Summary
Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene uitgedrukte niet-codering, ~ 21 nt kleine RNAs die betrokken zijn bij de regulering van genexpressie in zowel planten als dieren. De meeste miRNAs fungeren als negatieve schakelaars van genexpressie gericht op belangrijke genen. In planten worden primaire miRNAs (pri-miRNAs) transcripties gegenereerd door RNA polymerase II, en ze vormen verschillende lengtes van stabiele stam-lusstructuren genaamd pre-miRNAs. Een endonuclease, Dicer-like1, verwerkt de pre-miRNAs tot miRNA-miRNA* duplexen. Een van de strengen van miRNA-miRNA* duplex wordt geselecteerd en geladen op Argonaute 1-eiwit of de homologs ervan om het decolleté van doelmrnas te bemiddelen. Hoewel miRNAs belangrijke signaalmoleculen zijn, wordt hun detectie vaak uitgevoerd door minder dan optimale PCR-gebaseerde methoden in plaats van een gevoelige noordelijke vlekanalyse. We beschrijven een eenvoudige, betrouwbare en uiterst gevoelige noordelijke methode die ideaal is voor de kwantificering van miRNA-niveaus met een zeer hoge gevoeligheid, letterlijk van elk plantweefsel. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte, stabiliteit en de overvloed aan miRNAs en hun precursoren te bevestigen.
Introduction
De recente ontdekking van kleine regulerende RNAs, microRNAs, heeft geleid tot onderzoek in het begrijpen van hen en hun rol in planten en dieren1. Lange voorlopers van miRNAs worden verwerkt tot 21 tot 24 nt volwassen miRNAs door HYL1 en specifieke dicer-achtige eiwitten2,3. Een miRNA van 22 nt kan cascade-uitschakeling initiëren door secundaire siRNAs4te genereren. Studies hebben aangetoond dat de rol van miRNAs en secundaire siRNAs in ontwikkeling, cellot en stress reacties5,6.
Noordelijke hybridisatie is een experimentele methode die routinematig wordt gebruikt om specifieke RNA-moleculen te detecteren. Deze methode past het gebruik ervan aan bij de detectie van ongeveer 19-24 nt lange kleine RNAs uit een pool van totale RNAs7. In deze demonstratie illustreren we het gebruik van deze techniek voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Deze methode maakt gebruik van de etikettering van sondes met behulp van radio-isotopen; zo kunnen miRNA-niveaus in het monster worden gedetecteerd met een verhoogde gevoeligheid. In tegenstelling tot pcr-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de expressie, alsmede de grootte bepaling van de miRNAs. In dit protocol laten we cruciale stappen zien die de miRNA-detectie verbeteren. We hebben stappen in blotting en hybridisatie aangepast voor het verkrijgen van hoge resolutie signaaldetectie van miRNAs. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor de detectie van andere endogene kleine RNAs zoals siRNAs, tasi-secundaire RNAs en snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van een 15% denaturering polyacrylamide gel
- Weeg en voeg 4,8 g ureum toe, voeg 3,75 mL acrylamide toe van 40% acrylamide: bisacrylamide (19:1) oplossing en 1 mL van 10x TBE pH 8.2 in een steriele 50 mL buis.
- Los het ureum op met een waterbad van 60 °C tot een duidelijke oplossing.
- Maak het volume op tot 10 mL met vers automatisch geautolaveerd steriel water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur.
- Bereid verse 10% (w/v) ammonium persulfate oplossing.
2. Montage van de glasplaten en elektroforese-eenheid
- Was alle apparaten die nodig zijn voor de gel elektroforese en elektro-blotting met wasmiddel. Voorzichtig schrobben ze met behulp van een zachte spons om de resterende buffer en acrylamide te verwijderen, afspoelen met water en laat ze drogen.
- Monteer beide glazen platen samen en leg ze stevig op de spons. Gebruik een 1 mm dikke plaat voor deze setup. Zorg ervoor dat de platen op hetzelfde niveau zijn om lekkage te voorkomen.
- Voeg aan de 10 mL gelmix 8 μL TEMED en 80 μL vers bereide 10% (w/v) ammoniumerfaatoplossing toe.
- Meng en giet dit onmiddellijk tussen de geassembleerde glasplaten. Plaats de kam voorzichtig. Vermijd het genereren van luchtbellen in deze stap.
- Laat de gel ongeveer 45 min polymeriseren.
- Was de gepolymeriseerde gel met steriel water voordat u de gellopende setup plaatst.
- Monteer de platen in de lopende cassette en verwijder de kam voorzichtig.
- Giet vers bereide steriele 1x TBE, pH 8.2 in de tank.
- Was de putten voorzichtig door de buffer te pipetten om zoutkristallen te verwijderen. Deze stap helpt het RNA-monster gelijkmatig over de gel te lopen.
- Voer een pre-run uit op 80 V gedurende 30 minuten.
3. Bereiding van ladingskleurstof en monsters
- Voor 10 mL gel laden kleurstof, wegen 5 mg bromofenol blauw, 5 mg xyleen cyanol, voeg 10 mL van gedeïmiseerde formamide zorgvuldig en meng ze goed.
- Aliquot 10 μg totaal RNA in een steriele buis van 1,5 mL en droog de monsters met behulp van een speedvac. Droog de monsters niet te droog.
- Resuspend de RNA monsters in 8 μL van het laden.
- Verwarm de monsters op 98 °C gedurende 2 min, koel gedurende 1 min af bij RT, draai de draaikolk en draai de monsters gedurende 3 keer. Deze stap is essentieel voor een goede resuspensie en op zijn beurt helpt dit bij gelijke belasting van de monsters.
4. Gel elektroforese
- Stop de pre-run en was de putten voordat het monster wordt geladen.
- Verwarm de monsters op 98 °C gedurende 1 min en laad de monsters heet in de put met capillaire uiteinden. Steek de punt aan de onderkant van de put, zodat het monster neemt een dunne laag in de put.
- Volledige lading van alle monsters. Opnemen om RNA decade marker te laden.
- Voer de gel op 80 V tot de bromophenol blauwe kleurstof loopt bijna volledig. Bromophenol blauw loopt op 10 bp in een 15% denaturering acrylamide gel.
5. Voorbereiding op elektroblotting
- Snijd het N+nylon membraan in de afmetingen van de glasplaat en label het membraan in de rechterbovenhoek met een HB-potlood.
- Plaats het membraan voorzichtig op het oppervlak van steriel water, met de gelabelde kant naar het wateroppervlak. Laat het membraan 15 minuten voor weken.
- Snijd 4 stukken van blotting papier I aan de afmetingen van vezel pad.
- Bereid de gelsandwich voor het plaatsen van de grijze kant van de cassette naar beneden in een schone lade.
- Maak het vezelpad nat en leg het over de cassette. Verwijder luchtbellen.
- Voorwet een stuk blotting papier in 1x TBE en plaats over de vezel pad. Verwijder luchtbellen door het rollen van een plastic pipet over het papier. Leg nog een stuk voorwett vloeipapier en verwijder luchtbellen.
- Verwijder de gel voorzichtig uit de lopende cassette en plaats deze over de sandwichsetup, zodat het eerste geladen RNA-monster naar rechts is.
- Dompel het voorweekte membraan voorzichtig onder in 1x TBE en leg het over de gel, met uitzicht op de geëtiketteerde kant naar beneden. Rol uit om de luchtbellen te verwijderen.
- Dompel een stuk blotting papier, leg het over het membraan, en verwijder de luchtbellen. Dip een ander stuk blotting papier, plaats het over sandwich setup en verwijder luchtbellen.
- Maak de sandwich compleet door een voornatte vezelpad over de setup te plaatsen en sluit de cassette stevig af.
- Plaats de transblot cassette in de module en vul 1x TBE, pH 8.2 tot aan de blotting merk.
- Transfer bij 10 V, 's nachts bij 4 °C.
- Plaats na overdracht het vochtige membraan op een papierblad en koppel het RNA onmiddellijk aan het membraan door bestraling met 254 nm UV-licht (120.000 μjoules/cm²). De cross-linked vlek misschien opgeslagen bij 4 °C voor verdere hybridisatie.
6. Voorbereiding van radioactief gelabelde sonde
- Ontwerp een sonde die volledig complementair is aan het kleine RNA dat moet worden gedetecteerd.
- Label de sonde met behulp van ƳP32ATP (verkregen van BRIT) aan het einde van 5' door de componenten te combineren volgens het in tabel 1opgenomen recept .
- Incubeer het bovenstaande reactiemengsel 37 °C gedurende 30 minuten.
- Afzonderlijke niet-geëtiketteerde ƳP32ATP van de sonde met behulp van een Sephadex G-25 kolom volgens het protocol van de fabrikant.
7. Hybridisatie van de vlek
- Plaats de gekruiste-gekoppelde vlek, RNA kant naar boven in een hybridisatie fles.
- Meng krachtig de ultragevoelige hybridisatiebuffer, voeg er 10 mL van toe en ontcubeer de vlek in een hybridisatieoven die op 35 °C wordt gehandhaafd, met rotatie.
- Voer pre-hybridisatie uit gedurende 20 minuten.
- Haal de fles uit de oven en voeg de gelabelde sonde voorzichtig in de hybridisatiebuffer.
- Verhybrial de vlek bij 35 °C, met rotatie voor 12 h.
- Na hybridisatie voorzichtig overbrengen van de hybridisatie oplossing in 15 mL buis. Deze oplossing kan tot het hergebruik bij 4 °C worden opgeslagen.
- Voer een snelle wasbeurt van de vlek voor 2 min om overtollige hybridisatie oplossing te verwijderen door het toevoegen van 2x SSC buffer plus 0,5% SDS. Gooi de oplossing weg.
- Incubeer de vlek met 2x SSC buffer plus 0,5% SDS voor 35 °C, met rotatie gedurende 30 min.
- Was de vlek opnieuw met een 0,5x SSC-buffer plus 0,5% SDS voor 35°C, met rotatie gedurende 30 min.
- Plaats de vlek in een hybridisatiedeksel, verwijder de overtollige buffer en verzegel deze.
- Stel het 's nachts bloot aan een stralingsvrij fosforbeeldscherm in een cassette.
- Detecteer het hybridisatiesignaal met behulp van biomoleculaire imager en analyseer de resultaten met behulp van geschikte software.
- Strip de vlek door het uit te broeden op 80 °C, met rotatie voor 30 min met 0,5 X SSC buffer plus 0,1% SDS en 0,1 X SSC buffer plus 0,1% SDS voor 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze demonstratie hebben we de expressie van miR397 ontdekt en gekwantificeerd in verschillende weefsels van indica rijst var whiteponni (figuur 1). miR397 is een 22 nt miRNA en geconserveerd miRNA. De expressie van miR397 kan worden gedetecteerd in alle geteste monsters. Volgens de volgende generatie sequencing gegevens, monster 1 (zaailing weefsel) heeft miR397 op 5 leest per miljoen (rpm). We ontdekten het signaal comfortabel, wat aangeeft dat de methode zeer gevoelig is en kan worden gebruikt om zelfs zeer lage overvloedige miRNAs te detecteren. In dit experiment hebben we miR168 en U6 gebruikt als beladingsregelaars.
In deze vlek (figuur 1), sterkte van de signalen werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De expressie van miR397 is het hoogst in vegetatieve bladmantel.
Figuur 1: Detectie en kwantificering van de expressie van miR397 in verschillende weefsels van rijstmonsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buffer en oplossing | Recept | Opmerkingen |
| 10 X TBE | 0,89M Tris buffer | pH moet worden ingesteld op 8,2 met azijnzuur |
| 0,89 M Boorzuur | ||
| 30mM EDTA | ||
| Gelmix | 15% acrylamide-bisacrylamide sol, 19:1 | Gelmix mag geen ureumkristallen bevatten |
| 8M ureum | ||
| 1X TBE | ||
| Gel laden kleurstof | 0,05 %(w/v) bromofenolblauw | Zorg moet worden genomen tijdens de behandeling van gedeïsized formamide |
| 0,05 %(w/v) Xyleen xyanol | ||
| 100% gedeïniseerd- formamide | ||
| Etikettering van de sonde | PNK-buffer (10x, 2 μL) | Dit mengsel bevat radioactieve moleculen, deze stap moet worden uitgevoerd door getrainde personel in een radioactief lab |
| PNK enzym (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0,1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| Wasbuffer - I | 2X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Wasbuffer - II | 0,5X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Strippen Buffer - I | 0,5X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS | ||
| Strippen buffer - II | 0,1X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS |
Tabel 1: Tabel met recepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor detectie en kwantificering van kleine RNAs, waaronder minder overvloedige miRNAs. Het protocol beschrijft voornamelijk de stappen voor het denatureren van het totale RNA in een laadbuffer, groottescheiding door gel elektroforese, overdracht van RNA naar een membraan, kruis-link het RNA op membraan en hybridiseren met behulp van de gewenste radiolabeled oligo sondes.
De cruciale stap voor elk blotting experiment is het gebruik van goede kwaliteit RNA voor monster voorbereiding. Voordat u de gels laadt, moet men ervoor zorgen dat de monsters vrij stromend zijn en niet aan de laadpunten kleven. Zorg moet worden genomen tijdens het laden van het monster, tip moet worden ingevoegd net boven de bodem van de put, zodat het monster neemt een dunne laag in de put. De temperatuur van de hybridisatieoven moet op 35 °C worden gehouden voor de detectie van miRNAs die zeer minder overvloedig zijn. Bewaar het membraan voor herhaalde hybridisatie van de vlek op 4 °C door het vochtig te houden in 2x SSC.
Deze methode kan worden gebruikt om kleine RNAs te detecteren uit weefsels die rijk zijn aan polysaccharides en polyfenolen8. In dit protocol zorgt het gebruik van vacuümdrogen voor het concentreren van RNA-monsters voor een betere stabiliteit en minder verlies van monster in vergelijking met andere oudere methoden9. Andere wijziging in de methode omvat, verspreiding van het membraan in water voordat dompelen in 1x TBE tijdens elektro-overdracht. Dit verbetert de efficiëntie van RNA-overdracht, waardoor een betere resolutie van deslot.
Een belangrijke beperking van de methode is het gebruik van radio-isotopen, die opgeleid personeel en een radio-isotooplab nodig heeft om de hybridisatie-experimenten uit te voeren. Deze methode geeft hier gedetailleerde informatie over alle stappen die betrokken zijn bij de RNA-vlekanalyse voor de detectie van miRNAs. Dit protocol zorgt ook voor de grootte van het kleine RNA, afgezien van de signaaldetectie10. De techniek biedt een robuust hulpmiddel voor moleculaire biologen om de overvloed aan verschillende kleine RNAs zoals miRNAs, secundaire siRNAs en snoRNAs te schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de toegang tot stralingslab die door het gastinstituut en BRIT voor radio-isotoop wordt verstrekt. PVS laboratorium wordt ondersteund door National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) van het Department of Biotechnology, Regering van India. MP erkent DBT-Research Associateship, DBT, Regering van India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
