreleri öneriyoruz, özellikle de deneyimli bir araştırmacı canlı hayvanlarda rehberlik için uygun değilse.
Modelin genel avantajları ve dezavantajları
Spontan tolerans indüksiyonu genellikle karaciğer naklinde bir olgu olarak tanımlanır ve böbrek naklinde de gözlenirken, kalp oldukça immünojenik bir organ olarak kabul edilir ve böylece nakil modellerinde güvenilir reddedilmeyi sağlar35,36. Bu bulguların aksine, tam majör histokompatibilite kompleksinin eşitsizliğine rağmen bazı donör-alıcı kombinasyonlarında heterotopik kalp nakli sonrası uzun süreli sağkalım ve ret yokluğu fark edilebiliyorduk.
Heterotopik kalp naklinin sık lıkla dile getirilmiş bir eleştirisi, el palpasyonu ile greft takibinin öznelliğidir. Bu nedenle, model palpasyon için erişimi kolaylaştırmak ve transfemoral ekokardiyografi 15 ,,16gibi daha fazla15izleme teknikleri tanıtmak için femoral anastomoz teknikleri genişletildi. Öte yandan, Mottram ve ark. pafta yoluyla greft izleme elektrokardiyografik ölçümler ile iyi ilişkili olduğunu gösterdi37. Bu nedenle heterotopik kalp naklinde manuel palpasyon akut ret modelinde greft fonksiyonunun izlenmesi için yeterli görünün.
Heterotopik yerleşim ve sol ventrikül boşaltılması sonucunda kalp, immünolojik analizleri etkilemediği varsayarak anatomik veya fizyolojik koşullar altında çalışmaz. Bu varsayımın aksine, sol ventrikül yardımcı cihaz tedavisi sırasında sol ventrikül boşaltılması sonucu kardiyak remodeling azalmış sitokin salınımına yol açtığı gösterilmiştir38,39. Öte yandan, Tang-Quan ve ark. sol ventrikül yüklü modelde kısmen deoksijenalı kan ile perfüzyon sonucu greft uzun vadeli iskemik hasar gözlenmiştir beri, unloaded ayarı immünolojik analiz için daha uygun bir yaklaşım olarak nitelendirdi40.
Greftlerin abdominal yerleştirilmesi pratiklik açısından cerrahi faydalar sunsa da, greft reddi ile yeterli sayıda retroperitoneal lenf nodu elde etmek zordur. Bu nedenle allojenik kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyonuna yönelik yeni bir yöntem sunduk. Parazitolojik araştırmalardan kaynaklanan bu kavram, fizibilite41,42fizibilitesine rağmen transplantasyonda immünolojik analizler için uygulanmamıştır. Bu modelin avantajı, karmaşık immünolojik analizler gerçekleştirme imkanı sunan önemli sayıda drenaj lenf düğümlerinin tanımlanması ve hasat edilmesidir. Not, her iki model sıçanlarda hücre ve organ nakli reddi ve tolerans mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi sunan tek bir alıcı kombine edilebilir.
Sıçan kalp ve kardiyak kas hücre nakli modellerimiz uygulanabilir ve iyi çalışılmış bir yaklaşımı temsil etmekte ve daha ileri bir cerrahi eğitim veya arka plan olmadan yapılabilir. Fareler için yeni klonlama teknolojilerinin yakın zamanda tanıtıldığı ve geliştirildiği gerçeğiyle yüzleşen bu modeller, nakil immünolojik araştırmacılar için büyük fırsatlar sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Britta Trautewig, Corinna Löbbert ve Ingrid Meder'e bağlılıkları için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F. Heart homotransplantation in the rat. Sapporo igaku zasshi. The Sapporo Medical Journal. 30 (4), 165-183 (1966).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), 238 (2007).
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al. Mechanisms of liver-induced tolerance. Current Opinion in Organ Transplantation. 22 (1), 71-78 (2017).
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
