Summary
We beschrijven een model van heterotopische buikharttransplantatie bij ratten, wat wijzigingen van de huidige strategieën impliceert, die leiden tot een vereenvoudigde chirurgische aanpak. Daarnaast beschrijven we een nieuw afstotingsmodel door in-ear injectie van vitale hartspiercellen, waardoor verdere transplantatie immunologische analyses bij ratten mogelijk zijn.
Abstract
Heterotopische harttransplantatie bij ratten is al meer dan 50 jaar een veelgebruikt model voor diverse immunologische studies. Sinds de eerste beschrijving in 1964 zijn er verschillende wijzigingen gemeld. Na 30 jaar heterotopisch harttransplantatie bij ratten, hebben we een vereenvoudigde chirurgische aanpak ontwikkeld, die gemakkelijk kan worden onderwezen en uitgevoerd zonder verdere chirurgische training of achtergrond.
Na dissectie van de opgaande aorta en de longslagader en ligatie van superieure en inferieure caval en longaders, wordt het donorhart geoogst en vervolgens doordrenkt met ijskoude zoutoplossing aangevuld met heparine. Na het klemmen en insnijden van de ontvangende buikvaten, worden de donor opgaande aorta en longslagader geanastomoseerd naar respectievelijk de ontvangende abdominale aorta en inferieure vena cava, met behulp van continu lopende hechtingen.
Afhankelijk van verschillende combinaties van donor-ontvanger, maakt dit model analyses van acute of chronische afstoting van allografts mogelijk. De immunologische betekenis van dit model wordt verder versterkt door een nieuwe aanpak van in-ear injectie van vitale hartspiercellen en daaropvolgende analyse van drainerend baarmoederhalslymfeweefsel.
Introduction
Heterotopische harttransplantatie is een veelgebruikt experimenteel model voor verschillende onderzoeken naar transplantatietolerantie, acute en chronische allograft-afstoting, ischemie-reperfusieletsel, machineperfusie of cardiale remodellering. Onder andere voordelen, de graft functie kan niet-invasief worden gecontroleerd door palpatie en graft mislukking leidt niet tot een vitale bijzondere waardevermindering van de ontvanger in tegenstelling tot andere organen, zoals nieren of levers.
In 1964 beschreven Abbott et al. aanvankelijk heterotopische buikharttransplantatie bij ratten1. Later, in 1966, werd de end-to-side techniek voor anastomoses beschreven door Tomita et al.2. De basis voor het momenteel gebruikte model werd gemeld door Ono en Lindsey in 19693. In de afgelopen decennia zijn verschillende wijzigingen gepubliceerd om verschillende soorten geloste, gedeeltelijk geladen of geladen linker ventriculaire harttransplantaten te creëren, waaronder gecombineerde heterotopische hart-longtransplantatie4,5,6. Voor immunologische analyses wordt het meest uitgevoerde niet-volumegeladen harttransplantatie uitgevoerd. In dit geval komt de bloedstroom retrogradely in de donor opgaande aorta en vervolgens de kransslagaders. De veneuze drainage vindt plaats langs de coronaire sinus in het rechter atrium en de ventrikel(figuur 1A-B). Daarom is de linker ventrikel uitgesloten van de bloedstroom, afgezien van marginale hoeveelheden bloed uit Thebesian aderen. Dit maakt het ook een nuttig model voor het bestuderen van de pathofysiologische mechanismen tijdens links ventriculaire assist apparaat therapie7.
Heterotopische harttransplantatie is uitgevoerd bij verschillende soorten, waaronder muizen, konijnen, varkens en is zelfs gebruikt als een uni- of biventriculaire hulp apparaat bij de mens8,9,10,11. De rat is nog steeds een populair proefdier voor transplantatiemodellen, vooral omdat de overlevingstijden van de graft voor verschillende rattenspanningscombinaties in het verleden goed zijn gedefinieerd en een groot aantal immunologische reagentia toegankelijk is12,13. In tegenstelling tot muizen, ratten zijn groter maken van chirurgie en de toegang tot lymfeweefsel voor immunologische analyses meer haalbaar12. Bovendien zal de invoering van commerciële kloontechnologieën bij ratten in de afgelopen jaren hoogstwaarschijnlijk leiden tot een terugkerende belangstelling voor experimentele rattenmodellen14.
In het algemeen kunnen heterotopische harttransplantaties aan de ontvangende bloedvaten worden bevestigd door cervicale of abdominale anastomose uit te voeren. Echter, een paar studies suggereren dat een femorale anastomose vergemakkelijkt verbeterde monitoring als gevolg van een betere toegang voor handmatige palpatie of transfemorale echocardiografie en dus maakt een meer nauwkeurige detectie van graft mislukking15,16.
Het is aangetoond dat er geen verschil is met betrekking tot de bewerkingstijd, complicatiesnelheid, uitkomst en graft overlevingstijd tussen beide anastomose technieken17. Het is duidelijk dat de beschikbaarheid van een voldoende aantal drainerende lymfeklieren moet worden genoemd als een voordeel van cervicale anastomose; er zijn echter langere opleidingsperioden nodig. In tegenstelling, de abdominale anastomose is minder ingewikkeld en even waardevol voor immunologische onderzoeken, vooral in combinatie met resultaten van een nieuwe methode van in-ear injectie van allogene hartspiercellen en daaropvolgende cervicale lymfatomie. Een combinatie van beide modellen biedt een breed spectrum van post-interventionele immunologische analyses.
Het volgende protocol verwijst naar het werken in paren van chirurgen om ischemie tijd te verminderen. Alle experimenten kunnen echter door één persoon worden uitgevoerd. De opstelling van instrumenten en materialen voor hartexplantation en implantatie wordt weergegeven in figuur 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle ervaringen met dieren zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van de lokale Ethics Animal Review Board van de regionale autoriteiten voor consumentenbescherming en voedselveiligheid van Nedersaksen (LAVES, Oldenburg, Duitsland) met de goedkeuring sids 12/0768 en 17/2472.
1. Hartexplantation en perfusie
OPMERKING: Als graft donoren, vrouwelijke of mannelijke ratten op een leeftijd van 7-22 weken werden gebruikt.
- Verdoof de donorrat door isofluraaninademing (inductie bij 5% en onderhoud bij 3% met een O2-stroom van 1 L/min). Injecteer 5 mg Carprofen onderhuids per kg lichaamsgewicht voor perioperatieve analgesie en controleer op de afwezigheid van de teenknijpingsreflex.
- Breng oogsmeermiddel aan en verwijder de buik- en borstvacht met behulp van een mechanische tondeuse.
- Plaats de donor in een supine positie, bevestig de ledematen aan de basis van de operatie tafel met elastische banden en steriliseren van de huid met 70% ethanol of een ander voldoende alternatief.
- Ingesneden in de lengterichting en na toediening van lokale verdoving (bijv. lidocaine 0,2%) een mediane laparotomie uit te voeren met behulp van een schaar.
- Voeg oprolmechanismen, mobiliseren van de darm aan de linkerkant van de donor, en bloot de inferieure vena cava met gesteriliseerde wattenstaafjes.
- Voor antistolling, injecteer 500 I.U. van heparine opgelost in 1 mL van ijskoude isotone zoutoplossing intraveneus door het doorboren van de inferieure vena cava. Stop het bloeden op de punctieplaats door lichte compressie met een wattenstaafje na het intrekken van de naald(figuur 3A).
- Insincise er het middenrif en voer laterale thoracotomie uit aan beide zijden van de donor.
- Speld de gemobiliseerde ventrale wand van de thorax op de operatietafel.
- Verwijder het hartzakje en de nervus door botte voorbereiding met behulp van twee micronaaldhouders.
- Voer de transsectie van buikvaten uit om de donor uit te ademen en het hart te lossen.
- Plaats de botte tak van een sonde puntige schaar in de transvers pericardiale sinus en scheid de opgaande aorta en longslagader zo distaal mogelijk onder lichte caudal tractie van het hart met een bevochtigd kompres (Figuur 3B).
- Plaats een enkele 5-0 ligatuur rond de superieure en inferieure vena cava en de longaders en draai deze zo dorsale mogelijk(figuur 3C).
- Doorverbreken van het weefsel rugband aan de ligatuur en extract het hart(figuur 3D).
- Doormantel het verplante hart met een 18 G canule van een intraveneuze katheter door de opgaande aorta en de longslagader met 30 mL ijskoud, isotone zoutoplossing aangevuld met 1000 I.U. van heparine en plaats het hart in een 15 mL buis gevuld met zoutoplossing op ijs (Figuur 3E-F).
2. Hartimplantatie
OPMERKING: Als ontvangers werden 10-14 weken oude vrouwelijke of mannelijke ratten gebruikt. Donoren en ontvangers waren ongeveer gewicht geëvenaard.
- Voer anesthesie van de ontvangende rat uit door ook isoflurane-inademing te gebruiken (inductie bij 5% en onderhoud bij 1,5-2% met een O2-stroom van 1 L/min). Injecteer 5 mg Carprofen onderhuids per kg lichaamsgewicht voor perioperatieve analgesie en controleer op de afwezigheid van de teenknijpingsreflex.
- Breng oogsmeermiddel aan, verwijder de buikvacht, bevestig de ledematen en steriliseer de huid analoog aan het donorpreparaat. Voor een optimaal postoperatief resultaat voert u de bewerking uit op een verwarmingsmat om intraoperatieve onderkoeling te voorkomen.
- Na longitudinale incisie van de huid, breng een lokale verdoving, zoals lidocaine (0,2%), op de buikfascia. Open de buikholte door mediane laparotomie en steek oprolmechanismen in.
- Mobiliseer de darm naar de linkerbovenzijde van de ontvanger en plaats deze in een warme, bevochtigde kompres.
- Na het mobiliseren van de twaalfvingerige darm en proximale jejunum, respectievelijk met behulp van de chirurgische microscoop (of vergrotende bril) met een 5-7x vergroting, bloot de abdominale aorta en inferieure vena cava door botte voorbereiding met wattenstaafjes. Scheid de buikvaten niet.
- Verhoog de buikvaten met behulp van twee micronaaldhouders zonder de lendenaders te verwonden en plaats de Cooley vasculaire klem(figuur 4A).
- Prik de buikvaten met een 30-45° gebogen 27 G canule (Figuur 4B).
- Vergroot de punctieplaats met pottsschaar om een longitudinale incisie te maken die overeenkomt met de grootte van het lumen van de donorvaten (figuur 4C-D) en doorstraal de ontvangende vaten met een zoutoplossing om stolsels te verwijderen en postoperatieve trombose te voorkomen.
- Plaats het transplantaat in de situs en fixer de donor opgaande aorta naar de ontvanger abdominale aorta door twee eenvoudige onderbroken steken (8-0 monofilament niet-resorbable hechting) in de schedel- en staarthoek van de longitudinale incisie (Figuur 4E).
- Anastomose de opgaande aorta van de donor met de abdominale aorta van de ontvanger door een lopende 8-0 monofilamenthechting in twee stappen: plaats het transplantaat rechts van de ontvangende vaten en voer de eerste helft van de anastomose uit (figuur 4E). Plaats vervolgens het transplantaat links van de ontvangende vaten en voer de tweede helft van de anastomose uit (figuur 4F).
- Fixer de donorlongslagader aan de inferieure vena cava analoog aan de aortale anastomose (8-0 monofilament niet-resorbable hechting). Hechting in de eerste helft van de veneuze anastomose aan de intraluminale kant van het vaartuig (Figuur 4G-H).
- Spoel de anastomoses met zoutlijn direct voor het aandraaien van de knopen om perifere embolie te voorkomen.
- Plaats een hemostatisch gaas rond zowel anastomozes en laat de Cooley vasculaire klem voorzichtig los, zodat de reperfusie van het transplantaat kan beginnen. Behandel het aftappen langs de anastomoses door lichte compressie met gesteriliseerde wattenstaafjes.
LET OP: De graft moet beginnen te kloppen na ongeveer 60 s. - Vervang de darm op een meander achtige manier. Zorg ervoor dat er geen malrotations van de mesentrische stralen zijn om darmnecrose of mechanische obstructie te voorkomen.
- Sluit de buikspieren / fascia en de huid afzonderlijk met behulp van continue 3-0 polyfilament lopende hechtingen.
3. Postoperatieve zorg
- Voor postoperatieve analgesie, de ontvangers te voorzien van een extra onderhuidse injectie van 5 mg Carprofen per kg lichaamsgewicht op de eerste postoperatieve dag (POD). Voeg bovendien 1 g Metamizol toe aan 500 mL drinkwater tot de derde POD.
- Begin met het monitoren van de harttransplantatiefunctie door dagelijkse buikpalpatie op de derde POD.
OPMERKING: In geval van transplantaat falen vóór de derde POD, moet een chirurgische in plaats van een immunologisch falen worden overwogen. Dit hangt echter af van de gekozen stamcombinatie en het respectieve immunologische model (bijvoorbeeld hyperacute afstoting na voorafgaande immunisatie). - Na graft afstoting, extract weefsels zoals de drainerende retroperitoneale lymfeklieren craniale van de anastomoses, de milt, het bloed, de thymus en het transplantaat voor verdere immunologische analyses via flow cytometrie of immunohistochemie.
4. Enzymatische vertering van het hart en onderhuidse injectie van hartcellen in het oor
- Voer hartexplantation en perfusie analoog uit aan heterotopische harttransplantatie (zie stap 1).
- Versnipper het hart in blokken van 3 mm x 3 mm met een steriele scalpel of steriele schaar en uitbroed het gedurende 30 min bij 37 °C in kweekmedium met 0,5 mg/mL collageenase.
OPMERKING: Het is belangrijk om kweekmedium te gebruiken dat penicilline, streptomycine en glutamine bevat zonder foetaal kalfsserum (FCS), vooral omdat FCS de spijsvertering van collageen remt. - Voeg het verteerde weefsel toe aan een zeef met grote pored, terwijl het cultuurmedium wordt verwijderd en het gehakt grondig wordt verwijderd om een suspensie van vitale hartspiercellen te krijgen, meestal dode enkele hartcellen en resterende bloedcellen. Was de celvering twee maal met steriele isotone zoutoplossing.
LET OP: Instellingen voor centrifugeren: 10 min, 200 x g, 20 °C - Filtreer de suspensie met behulp van een 40 μm celzeef en verzamel de vitale celcongeries door de celzeef door te spoelen met 5-10 mL isotone zoutoplossing.
- Na centrifugatie, resuspend de hartspiercellen in zoutoplossing opgelost bij een concentratie van 5x105 cellen/ mL en trek de celoplossing in een 1 mL spuit.
- Voer anesthesie analoog uit met het protocol dat is beschreven voor de ontvanger van narcose (zie stap 2) voor heterotopische harttransplantatie.
- Plaats de ontvanger in een zijwaartse positie en bevestig het oor met een vinger met behulp van dubbelzijdige tape(figuur 5A).
- Injecteer 20 μL van de hartspierceloplossing (met 1 x 104 cellen) via een 27 G canule s.c. dicht bij de visuele capillaire vaten in het oor van de ontvanger (figuur 5B).
- Na een gedefinieerde observatieperiode (afhankelijk van de gekozen stamcombinatie en afstotingssterkte) haal je de drainerende cervicale lymfeklieren en voer je verdere analyses uit, zoals stromingscytometrie of coculturen (figuur 5C).
OPMERKING: Bovendien kan histologische analyse van de pinna worden uitgevoerd om celinfiltratie te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het verleden zijn verschillende immunologische kwesties aangepakt op basis van het model, dat in de werkgroep werd gevalideerd door meer dan 500 transplantaties met een overlevingskans van meer dan 95%13,18,1919,20,21,22,23,24. De totale bedrijfstijden (inclusief graft explantation en implantatie) bedroegen meestal niet meer dan 60 minuten, terwijl de gecombineerde koude en warme ischemietijden ongeveer 30 minuten bedroegen. De toegepaste stamcombinaties waren voornamelijk gebaseerd op Lewis (Lew) achtergrond. Syngene transplantaties overleefden tot 100 dagen zonder tekenen van graft failure, maar aanzienlijke gewicht en grootte vermindering op graft explantation. Meest recent hebben we heterotopische harttransplantatie uitgevoerd in twee verschillende donor-ontvanger combinaties simuleren van een snelle en een langdurige afwijzing model: Lew.1a → Lew wt leidt tot snelle afwijzing (gemiddelde overlevingstijd van 7,4 dagen) en Lew.1u-7B→ Lew.1a leidt tot een meer langdurige afwijzing (gemiddelde overlevingstijd van 42,5 dagen) (Figuur 6). Macroscopisch vertoonden de afgekeurde grafts een trombose vergezeld van een razende verkleuring en zwelling, terwijl niet-afgekeurde grafts verschillende atrofie vertonen, waarschijnlijk als gevolg van een uitgeladen linker ventrikel. Verder hebben we cryostat secties van getransplanteerde harten opgesteld om celinfiltratie te detecteren met behulp van een alkalische fosfatase-antialkalische fosfatase (APAAP) kleuring methode. Enkele frames met een vergroting van 50x werden samengevoegd tot één samengestelde afbeelding, die een overzicht gaf van de volledige graft en de verdeling van infiltrerende cellen. Histologische analyse toonde een verhoogde infiltratie van (bijvoorbeeld CD4+, TCR+, of NKR-P1A/B+) immuuncellen in de allogene grafts, terwijl syngene grafts grotendeels vrij waren van celinfiltratie (figuur 7A-C).
Cervicale lymfatomie en herstimulatie testen van drainerende lymfekliercellen na in oorinjectie van hartspiercellen in de bovengenoemde stamcombinaties bleek verschillende stam-specifieke immuunreacties op allogene hartweefsel en toegestaan verdere immunologische analyses, zoals cytokine profilering (Figuur 8A-C).
Figuur 1: Schematische presentatie van de end-to-side anastomoses en de resulterende bloedstroom door het hart. Na het anastomosing van de donor opgaande aorta end-to-side naar de ontvanger abdominale aorta en analoog de longslagader aan de ontvanger inferieure vena cava (A), bloedstroom komt de kransslagaders via de opgaande aorta. De veneuze drainage vindt plaats via de sinus coronarius in het rechter atrium en ventrikel en via de longslagader in de ontvanger inferieure vena cava (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Vereiste chirurgische instrumenten en materialen. (A) Explantation: 1: elastische ledematen band, 2: oprolmechanismen, 3: 5-0 ligatuur, 4: sonde puntige schaar, 5-6: micro naald houders, 7: schaar, 8: chirurgische tangen, 9: micro-tangen, 10: oogsmeermiddel, 11: kompressen, 12: katoenen wattenstaafjes, 13: perfusie basis, 14: zoute oplossing op ijs. (B) Implantatie: 1: elastische ledematenband, 2: oprolmechanismen, 5-6: micronaaldhouders, 7: schaar, 8: tangen, 9: micro-tangen, 10: oogsmeermiddel, 11: kompressen, 12: wattenstaafjes, 15: microschaar, 16: micro-tangen, 17: Potts schaar, 18: naaldhouder, 19: gebogen canule, 20: Cooley vasculaire klem, 21: 8-0 monofilamenthechtingen, 22: hemostatisch gaas, 23: 3-0 polyfilamenthechtingen, 24: Petrischaal, 25: Carprofen (5 mg/mL), 26: lokale verdoving (lidocaine 0,2%), 27: zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Hartexplantation. Na heparinisatie(A),thoracotomie wordt uitgevoerd en oplopende aorta en longslagader worden afgesneden zo distaal mogelijk (B). Met een enkele ligatuur longen en beide caval aderen worden afgesloten (C) en het hart wordt verwijderd uit de borstholte(D). (E) toont het hart voor en (F) na perfusie met 30 mL zoutoplossing die heparine bevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Hartimplantatie. Na uiteenzetting van buikvaten en plaatsing van een Cooley vasculaire klem(A)worden de vaten cannulated(B)en wordt een longitudinale incisie uitgevoerd met potts schaar(C-D). De donor opgaande aorta wordt gefixeerd met een knoop elk op de schedel-en staarthoek van de incisie van de ontvanger abdominale aorta(E) en anastomose wordt uitgevoerd door continu draaien hechtingen (E-F). Houd er rekening mee dat het transplantaat voor de tweede helft vanEde anastomose (F) en op de linkerkant van de vaten voor de tweede helft van de anastomose(F)en de daaropvolgende veneuze anastomose aan de rechterkant van de vaten wordt geplaatst. De eerste helft van de veneuze anastomose wordt uitgevoerd door een intraluminale hechting(G). Na het beëindigen van de tweede helft van de veneuze anastomose is het transplantaat klaar voor reperfusie (H). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: In-ear injectie van allogene hartspiercellen. Na het bevestigen van het oor van de ontvanger op een vinger met behulp van dubbelzijdige tape(A)allogene vitale hartspiercellen worden onderhuids geïnjecteerd dicht bij visuele capillaire vaten(B). Na een observatieperiode worden drainerende cervicale lymfeklieren (*) geëxtraheerd (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Hartoverleving in verschillende syngene en allogene donor-ontvanger combinaties. De Analyse van Kaplan-Meier toont de overleving aan van syngenic (n=10 snel afstotingsmodel; n=5 langdurig afstotingsmodel) en allogene grafts (n=11 snel afstotingsmodel; n=14 langdurig afstotingsmodel). In het langdurige afstotingsmodel bereikten zes van de 14 ontvangers het einde van de observatieperiode (60 dagen) zonder graft-falen, wat leidde tot een langdurige graftoverleving in deze groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Histologische analyse van syngene en allogene harttransplantaties. (A-B) tonen de infiltratie van CD4+ cellen met behulp van de APAAP kleuring methode in een syngene graft (A) en een allogene graft bij afwijzing (B). (C) presenteert de toename van celinfiltratie in allogene grafts in vergelijking met syngene grafts (die als referentiegroep) voor verschillende immuuncel subsets. De indeling die wordt toegepast om celinfiltratie te kwantificeren, werd gewijzigd van Hirschburger et al.25: 0 = infiltratie vergelijkbaar met syngene grafts; 0.5 = lichte toename van gekleurde cellen in geïsoleerde weefselsecties; 1 = toename van enkelvoud bevlekte cellen over de gehele weefselsectie; 1.5 = toename van gekleurde celclusters die gelijkmatig over de gehele weefselsectie zijn verdeeld; 2 = sterk; 2.5 = zeer sterk; 3 = sterkste toename van gekleurde celclusters in de hele weefselsectie. De histologische delen van de grafts werden geanalyseerd met behulp van een vergroting van 50x. In de analyse werden vijf grafts per groep (respectievelijk syngeen en allogene) opgenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Analyse van drainerende lymfekliercellen na in-ear injectie van allogene hartspiercellen. Specifieke herstimulatie (met 2 x 105 splenocyten van de betreffende donorstam) van 2 x 105 lymfocyten geoogst uit drainerende cervicale of mesenteriale lymfeklieren (LN) van snel afwijzende Lew wt en langdurige afstoting Lew.1a-ontvangers vertoonden een aanzienlijk verminderde proliferatie van drainerende lymfekliercellen bij Lew.1a-ontvangers (A), terwijl de proliferatieve capaciteit in het algemeen nog steeds waarneembaar was na niet-specifieke stimulatie met CD3/CD28-antilichaam (B). Verrassend genoeg bleek cytokineprofilering een toename van ontstekingscytokinen in de lymfeklieren van langdurige afwijzende ontvangers (C). De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van ten minste 4 dieren per groep. Significantie wordt aangegeven met * voor p-waarden ≤ 0,05 en **** voor p-waarden ≤ 0,0001. (Dit cijfer is gewijzigd van Beetz et al.24). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerder beschreven methode van heterotopische harttransplantatie bij ratten is voornamelijk gebaseerd op de beschrijving van Ono en Lindsey in 19693. Sindsdien zijn er verschillende wijzigingen aangebracht in verschillende soorten die leiden tot een grote diversiteit van dit model. Door een aantal van deze wijzigingen te combineren en onze eigen ervaring in te voeren die voortvloeit uit meer dan 30 jaar heterotopische harttransplantaties in het laboratorium, hebben we een haalbare chirurgische aanpak ontwikkeld, die geen lange trainingsperioden of chirurgische achtergrond vereist. In het volgende zullen we algemene beperkingen van dit model bespreken en kritische stappen van het protocol onderstrepen. Verder zullen we de voordelen benadrukken van het combineren van heterotopische harttransplantatie met een nieuwe methode van in-ear injectie van hartspiercellen.
Anesthesie en algemene complicaties
Hoewel het is gemeld dat isoflurane anesthesie superieur is aan injectie anesthesie met betrekking tot vroege overleving na heterotopische harttransplantatie, intraoperatieve ademhalingsdepressie vertegenwoordigt nog steeds een van de meest voorkomende complicaties en vereist dus een zorgvuldige narcose management26. In plaats van seriële graft explantation en implantatie, respectievelijk, adviseren wij het begin van de voorbereiding van de ontvanger en de buikvaten onmiddellijk na thoracotomie van het donordier, met name omdat de operatie tijden van minder dan een uur worden geassocieerd met een betere uitkomst met betrekking tot graft en de ontvanger overleving26,27. Naast reeds genoemde complicaties zoals onderkoeling als gevolg van lange bedrijfstijden en ontbrekende verwarmingsmatten, en darmnecrose of obstructie door onfysiologische plaatsing van de darm, vertegenwoordigt een parese van hinderledematen een verdere complicatie, die kan worden voorkomen door atraumatische vasculaire klemmen en grondig spoelen van de anastomoses om perifere embolie28,29te voorkomen.
Ligatuur van long- en cavaladeren en bloedingscomplicaties
Om de warme ischemietijd te verminderen, gebruiken we één ligatuur voor zowel caval als alle vier de longaders. Als een mogelijke complicatie als gevolg van een te proximale/ventrale plaatsing van de ligatuur, moet de verstoring van veneuze terugstroom door occlusie van de sinus coronarius worden vermeld. In geval van ernstige bloedingen na verwijdering van de Cooley-klem en zichtbare afstraffing van het transplantaat, moet de ligatuur onmiddellijk worden gecontroleerd op insufficiëntie. We hebben dit type complicatie waargenomen, vooral als de dissectie van de longaders te dicht bij de ligatuur werd uitgevoerd tijdens het verwijderen van het transplantaat uit de borstholte. Anders wordt ernstige bloedingen voornamelijk veroorzaakt door insufficiëntie van de vasculaire anastomoses. Bovendien, een kransslagader loopt langs de opgaande aorta die vaak wordt doorgesneden tijdens explantation wordt beschreven om dodelijke bloeden veroorzaken bij reperfusie27.
Ischemietijd en perfusie
Ongeacht het transplantatiemodel is het altijd onmisbaar om de ischemietijd te verkorten, vooral omdat het hart wordt beschouwd als een kwetsbaar orgaan met betrekking tot ischemieschade. Door het uitvoeren van een operatie met twee chirurgen, zijn we in staat om een minimale warme en koude ischemische tijd te bereiken en dus afzien van het gebruik van cardioplegic oplossingen om ischemie-reperfusie schade te verminderen30. Over het algemeen speelt de perfusie van het transplantaat een belangrijke rol en is het essentieel om het transplantaat te koelen en bloedcellen te verwijderen, wat kan leiden tot trombose of embolie. Terwijl lage perfusiedruk leidt tot onvoldoende perfusie en dus tot een onvolledige verwijdering van bloedcellen, kan een hoge perfusiedruk endotheelschade veroorzaken31,32. Wij adviseren perfusie van de pulmonale slagader evenals de opgaande aorta totdat de kransslagaders zichtbaar zijn gespoeld duidelijk.
Incisie van de ontvangende vaten
Een kritische stap in het protocol vormt de incisie van de ontvangende vaten zonder schade te veroorzaken aan de rugwand van de vaten: Schmid et al. beschreven het voordeel van aortomie of venotomie die een kleine dwarsincisie uitvoert, gevolgd door longitudinale vergroting in schedel- en staartrichting, wat verder leidt tot een verlaagd stenosepercentage van aortale anastomose33. In ons model worden de ontvangende vaten doorboord met behulp van een kleine canule. Daarna wordt de punctieplaats vergroot met behulp van Potts-schaar om een longitudinale incisie te creëren. Voor een betere haalbaarheid raden we aan om de punt van de canule te buigen naar een hoek van 30-45° wat leidt tot een verminderd risico op beschadiging van de achterwand van de vaten. We hebben geen klinisch relevante vasculaire stenoses waargenomen bij een van onze ontvangers. Soortgelijke voordelen van het openen van ontvanger vaten door het doorboren van de abdominale aorta en de inferieure vena cava met een canule zijn beschreven door Shan et al.34.
Het beheersen van het model van heterotopische harttransplantatie
In de afgelopen tien jaar is het model uitgevoerd door onderzoekers op de afdeling met weinig of geen chirurgische achtergrond. Zoals hierboven vermeld, opereren we in paren van chirurgen, terwijl de meer ervaren onderzoeker is belast met het garanderen van het succes van de transplantatie en op hetzelfde van geleidelijk verbeteren van de vaardigheden van de onervaren onderzoeker. Na een korte trainingsperiode van ongeveer tien graft explantations en implantaties bij dode dieren, is de onervaren onderzoeker verantwoordelijk voor het uitvoeren van de hartexplantage en het assisteren van de graft implantatie bij ongeveer tien levende dieren. Vervolgens voert de onervaren onderzoeker actief de vasculaire anastomoses uit, zodat de voormalige onervaren onderzoeker na ongeveer tien andere transplantaties meestal in staat is om alle kritische stappen van het model uit te voeren.
De toepassing van dit opleidingsconcept, eerdere publicaties van onze afdeling met behulp van heterotopische harttransplantatie bij ratten toonden geen verschillen met betrekking tot morbiditeit, mortaliteit of graft functie ondanks verschillende teams van chirurgen13,18,,,19,20,2222,23,24.
Van nota, het uitvoeren van de vasculaire anastomozes vertegenwoordigt de meest kritische stap in dit protocol en vaste orgaantransplantatie modellen in het algemeen. Wij raden daarom aan om langdurige trainingsperioden met dode dieren te gebruiken totdat anastomoses nauwkeurig en snel wordt uitgevoerd, vooral als een ervaren onderzoeker niet beschikbaar is voor begeleiding bij levende dieren.
Algemene voor- en nadelen van het model
Terwijl spontane tolerantie-inductie vaak wordt omschreven als een fenomeen bij levertransplantatie en ook waargenomen bij niertransplantatie, wordt het hart beschouwd als een nogal immunogeen orgaan en maakt het dus een betrouwbare afstoting mogelijk in transplantatiemodellen35,36. In tegenstelling tot deze bevindingen, konden we ook op lange termijn overleven en afwezigheid van afwijzing na heterotopische harttransplantatie in bepaalde donor-ontvanger combinaties, ondanks volledige grote histocompatibiliteit complexe ongelijkheid.
Een vaak genoemde kritiek op heterotopische harttransplantatie is de subjectiviteit van graft monitoring door handmatige palpatie. Daarom is het model uitgebreid tot femur anastomose technieken om de toegang voor palpatie te vergemakkelijken en verdere monitoringtechnieken zoals transfemorale echocardiografie15,16. Aan de andere kant hebben Mottram et al. aangetoond dat de monitoring van het transplantaat via palpatie goed correleert met elektrocardiografische metingen37. Zo lijkt handmatige palpatie bij heterotopische harttransplantaties voldoende voor het monitoren van de graft-functie in een acuut afstotingsmodel.
Als gevolg van heterotopische plaatsing en linker ventriculaire lossing functioneert het hart niet onder anatomische of fysiologische omstandigheden ervan uitgaande dat dit geen invloed heeft op immunologische analyses. In tegenstelling tot deze veronderstelling, was aangetoond dat cardiale remodelleren als gevolg van links ventriculaire lossen tijdens linker ventriculaire assist apparaat therapie leidt tot een verminderde cytokine release38,39. Aan de andere kant beschreef Tang-Quan et al. de geloste instelling als een meer geschikte benadering voor immunologische analyse, aangezien op lange termijn ischemische schade van het transplantaat als gevolg van perfusie met gedeeltelijk zuurstofloos bloed in het linker ventriculaire geladen model werd waargenomen40.
Hoewel buikplaatsing van de grafts chirurgische voordelen biedt in termen van uitvoerbaarheid, is het moeilijk om voldoende aantallen drainerende retroperitoneale lymfeklieren te oogsten bij transplantatie-afstoting die verdere analyses aantast. Om deze reden introduceerden we een nieuwe methode van in-ear injectie van allogene hartspiercellen. Dit concept is afkomstig van parasitlogisch onderzoek niet toegepast voor immunologische analyses bij transplantatie, ondanks de haalbaarheidervan 41,42. Het voordeel van dit model is de mogelijkheid om een aanzienlijk aantal drainerende lymfeklieren te identificeren en te oogsten, wat de mogelijkheid biedt om complexe immunologische analyses uit te voeren. Van belang, beide modellen kunnen worden gecombineerd in een ontvanger die verdere inzichten in de mechanismen van afstoting en tolerantie in cel-en orgaantransplantatie bij ratten.
Onze modellen van rattenhart en hartspierceltransplantatie vertegenwoordigen een praktische en goed bestudeerde aanpak en kunnen worden uitgevoerd zonder verdere chirurgische training of achtergrond. Geconfronteerd met het feit dat nieuwe kloontechnologieën voor ratten onlangs zijn geïntroduceerd en ontwikkeld, bieden deze modellen enorme mogelijkheden voor transplantatie immunologische onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Britta Trautewig, Corinna Löbbert en Ingrid Meder bedanken voor hun inzet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F.
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al.
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
