Summary
Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogen exprimierter nicht-kodierender, 21 nt kleiner RNAs, die an der Regulierung der Genexpression sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beteiligt sind. Die meisten miRNAs fungieren als negative Schalter der Genexpression, die auf Schlüsselgene abzielen. In Pflanzen werden primäre miRNAs (pri-miRNAs) Transkripte durch RNA-Polymerase II erzeugt und bilden unterschiedliche Längen stabiler Stammschleifenstrukturen, die als pre-miRNAs bezeichnet werden. Eine Endonuklease, Dicer-like1, verarbeitet die pre-miRNAs zu miRNA-miRNA*-Duplexen. Einer der Stränge aus miRNA-miRNA* Duplex wird ausgewählt und auf das Argonaute 1-Protein oder dessen Homologe geladen, um die Spaltung von Ziel-mRNAs zu vermitteln. Obwohl miRNAs wichtige Signalmoleküle sind, wird ihre Detektion oft mit weniger als optimalen PCR-basierten Methoden anstelle einer empfindlichen Nordfleckanalyse durchgeführt. Wir beschreiben eine einfache, zuverlässige und extrem empfindliche nordeuropäische Methode, die ideal für die Quantifizierung von miRNA-Spiegeln mit sehr hoher Empfindlichkeit ist, buchstäblich aus jedem Pflanzengewebe. Zusätzlich kann diese Methode verwendet werden, um die Größe, Stabilität und die Fülle von miRNAs und ihren Vorläufern zu bestätigen.
Introduction
Die jüngste Entdeckung kleiner regulatorischer RNAs, microRNAs, hat die Forschung dazu geführt, sie und ihre Rolle bei Pflanzen und Tieren zu verstehen1. Lange Vorläufer von miRNAs werden von HYL1 und spezifischen dicer-ähnlichen Proteinen2,3zu 21 bis 24 nt reifen miRNAs verarbeitet. Eine 22 nt miRNA kann Kaskaden-Silencing initiieren, indem sekundäre siRNAs4generiert wird. Studien haben die Rolle von miRNAs und sekundären siRNAs bei der Entwicklung, dem Zellschicksal und den Stressreaktionen5,6gezeigt.
Die Nordhybridisierung ist eine experimentelle Methode, die routinemäßig zum Nachweis bestimmter RNA-Moleküle eingesetzt wird. Diese Methode passt ihre Verwendung bei der Erkennung von ca. 19 -24 nt langen kleinen RNAs aus einem Pool von RNAsinsgesamt 7an. In dieser Demo veranschaulichen wir den Einsatz dieser Technik zur Detektion und Quantifizierung von miRNAs. Bei dieser Methode werden Sonden mit Radioisotopen gekennzeichnet; daher können miRNA-Spiegel in der Probe mit erhöhter Empfindlichkeit nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu PCR-basierten Methoden gewährleistet diese Methode die Quantifizierung der Expression sowie die Größenbestimmung der miRNAs. In diesem Protokoll zeigen wir entscheidende Schritte zur Verbesserung der miRNA-Erkennung. Wir haben Schritte in Derblotting und Hybridisierung modifiziert, um eine hochauflösende Signalerkennung von miRNAs zu erhalten. Diese Technik kann auch für den Nachweis anderer endogener kleiner RNAs wie siRNAs, tasi-sekundäre RNAs und snoRNAs verwendet werden.
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Protocol
1. Herstellung eines 15% denaturierenden Polyacrylamid-Gels
- 4,8 g Harnstoff wiegen und hinzufügen, 3,75 ml 40% Acrylamid: Bisacrylamid (19:1) Lösung und 1 ml 10x TBE pH 8,2 in ein steriles 50 ml-Rohr geben.
- Den Harnstoff mit einem bei 60 °C eingestellten Wasserbad in eine klare Lösung auflösen.
- Make-up das Volumen auf 10 ml mit frisch autoklaviertem sterilem Wasser und kühlen Sie die Gelmischung auf Raumtemperatur.
- Bereiten Sie frische 10% (w/v) Ammoniumpersulfatlösung vor.
2. Montage der Glasplatten und Elektrophoreseeinheit
- Waschen Sie alle Geräte, die für die Gelelektrophorese und Elektro-Blotting mit Waschmittel erforderlich sind. Schrubben Sie sie vorsichtig mit einem weichen Schwamm, um Restpuffer und Acrylamid zu entfernen, mit Wasser abspülen und trocknen lassen.
- Montieren Sie beide Glasplatten zusammen und legen Sie sie fest auf den Schwamm. Verwenden Sie für dieses Setup eine 1 mm dicke Platte. Stellen Sie sicher, dass die Platten auf dem gleichen Niveau sind, um Leckagen zu vermeiden.
- Zur 10 ml-Gelmischung 8 l TEMED und 80 l frisch zubereitete 10% (w/v) Ammoniumpersulfatlösung hinzufügen.
- Ohne Verzögerung, sanft mischen und gießen Sie diese zwischen den montierten Glasplatten. Legen Sie den Kamm vorsichtig. Vermeiden Sie die Erzeugung von Luftblasen in diesem Schritt.
- Lassen Sie das Gel ca. 45 min polymerisieren.
- Waschen Sie das polymerisierte Gel mit sterilem Wasser, bevor Sie es in das Gel-Lauf-Setup legen.
- Montieren Sie die Platten in der laufenden Kassette und entfernen Sie den Kamm sanft.
- Frisch zubereitete sterile 1x TBE, pH 8,2 in den Tank gießen.
- Waschen Sie die Brunnen sorgfältig, indem Sie den Puffer pfeifen, um Salzkristalle zu entfernen. Dieser Schritt hilft der RNA-Probe, gleichmäßig über das Gel zu laufen.
- Führen Sie einen Vorlauf bei 80 V für 30 min.
3. Herstellung von Ladefarbstoffen und Proben
- Für 10 ml Gel-Ladefarbstoff 5 mg Bromphenolblau, 5 mg Xylolcyanol wiegen, 10 ml deionisiertes Formamid sorgfältig hinzufügen und gut vermischen.
- Aliquot 10 g Gesamt-RNA in ein steriles 1,5 ml-Rohr und trocknen Sie die Proben mit einem Speedvac. Trocknen Sie die Proben nicht übertrocknen.
- Unterbrechen Sie die RNA-Proben in 8 l der Belastung.
- Die Proben bei 98 °C für 2 min erhitzen, 1 min bei RT abkühlen, Wirbel und 3 Mal drehen. Dieser Schritt ist für eine ordnungsgemäße Resuspension unerlässlich und hilft wiederum bei gleicher Belastung der Proben.
4. Gelelektrophorese
- Stoppen Sie die Vorlauf und waschen Sie die Brunnen vor dem Probenladen.
- Die Proben bei 98 °C 1 min erhitzen und die Proben mit Kapillarspitzen heiß in den Brunnen laden. Legen Sie die Spitze an die Unterseite des Brunnens, so dass probe eine dünne Schicht im Brunnen belegt.
- Vollständige Beladung aller Proben. Schließen Sie ein, um RNA-Dekadenmarker zu laden.
- Führen Sie das Gel bei 80 V, bis der Bromphenolblaufarbstoff fast vollständig läuft. Bromophenolblau läuft bei 10 bp in einem 15% denaturierenden Acrylamidgel.
5. Vorbereitung für Elektro-Blotting
- Schneiden Sie die N+Nylon-Membran auf die Abmessungen der Glasplatte und beschriften Sie die Membran in der rechten oberen Ecke mit einem HB-Bleistift.
- Legen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberfläche des sterilen Wassers, mit Blick auf die beschriftete Seite zur Wasseroberfläche. Die Membran 15 min vortränken.
- Schneiden Sie 4 Stück Blotting Papier I auf die Abmessungen der Faserpad.
- Bereiten Sie das Gel-Sandwich vor, um die graue Seite der Kassette in einem sauberen Fach zu platzieren.
- Das Faserpad vorbefeuchten und über die Kassette legen. Entfernen Sie Luftblasen.
- Vorbefeuchten Sie ein Stück Blotting-Papier in 1x TBE und legen Sie es über das Faserpad. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie eine Kunststoffpipette über das Papier rollen. Legen Sie ein weiteres Stück vornasses Blotting-Papier und entfernen Sie Luftblasen.
- Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der laufenden Kassette und legen Sie es über das Sandwich-Setup, so dass die erste geladene RNA-Probe nach rechts ist.
- Tauchen Sie die vorgetränkte Membran vorsichtig in 1x TBE und legen Sie sie über das Gel, mit Blick auf die beschriftete Seite nach unten. Roll out, um die Luftblasen zu entfernen.
- Tauchen Sie ein Stück Blotpapier, legen Sie es über die Membran, und entfernen Sie die Luftblasen. Tauchen Sie ein weiteres Stück Blotting-Papier, legen Sie es über Sandwich-Setup und entfernen Sie Luftblasen.
- Vervollständigen Sie das Sandwich, indem Sie ein vornasses Faserpad über das Setup legen und die Kassette fest schließen.
- Legen Sie die Transblot-Kassette in das Modul und füllen Sie 1x TBE, pH 8,2 bis zur Blotting-Marke.
- Transfer bei 10 V, übernachtung bei 4 °C.
- Legen Sie die feuchte Membran nach der Übertragung auf ein Papierblatt und vernetzen Sie die RNA sofort durch Bestrahlung mit 254-nm UV-Licht (120.000 joules/cm2) mit der Membran. Der vernetzte Blot wird zur weiteren Hybridisierung vielleicht bei 4 °C gelagert.
6. Vorbereitung der radioaktiv markierten Sonde
- Entwerfen Sie eine Sonde, die vollständig komplementär zur kleinen RNA ist, die nachgewiesen werden soll.
- End etikettieren Sie die Sonde mit ƳP32ATP (von BRIT erhalten) am 5' Ende, indem Sie die Komponenten gemäß Rezept in Tabelle 1kombinieren.
- Inkubieren Sie das obige Reaktionsgemisch bei 37 °C für 30 min.
- Trennen Sie unbeschriftete ƳP32ATP von der Sonde, indem Sie eine Sephadex G-25-Säule gemäß dem Herstellerprotokoll verwenden.
7. Hybridisierung des Flecks
- Platzieren Sie den gekreuzten Fleck, die RNA-Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche.
- Den ultraempfindlichen Hybridisierungspuffer kräftig mischen, 10 ml dazugeben und den Fleck in einem Hybridisierungsofen bei 35 °C mit Rotation bebrüten.
- Führen Sie eine Vorhybridisierung für 20 min durch.
- Entfernen Sie die Flasche aus dem Ofen und fügen Sie die beschriftete Sonde vorsichtig in den Hybridisierungspuffer ein.
- Hybridisieren Sie den Fleck bei 35 °C, mit Drehung für 12 h.
- Übertragen Sie die Hybridisierungslösung nach der Hybridisierung sorgfältig in ein 15 ml-Rohr. Diese Lösung kann bis zur Wiederverwendung bei 4 °C gelagert werden.
- Führen Sie eine schnelle Wäsche des Blots für 2 min durch, um überschüssige Hybridisierungslösung zu entfernen, indem Sie 2x SSC-Puffer plus 0,5% SDS hinzufügen. Verwerfen Sie die Lösung.
- Inkubieren Sie den Blot mit 2x SSC Puffer plus 0,5% SDS für 35 °C, mit Drehung für 30 min.
- Waschen Sie den Blot erneut mit 0,5x SSC Puffer plus 0,5% SDS für 35°C, mit Drehung für 30 min.
- Legen Sie den Fleck in eine Hybridisierungsabdeckung, entfernen Sie den überschüssigen Puffer und versiegeln Sie ihn.
- Setzen Sie es über Nacht in einer Kassette einem strahlungsfreien Phosphor-Imager-Bildschirm aus.
- Erkennen Sie das Hybridisierungssignal mit biomolekularem Imager und analysieren Sie die Ergebnisse mit geeigneter Software.
- Entfernen Sie den Blot, indem Sie ihn bei 80 °C inkubieren, mit Drehung für 30 min mit 0,5 X SSC Puffer plus 0,1% SDS und 0,1 X SSC Puffer plus 0,1% SDS für 30 min.
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Representative Results
In dieser Demonstration haben wir die Expression von miR397 in verschiedenen Geweben von Indica-Reis var whiteponni nachgewiesen und quantifiziert (Abbildung 1). miR397 ist eine 22 nt miRNA und konservierte miRNA. Die Expression von miR397 kann in allen getesteten Proben nachgewiesen werden. Gemäß den Sequenzierungsdaten der nächsten Generation hat Probe 1 (Seedling Tissue) miR397 bei 5 Lesevorgängen pro Million (rpm). Wir haben sein Signal bequem erkannt, was darauf hindeutet, dass die Methode sehr empfindlich ist und verwendet werden kann, um auch sehr geringe reichliche miRNAs zu erkennen. In diesem Experiment haben wir miR168 und U6 als Ladesteuerungen verwendet.
In diesem Fleck (Abbildung 1) wurde die Stärke der Signale mit ImageJ quantifiziert. Der Ausdruck von miR397 ist am höchsten in vegetativen Blattscheide.
Abbildung 1: Detektion und Quantifizierung der Expression von miR397 in verschiedenen Geweben von Reisproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Puffer und Lösung | Rezept | Kommentare |
| 10 X TBE | 0,89 Mio. Tris-Puffer | pH sollte mit Essigsäure auf 8,2 eingestellt werden |
| 0,89 M Borsäure | ||
| 30mM EDTA | ||
| Gel-Mix | 15% Acrylamid-Bisacrylamid sol, 19:1 | Gelmischung sollte keine Harnstoffkristalle enthalten |
| 8M Harnstoff | ||
| 1X TBE | ||
| Gel-Ladefarbstoff | 0,05 %(w/v) Bromphenol blau | Beim Umgang mit deionisiertem Formamid ist Vorsicht geboten |
| 0,05 %(w/v) Xylol xyanol | ||
| 100 % deionisiertes Formamid | ||
| Kennzeichnung der Sonde | PNK-Puffer (10X, 2 l) | Dieses Gemisch enthält radioaktive Moleküle, dieser Schritt muss von geschultem Personell in einem radioaktiven Labor durchgeführt werden |
| PNK-Enzym (1 l) | ||
| Oligo (100 m, 0,1 l) | ||
| ƳP32 ATP (4 l) | ||
| Waschpuffer - I | 2X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Waschpuffer - II | 0.5X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - I | 0.5X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS | ||
| Stripping-Puffer - II | 0.1X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS |
Tabelle 1: Tabelle der Rezepte.
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Discussion
Diese Methode kann ausgiebig für die Detektion und Quantifizierung kleiner RNAs einschließlich weniger reichlich vorhandener miRNAs verwendet werden. Das Protokoll beschreibt hauptsächlich die Schritte zur Denaturierung der gesamten RNA in einem Ladepuffer, Größentrennung durch Gelelektrophorese, Übertragung von RNA auf eine Membran, Vernetzung der RNA auf Membran und Hybridisierung mit gewünschten radioaktiv markierten Oligosonden.
Der entscheidende Schritt für jedes Blotting-Experiment ist die Verwendung von hochwertiger RNA zur Probenvorbereitung. Vor dem Verladen der Gele muss man darauf achten, dass die Proben frei fließen und nicht an den Ladespitzen kleben. Beim Beladen der Probe ist Vorsicht geboten, die Spitze sollte direkt über der Unterseite des Brunnens eingesetzt werden, so dass die Probe eine dünne Schicht im Brunnen einnimmt. Die Temperatur des Hybridisierungsofens muss bei 35 °C gehalten werden, um miRNAs zu detektieren, die extrem seltener sind. Für eine wiederholte Hybridisierung von Blot, lagern Sie die Membran bei 4 °C, indem Sie sie feucht in 2x SSC halten.
Diese Methode kann verwendet werden, um kleine RNAs aus Geweben zu erkennen, die reich an Polysacchariden und Polyphenolen8sind. In diesem Protokoll bietet die Verwendung der Vakuumtrocknung zur Konzentration von RNA-Proben eine bessere Stabilität und weniger Probenverlust im Vergleich zu anderen älteren Methoden9. Andere Modifikationen in der Methode umfassen die Verteilung der Membran in Wasser vor dem Eintauchen in 1x TBE während der Elektroübertragung. Dies verbessert die Effizienz des RNA-Transfers und sorgt für eine bessere Auflösung von Blot.
Eine wesentliche Einschränkung der Methode ist die Verwendung von Radioisotopen, die geschultes Personal und ein Radioisotopenlabor benötigen, um die Hybridisierungsexperimente durchzuführen. Diese Methode enthält hier detaillierte Informationen zu allen Schritten der RNA-Blot-Analyse zum Nachweis von miRNAs. Dieses Protokoll stellt auch die Größe der kleinen RNA neben ihrer Signalerkennung10sicher. Die Technik bietet molekularbiologen ein robustes Werkzeug, um die Häufigkeit verschiedener kleiner RNAs wie miRNAs, sekundäre siRNAs und snoRNAs zu schätzen.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Die Autoren bestätigen den Zugang zum Strahlenlabor des Gastinstituts und BRIT für Radioisotope. PVS-Labor wird unterstützt vom National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research und Stipendien (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) vom Department of Biotechnology, Government of India. MP erkennt DBT-Research Associateship, DBT, Regierung von Indien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
