Summary
Este método demuestra el uso de la técnica de hibridación del norte para detectar miRNAs a partir del extracto total de ARN.
Abstract
Los microARN (miRNAs) son una clase de ARN pequeños expresados endógenamente, de 21 nt de pequeñas ANas implicadas en la regulación de la expresión génica tanto en plantas como en animales. La mayoría de los miRNAs actúan como interruptores negativos de la expresión génica dirigidos a genes clave. En las plantas, las transcripciones primarias de miRNAs (pri-miRNAs) son generadas por ARN polimerasa II, y forman diferentes longitudes de estructuras estables de bucle de tallo llamadas pre-miRNAs. Una endonucleasa, como Dicer1, procesa los pre-miRNAs en dúplex miRNA-miRNA*. Una de las hebras del dúplex miRNA-miRNA* se selecciona y se carga en la proteína Argonaute 1 o sus homólogos para mediar el escote de los ARNM objetivo. Aunque los miRNAs son moléculas clave de señalización, su detección a menudo se lleva a cabo por métodos basados en PCR menos que óptimos en lugar de un análisis sensible de la mancha del norte. Describimos un método norte simple, fiable y extremadamente sensible que es ideal para la cuantificación de los niveles de miRNA con muy alta sensibilidad, literalmente de cualquier tejido vegetal. Además, este método se puede utilizar para confirmar el tamaño, la estabilidad y la abundancia de miRNAs y sus precursores.
Introduction
El reciente descubrimiento de pequeñas ARN reguladoras, microRNAs, ha liderado la investigación para entenderlos y su papel en plantas y animales1. Los precursores largos de los miRNAs se procesan en miRNAs maduras de 21 a 24 nt por HYL1 y proteínas específicas similares a los dados2,,3. Un miRNA de 22 nt puede iniciar el silenciamiento en cascada generando siRNAs secundarios4. Los estudios han demostrado el papel de los miRNAs y los siRNAs secundarios en el desarrollo, el destino celular y las respuestas de tensión5,,6.
La hibridación del norte es un método experimental empleado rutinariamente para detectar moléculas específicas de ARN. Este método personaliza su uso en la detección de aproximadamente 19 -24 nt largos RNAs pequeños de un grupo de ARNtotales 7. En esta demostración, ilustramos el uso de esta técnica para la detección y cuantificación de miRNAs. Este método utiliza el etiquetado de sondas utilizando radioisótopos; por lo tanto, los niveles de miRNA en la muestra se pueden detectar con mayor sensibilidad. A diferencia de los métodos basados en PCR, este método garantiza la cuantificación de la expresión, así como la determinación del tamaño de los miRNAs. En este protocolo, mostramos pasos cruciales que mejoran la detección de miRNA. Hemos modificado pasos en hinchazón e hibridación para obtener la detección de señal de alta resolución de miRNAs. Esta técnica también se puede utilizar para la detección de otros ARN pequeños endógenos tales como siRNAs, ARN-secundarios tasi y snoRNAs.
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Protocol
1. Preparación de un gel de poliacrilamida desnaturalado del 15%
- Pesar y añadir 4,8 g de urea, añadir 3,75 ml de 40% de acrilamida: bisacrilamida (19:1) solución y 1 ml de 10x TBE pH 8.2 en un tubo estéril de 50 ml.
- Disolver la urea con un baño de agua a 60 oC en una solución transparente.
- Mafiar el volumen a 10 ml con agua estéril recién autoclavada y enfríe la mezcla de gel a temperatura ambiente.
- Preparar solución fresca de persulfato de amonio al 10% (p/v).
2. Montaje de las placas de vidrio y la unidad de electroforesis
- Lave todo el aparato necesario para la electroforesis de gel y la electro-hinchazón con detergente. Frote suavemente con una esponja suave para eliminar el tampón residual y la acrilamida, enjuague con agua y deje que se sequen.
- Montar ambas placas de vidrio juntas y colocarlas firmemente sobre la esponja. Utilice una placa de 1 mm de espesor para esta configuración. Asegúrese de que las placas estén al mismo nivel para evitar fugas.
- A la mezcla de gel de 10 ml, agregue 8 ml de TEMED y 80 ml de solución de persulfato de amonio 10% (p/v) recién preparada.
- Sin demora, mezcle y vierta suavemente esto entre las placas de vidrio ensambladas. Coloque el peine con cuidado. Evite generar burbujas de aire en este paso.
- Deje que el gel se polimerice durante aproximadamente 45 min.
- Lave el gel polimerizado con agua estéril antes de colocarlos dentro de la configuración de funcionamiento del gel.
- Montar las placas dentro del cassette de correr y retirar el peine suavemente.
- Vierta 1x TBE estéril 1x, pH 8.2 en el tanque.
- Lave los pozos cuidadosamente pipeteando el tampón para eliminar los cristales de sal. Este paso ayuda a que la muestra de ARN se ejecute uniformemente a través del gel.
- Realice una pre-ejecución a 80 V durante 30 min.
3. Preparación de tinte de carga y muestras
- Para 10 ml de tinte de carga de gel, pesar 5 mg de bromofenol azul, 5 mg de cianol de xileno, añadir 10 ml de forma desionizada con cuidado y mezclarlos bien.
- Aliquot 10 g de ARN total en un tubo estéril de 1,5 ml y secar las muestras con unavaca velocidad. No seque demasiado las muestras.
- Resuspender las muestras de ARN en 8 l de carga.
- Calentar las muestras a 98 oC durante 2 min, enfriar durante 1 min a RT, vórtice y girar las muestras, durante 3 veces. Este paso es esencial para una resuspensión adecuada y a su vez esto ayuda a la carga igual de las muestras.
4. Electroforesis de gel
- Detenga el pre-run y lave los pozos antes de la carga de la muestra.
- Calentar las muestras a 98 oC durante 1 min y cargar las muestras calientes en el pozo utilizando puntas capilares. Inserte la punta en la parte inferior del pozo, de modo que la muestra ocupe una capa delgada en el pozo.
- Carga completa de todas las muestras. Incluir para cargar el marcador de década de ARN.
- Ejecuta el gel a 80 V hasta que el tinte azul bromofenol funcione casi por completo. El bromofenol azul funciona a 10 bp en un gel de acrilamida desnaturalante del 15%.
5. Preparación para la electro-hinchazón
- Corte la membrana N+nylon a las dimensiones de la placa de vidrio y etiquete la membrana en su esquina superior derecha con un lápiz HB.
- Coloque suavemente la membrana sobre la superficie de agua estéril, mirando hacia el lado etiquetado hacia la superficie del agua. Remoje previamente la membrana durante 15 min.
- Corte 4 trozos de papel hinchado I a las dimensiones de la almohadilla de fibra.
- Prepare el sándwich de gel para colocar el lado gris del cassette en una bandeja limpia.
- Humedezca previamente la almohadilla de fibra y colóquela sobre el cassette. Retire las burbujas de aire.
- Pre-húmedo un pedazo de papel hinchado en 1x TBE y colocar sobre la almohadilla de fibra. Retire las burbujas de aire rodando una pipeta de plástico sobre el papel. Ponga otro pedazo de papel de hinchazón pre-húmedo y retire las burbujas de aire.
- Retire cuidadosamente el gel del cassette de correr y colóquelo sobre la configuración del sándwich, de modo que la primera muestra de ARN cargada esté hacia la derecha.
- Sumerja suavemente la membrana pre-empapada en 1x TBE y colóquela sobre el gel, mirando hacia abajo el lado etiquetado. Despliegue para eliminar las burbujas de aire.
- Sumerja un pedazo de papel hinchado, árúselo sobre la membrana y retire las burbujas de aire. Sumerja otro pedazo de papel hinchado, colóquelo sobre la configuración del sándwich y retire las burbujas de aire.
- Complete el sándwich colocando una almohadilla de fibra pre-húmeda sobre la configuración y cierre firmemente el cassette.
- Coloque el cassette transblot en el módulo y llene 1x TBE, pH 8.2 hasta la marca de hinchazón.
- Traslado a 10 V, durante la noche a 4oC.
- Después de la transferencia, coloque la membrana húmeda en una hoja de papel e vincule inmediatamente el ARN a la membrana por irradiación con luz UV de 254 nm (120.000 éjoules/cm2). La mancha reticulada tal vez almacenada a 4 oC para una mayor hibridación.
6. Preparación de sonda radiomarcada
- Diseñar una sonda que sea completamente complementaria al pequeño ARN que se va a detectar.
- Fin etiqueta la sonda utilizando ƳP32ATP (obtenido de BRIT) en su extremo de 5' combinando los componentes según la receta proporcionada en la Tabla 1.
- Incubar la mezcla de reacción anterior a 37oC durante 30 min.
- Separe la ƳP32ATP sin etiqueta de la sonda mediante el uso de una columna Sephadex G-25 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
7. Hibridación de la mancha
- Coloque la mancha cruzada, lado ARN orientado hacia arriba dentro de una botella de hibridación.
- Mezclar vigorosamente el tampón de hibridación ultrasensible, añadir 10 ml de él e incubar la mancha dentro de un horno de hibridación mantenido a 35 oC, con rotación.
- Realice la pre-hibridación durante 20 min.
- Retire la botella del horno y agregue la sonda etiquetada en el tampón de hibridación suavemente.
- Hibridar la mancha a 35oC, con rotación durante 12 h.
- Después de la hibridación, transfiera cuidadosamente la solución de hibridación a un tubo de 15 ml. Esta solución se puede almacenar a 4 oC hasta su reutilización.
- Realice un lavado rápido de la mancha durante 2 minutos para eliminar el exceso de solución de hibridación añadiendo 2x buffer SSC más 0.5% SDS. Deseche la solución.
- Incubar la mancha con 2 tampón SSC más 0,5% SDS para 35 oC, con rotación durante 30 min.
- Lave la mancha de nuevo con un búfer SSC de 0,5x más un SDS del 0,5% para 35 oC, con rotación durante 30 min.
- Coloque la mancha dentro de una cubierta de hibridación, retire el tampón sobrante y ciéltelo.
- Exponga a una pantalla de imágenes de fósforo libre de radiación durante la noche dentro de un casete.
- Detectar la señal de hibridación utilizando el imager biomolecular y analizar los resultados utilizando el software adecuado.
- Despojar la mancha incubando a 80 oC, con rotación durante 30 min con búfer SSC de 0,5 X más 0,1% SDS y 0,1 X Tampón SSC más 0,1% SDS durante 30 min.
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Representative Results
En esta demostración, hemos detectado y cuantificado la expresión de miR397 en diferentes tejidos de arroz indica var whiteponni (Figura 1). miR397 es un miRNA de 22 nt y miRNA conservada. La expresión de miR397 se puede detectar en todas las muestras analizadas. Según los datos de secuenciación de próxima generación, la muestra 1 (tejido de plántulas) tiene miR397 a 5 lecturas por millón (rpm). Detectamos su señal cómodamente, indicando que el método es muy sensible y se puede utilizar para detectar incluso miRNAs abundantes muy bajas. En este experimento, hemos utilizado miR168 y U6 como controles de carga.
En esta mancha (Figura 1), la fuerza de las señales se cuantificó utilizando ImageJ. La expresión de miR397 es más alta en vaina de hoja vegetativa.
Figura 1: Detección y cuantificación de la expresión de miR397 en diferentes tejidos de muestras de arroz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer y solución | Receta | Comentarios |
| 10 X TBE | 0.89M tampón Tris | el pH debe ajustarse a 8,2 utilizando ácido acético |
| 0.89M ácido bórico | ||
| 30mM EDTA | ||
| Mezcla de gel | 15% acrilamida-bisacrilamida sol, 19:1 | La mezcla de gel no debe contener cristales de urea |
| 8M urea | ||
| 1X TBE | ||
| Colorante de carga de gel | 0.05 %(w/v) azul bromofenol | Se debe tener cuidado al manipular la forma desionizada |
| 0.05 %(w/v) Xileno xileno | ||
| 100 % desionizado- formamida | ||
| Etiquetado de la sonda | Tampón PNK (10X, 2 L) | Esta mezcla contiene moléculas radiactivas, este paso debe ser realizado por personel entrenado dentro de un laboratorio radiactivo |
| Enzima PNK (1 l) | ||
| Oligo (100 m, 0,1 l) | ||
| ƳP32 ATP (4 l) | ||
| Wash Buffer - I | 2X SSC | |
| 0.5% (p/v) SDS | ||
| Búfer de lavado - II | 0.5X SSC | |
| 0.5% (p/v) SDS | ||
| Búfer de desmontaje - I | 0.5X SSC | |
| 0,1% (p/v) SDS | ||
| Búfer de desmontaje - II | 0.1X SSC | |
| 0,1% (p/v) SDS |
Tabla 1: Tabla de recetas.
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Discussion
Este método se puede utilizar ampliamente para la detección y cuantificación de ARN pequeños, incluidos los miRNAs menos abundantes. El protocolo describe principalmente los pasos para desnaturalizar el ARN total en un tampón de carga, la separación del tamaño por electroforesis de gel, la transferencia de ARN a una membrana, la interconexión del ARN en la membrana e hibridar utilizando las sondas oligoeléctricas radiomarcadas deseadas.
El paso crítico para cualquier experimento de hinchazón es el uso de ARN de buena calidad para la preparación de muestras. Antes de cargar los geles, uno debe asegurarse de que las muestras fluyen libremente y no se adhieren a las puntas de carga. Se debe tener cuidado al cargar la muestra, la punta debe insertarse justo encima de la parte inferior del pozo para que la muestra ocupe una capa delgada en el pozo. La temperatura del horno de hibridación debe mantenerse a 35 oC para la detección de miRNAs que son extremadamente menos abundantes. Para la hibridación repetida de la mancha, almacene la membrana a 4 oC manteniéndola húmeda en 2x SSC.
Este método se puede utilizar para detectar pequeños ARN de tejidos ricos en polisacáridos y polifenoles8. En este protocolo, el uso de secado al vacío para concentrar muestras de ARN proporciona una mejor estabilidad y menos pérdida de muestra en comparación con otros métodos más antiguos9. Otra modificación en el método incluye, la propagación de la membrana en agua antes de sumergirse en 1x TBE durante la electrotransferencia. Esto mejora la eficiencia de la transferencia de ARN, proporcionando una mejor resolución de la mancha.
Una limitación importante del método es el uso de radioisótopos, que necesita personal capacitado y un laboratorio de radioisótopos para realizar los experimentos de hibridación. Este método aquí proporciona información detallada sobre todos los pasos involucrados en el análisis de la mancha de ARN para la detección de miRNAs. Este protocolo también garantiza el tamaño del ARN pequeño aparte de su detección de señal10. La técnica proporciona una herramienta robusta para que los biólogos moleculares estimen la abundancia de varios ARN pequeños como miRNAs, siRNAs secundarios y snoRNAs.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores reconocen el acceso al laboratorio de radiación proporcionado por el instituto anfitrión y BRIT para radioisótopo. El laboratorio PVS cuenta con el apoyo del Centro Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Tata de Investigación y Subvenciones Fundamentales (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India. MP reconoce DBT-Research Associateship, DBT, Gobierno de la India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
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