Summary
Denne metode viser brugen af den nordlige hybridiseringsteknik til at detektere miRNA'er fra total RNA-ekstrakt.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er en klasse af endogene udtrykt ikke-kodning, ~ 21 nt små RNA'er, der er involveret i reguleringen af genekspression i både planter og dyr. De fleste miRNAs fungerer som negative skift af genekspression rettet mod vigtige gener. I planter, primære miRNAs (pri-miRNAs) udskrifter genereres af RNA polymerase II, og de danner varierende længder af stabile stængel-loop strukturer kaldet pre-miRNAs. En endonuclease, Dicer-like1, behandler præ-miRNAs i miRNA-miRNA* duplexes. En af strengene fra miRNA-miRNA* duplex er udvalgt og lastet på Argonaute 1 protein eller dets homologer for at mpaltere spaltningen af målmRNAs. Selvom miRNA'er er nøglesignalmolekyler, udføres deres detektion ofte ved hjælp af mindre end optimale PCR-baserede metoder i stedet for en følsom nordlig blot-analyse. Vi beskriver en enkel, pålidelig og ekstremt følsom nordlig metode, der er ideel til kvantificering af miRNA-niveauer med meget høj følsomhed, bogstaveligt talt fra ethvert plantevæv. Derudover kan denne metode bruges til at bekræfte størrelsen, stabiliteten og overfloden af miRNAs og deres prækursorer.
Introduction
Den nylige opdagelse af små regulerende RNA'er, mikroRNA'er, har ført til forskning i at forstå dem og deres rolle i planter og dyr1. Lange prækursorer af miRNA'er forarbejdes til 21 til 24 nt modne miRNAs ved HYL1 og specifikke dicer-lignende proteiner2,3. En 22 nt miRNA kan indlede kaskadehæmning ved at generere sekundære siRNAs4. Undersøgelser har vist miRNAs' og sekundære siRNA'ers rolle i udvikling, celle skæbne og stress reaktioner5,6.
Northern hybridisering er en eksperimentel metode, der rutinemæssigt anvendes til at detektere specifikke RNA-molekyler. Denne metode tilpasser brugen til påvisning af ca. 19 -24 nt lange små RNA'er fra en pulje af samlede RNAs7. I denne demonstration illustrerer vi brugen af denne teknik til påvisning og kvantificering af miRNA'er. Denne metode anvender mærkning af sonder, der anvender radioisotoper. Således kan miRNA-niveauer i prøven påvises med øget følsomhed. I modsætning til PCR-baserede metoder sikrer denne metode kvantificering af ekspression samt størrelsesbestemmelse af miRNA'erne. I denne protokol viser vi afgørende trin, der forbedrer miRNA-registrering. Vi har ændret trin i blotting og hybridisering for at opnå høj opløsning signal detektion af miRNAs. Denne teknik kan også anvendes til påvisning af andre endogene små RNA'er såsom siRNAs, tasi-sekundære RNA'er og snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Præparat af en 15% denaturerende polyacrylamidegel
- Der vejes og tilsættes 4,8 g urinstof, tilsættes 3,75 ml 40% acrylamid: bisacrylamidopløsning (19:1) og 1 ml 10x TBE pH 8,2 i et sterilt 50 ml rør.
- Urinstof opløses ved hjælp af et vandbad, der er indstillet til 60 °C, i en klar opløsning.
- Make-up volumen til 10 ml ved hjælp af frisk autoklaveret sterilt vand og afkøle gel mix til stuetemperatur.
- Tilbered frisk 10% (w / v) ammoniumpersulfatopløsning.
2. Samling af glasplader og elektroforeseenhed
- Vask alle de apparater, der kræves til gelelektroforese og elektro-blotting med vaskemiddel. Forsigtigt skrubbe dem ved hjælp af en blød svamp til at fjerne resterende buffer og acrylamid, skyl med vand og lad dem tørre.
- Saml begge glaspladerne sammen og læg dem fast på svampen. Brug en 1 mm tyk plade til denne opsætning. Sørg for, at pladerne er på samme niveau for at undgå lækage.
- Til 10 ml gelblandingen tilsættes 8 μL TEMED og 80 μL frisklavet 10% (w/v) ammoniumpersulfatopløsning.
- Bland forsigtigt og hæld det forsigtigt i mellem de samlede glasplader. Anbring kammen forsigtigt. Undgå at generere luftbobler i dette trin.
- Lad gelen polymerisere i ca. 45 min.
- Vask den polymeriserede gel med sterilt vand, før den placeres inde i det gelløbende setup.
- Pladerne samles inde i løbekassetten, og fjern kammen forsigtigt.
- Hæld frisklavet steril 1x TBE, pH 8.2 i tanken.
- Vask brøndene omhyggeligt ved pipettering af bufferen for at fjerne saltkrystaller. Dette trin hjælper RNA-prøven med at køre ensartet hen over gelen.
- Udfør en pre-run på 80 V i 30 min.
3. Tilberedning af lastfarvestof og prøver
- For 10 ml gel lastning farvestof, vejer 5 mg bromophenol blå, 5 mg xylen cyanol, tilsættes 10 ml deioniseret formamid omhyggeligt og bland dem godt.
- Aliquot 10 μg af det samlede RNA i et sterilt 1,5 ml rør og tør prøverne tørre med en speedvac. Prøverne må ikke tørres for meget.
- Opslæmm RNA-prøverne op med 8 μL belastning.
- Prøverne opvarmes ved 98 °C i 2 min, afkøles i 1 min ved RT, vortex og spining prøverne i 3 gange. Dette trin er afgørende for korrekt resuspension, og til gengæld hjælper dette i lige læsning af prøverne.
4. Gel elektroforese
- Stop forløbene, og vask brøndene, før prøven læsses.
- Prøverne opvarmes ved 98 °C i 1 min, og prøverne opvarmes varmt i brønden ved hjælp af kapillære spidser. Sæt spidsen i bunden af brønden, så prøven optager et tyndt lag i brønden.
- Komplet indlæsning af alle prøverne. Medtag at indlæse RNA årti markør.
- Kør gel på 80 V, indtil bromophenol blå farvestof løber næsten helt. Bromophenol blå løber på 10 bp i en 15% denaturerende acrylamid gel.
5. Forberedelse til elektropletting
- Skær N+nylonmembranen til glaspladens dimensioner, og mærk membranen i øverste højre hjørne med en HB-blyant.
- Anbring forsigtigt membranen på overfladen af sterilt vand, der vender mod den mærkede side mod vandoverfladen. Membranen lægges i blød i 15 min.
- Skær 4 stykker blotting papir I til dimensionerne af fiber pad.
- Klargør gelsandwichen til placering af kassettens grå side i en ren bakke.
- Pre-våd fiber pad og læg den over kassetten. Fjern luftbobler.
- Pre-våd et stykke blotting papir i 1x TBE og sted over fiber pad. Fjern luftbobler ved at rulle en plastikpipette over papiret. Læg et andet stykke fortæt blotting papir og fjerne luftbobler.
- Fjern forsigtigt gelen fra løbekassetten og læg den over sandwichopsætningen, så den første indlæste RNA-prøve er mod højre.
- Dyp forsigtigt den forgennemvædede membran i 1x TBE, og anbring den over gelen og nedad. Rul ud for at fjerne luftboblerne.
- Dyp et stykke blotting papir, læg det over membranen, og fjern luftboblerne. Dyp et andet stykke blotting papir, placere det over sandwich setup og fjerne luftbobler.
- Fuldend sandwichen ved at placere en fortædt fiberpude over opsætningen og luk kassetten fast.
- Anbring transblotkassetten i modulet, og fyld 1x TBE, pH 8.2 op til blottingmærket.
- Overfør ved 10 V, natten over ved 4 °C.
- Efter overførs den fugtige membran på et papirark og krydskobling af RNA'en til membranen ved bestråling med 254-nm UV-lys (120.000 μjoules/cm²). Den tværbundne blot måske opbevares ved 4 °C for yderligere hybridisering.
6. Forberedelse af radioaktivt mærket sonde
- Design en sonde, der er helt komplementær til den lille RNA, som skal påvises.
- Slutmikningen af sonden ved hjælp af ƳP32ATP (fremstillet af BRIT) i 5' ende ved at kombinere komponenterne i henhold til opskriften i tabel 1.
- Ovennævnte reaktionsblanding inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Adskil ikke-mærket ƳP32ATP fra sonde ved hjælp af en Sephadex G-25 kolonne i henhold til fabrikantens protokol.
7. Hybridisering af skamplet
- Placer den krydsede blot, RNA side vender toppen inde i en hybridisering flaske.
- Bland den ultrafølsomme hybridiseringsbuffer kraftigt, tilsættes 10 ml af den og indkubes blot i en hybridiseringsovn, der holdes ved 35 °C, med rotation.
- Udfør præ-hybridisering i 20 min.
- Tag flasken ud af ovnen, og tilsæt den mærkede sonde i hybridiseringsbufferen forsigtigt.
- Pletten hybridiseres ved 35 °C med en rotation på 12 timer.
- Efter hybridisering overføres hybridiseringsopløsningen forsigtigt til 15 ml rør. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C indtil genbrug.
- Udfør en hurtig vask af blot i 2 min for at fjerne overskydende hybridisering løsning ved at tilføje 2x SSC buffer plus 0,5% SDS. Opløsningen kasseres.
- Formatere skamplet med 2x SSC buffer plus 0,5% SDS for 35 °C, med rotation i 30 min.
- Der vaskes igen med 0,5 x SSC-buffer plus 0,5% SDS for 35°C med rotation i 30 min.
- Placer skamplet inde i et hybridiseringsdæksel, fjern den overskydende buffer og forsegle den.
- Udsætte det for en stråling fri-fosfor imager skærm natten inde i en kassette.
- Detekter hybridiseringssignalet ved hjælp af biomolekylær imager, og analysér resultaterne ved hjælp af passende software.
- Lad skampletn trøbe ved inkubation ved 80 °C med rotation i 30 min. med 0,5 X SSC-buffer plus 0,1% SDS og 0,1 X SSC-buffer plus 0,1% SDS i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne demonstration har vi opdaget og kvantificeret udtrykket af miR397 i forskellige væv af indica ris var whiteponni (Figur 1). miR397 er en 22 nt miRNA og bevaret miRNA. Udtrykket af miR397 kan påvises i alle de testede prøver. Som pr den næste generation sekventering data, prøve 1 (sætteplante væv) har miR397 ved 5 læser per million (rpm). Vi opdagede sit signal komfortabelt, hvilket indikerer, at metoden er meget følsom og kan bruges til at opdage selv meget lave rigelige miRNAs. I dette eksperiment har vi brugt miR168 og U6 som indlæsningskontrol.
I denne blot (Figur 1), styrken af signaler blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Udtrykket af miR397 er højest i vegetativ blad kappe.
Figur 1: Påvisning og kvantificering af udtrykket af miR397 i forskellige væv af risprøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer og løsning | Opskrift | Kommentarer |
| 10 X TBE | 0.89M Tris buffer | pH-værdien indstilles til 8,2 ved hjælp af eddikesyre |
| 0.89M Borsyre | ||
| 30mM EDTA | ||
| Gel mix | 15% acrylamid-bisacrylamide sol, 19:1 | Gelblandingen må ikke indeholde urinstofkrystaller |
| 8M urinstof | ||
| 1x TBE | ||
| Gel lastning farvestof | 0.05 %(w/v) bromophenol blå | Der skal udvises forsigtighed, mens du håndterer deioniseret formamid |
| 0.05 %(w/v) Xylen xyanol | ||
| 100 % deioniseret formamid | ||
| Mærkning af sonde | PNK buffer (10X, 2 μL) | Denne blanding indeholder radioaktive molekyler, skal dette trin udføres af uddannet personel inde i et radioaktivt laboratorium |
| PNK enzym (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0,1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| Vask Buffer - Jeg | 2X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Vaskebuffer - II | 0,5 x SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - Jeg | 0,5 x SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - II | 0,1 X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS |
Tabel 1: Tabel over opskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode kan i vid udstrakt grad anvendes til påvisning og kvantificering af små RNAs herunder mindre rigelige miRNAs. Protokollen beskriver hovedsageligt trinene til denaturering af det samlede RNA i en belastningsbuffer, størrelsesadskillelse ved gelelektroforese, overførsel af RNA til en membran, krydssammenkobling af RNA på membranen og hybridiseres ved hjælp af ønskede radioaktive netiver.
Det afgørende trin for ethvert blotting eksperiment er brugen af RNA af god kvalitet til prøveforberedelse. Før du lægger gelerne, skal man sørge for, at prøverne er frit flydende og ikke holder sig til lastning tips. Der skal udvises forsigtighed, mens prøven lægges, skal spidsen indsættes lige over bunden af brønden, så prøven optager et tyndt lag i brønden. Temperaturen i hybridiseringovnen skal holdes ved 35 °C til påvisning af miRNA'er, der er ekstremt mindre rigelige. Ved gentagen hybridisering af skamplet opbevares membranen ved 4 °C ved at holde den fugtig i 2x SSC.
Denne metode kan bruges til at påvise små RNAs fra væv, der er rige på polysaccharider og polyfenoler8. I denne protokol giver brugen af vakuumtørring til koncentration af RNA-prøver bedre stabilitet og mindre tab af prøve sammenlignet med andre ældre metoder9. Andre ændringer i metoden omfatter, spredning af membranen i vand, før du dypper i 1x TBE under elektrooverførsel. Dette forbedrer effektiviteten af RNA-overførsel, hvilket giver bedre opløsning af skamplet.
En væsentlig begrænsning af metoden er brugen af radioisotoper, som har brug for uddannet personale og en radioisotop lab til at udføre hybridisering eksperimenter. Denne metode her giver detaljerede oplysninger om alle de trin, der er involveret i RNA blot analyse til påvisning af miRNAs. Denne protokol sikrer også størrelsen af det lille RNA bortset fra signaldetektering10. Teknikken giver et robust værktøj til molekylærbiologer til at vurdere overfloden af forskellige små RNAs såsom miRNAs, sekundære siRNAs og snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke erklæret interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender adgangen til stråling lab, som værtsinstituttet og BRIT for radioisotop. PVS-laboratoriet støttes af Det Nationale Center for Biologiske Videnskaber, Tata Institute for Fundamental Research and Grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) fra Department of Biotechnology, Indiens regering. MP anerkender DBT-Research Associateship, DBT, Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
