Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Summary

We beschrijven een single-molecule benadering van antigeen-antilichaam affiniteit metingen met behulp van massa fotometrie (MP). Het MP-gebaseerde protocol is snel, nauwkeurig, gebruikt een zeer kleine hoeveelheid materiaal en vereist geen eiwitmodificatie.

Abstract

Metingen van de specificiteit en affiniteit van antigeen-antilichaam interacties zijn van cruciaal belang voor medische en onderzoekstoepassingen. In dit protocol beschrijven we de implementatie van een nieuwe single-molecule techniek, massa fotometrie (MP), voor dit doel. MP is een label- en immobilisatievrije techniek die moleculaire massa's en populaties van antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen op één molecuulniveau detecteert en kwantificeert. MP analyseert het antigenantilichaammonster binnen enkele minuten, waardoor de bindingsaffiniteit nauwkeurig kan worden bepaald en tegelijkertijd informatie kan worden verstrekt over de stoichiometrie en de oligomeric toestand van de eiwitten. Dit is een eenvoudige en eenvoudige techniek die alleen picomole hoeveelheden eiwit en geen dure verbruiksgoederen vereist. Dezelfde procedure kan worden gebruikt om eiwit-eiwitbinding te bestuderen voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kDa. Voor multivalente eiwitinteracties kunnen de affiniteiten van meerdere bindingsplaatsen in één meting worden verkregen. Echter, de single-molecule wijze van meting en het ontbreken van etikettering legt een aantal experimentele beperkingen. Deze methode geeft de beste resultaten wanneer toegepast op metingen van sub-micromolar interactie affiniteiten, antigenen met een moleculaire massa van 20 kDa of groter, en relatief zuivere eiwitmonsters. We beschrijven ook de procedure voor het uitvoeren van de vereiste montage- en berekeningsstappen met behulp van basisgegevensanalysesoftware.

Introduction

Antilichamen zijn alomtegenwoordige instrumenten van moleculaire biologie geworden en worden op grote schaal gebruikt in zowel medische als onderzoekstoepassingen. In de geneeskunde zijn ze van cruciaal belang in de diagnostiek, maar hun therapeutische toepassingen worden ook uitgebreid en nieuwe op antilichamen gebaseerde therapieën worden voortdurend ontwikkeld^1,2,3,4. De wetenschappelijke toepassingen van antilichamen omvatten vele onmisbare laboratoriumtechnieken zoals immunofluorescentie^5,immunoprecipitatie⁶, stroomcytometrie^7,ELISA en westerse blotting. Voor elk van deze toepassingen is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van de bindende eigenschappen van het antilichaam, inclusief bindende affiniteit en specificiteit, van cruciaal belang.

Sinds de introductie van het eerste commerciële oppervlakteplasmon resonantie (SPR) instrument in 1990 zijn optische biosensoren de "gouden standaard" van antilichaamkarakterisering geworden, maar andere technieken, waaronder ELISA, worden ook routinematig gebruikt om antilichaamaffinities^8,9te meten . Deze methoden vereisen meestal immobilisatie of etikettering van de geanalyseerde moleculen, die mogelijk van invloed kunnen zijn op de interactie van belang. Ze zijn ook relatief traag, waarbij meerdere teststappen voordat de resultaten kunnen worden verzameld voor gegevensanalyse. Een onlangs ontwikkelde single-molecule methode, massa fotometrie (MP), detecteert moleculen direct in oplossing wanneer ze landen op het oppervlak van de microscoop coverslip^10,11. De op lichtverstrooiing gebaseerde optische detectie die MP gebruikt, vereist geen eiwitlabeling of modificatie. Individuele eiwitmoleculen worden geregistreerd door de interferometrische verstrooiingsmicroscoop als donkere vlekken die in de afbeelding verschijnen(figuur 1D), en enkele duizenden moleculen kunnen worden gedetecteerd tijdens de data-acquisitie van één minuut¹². Het signaal dat door elk afzonderlijk deeltje wordt gegenereerd, wordt gekwantificeerd en de contrastwaarde (relatieve duisternis) wordt berekend. De interferometrische contrastwaarden zijn evenredig aan de moleculaire massa's van de eiwitten, waardoor gebonden en vrije soorten in het antigeen-antilichaammengsel kunnen worden geïdentificeerd. Tegelijkertijd meet MP door moleculaire landingsgebeurtenissen te tellen rechtstreeks de soortenpopulaties. Dit geeft MP gebaseerde methoden een unieke mogelijkheid om onafhankelijk te kwantificeren affiniteiten van meerdere bindende sites.

Binding van de antigeen (Ag)moleculen aan de twee bindende plaatsen van het intacte antilichaam (Ab) kan worden omschreven als:

met de evenwichtsassociatie constanten K_a1 en K_a2 gedefinieerd als:

waar c_i en f_i respectievelijk concentratie en fractie van het onderdeel ivertegenwoordigen. De totale antigeenconcentratie (c_Ag)_tot kan worden uitgedrukt als:

Aangezien de totale concentraties van het antilichaam (c_Ab)_tot en antigeen (c_Ag)_tot bekend zijn, kan deze vergelijking worden gebruikt om rechtstreeks te passen bij de experimentele componentfracties verkregen uit de MP-metingen en de evenwichtsstifies K_a1 en K_a2 te berekenen (zie Aanvullende informatie).

De MP-gegevens kunnen ook worden gebruikt om de samenwerking tussen de twee antilichaambindende sites¹¹te schatten . Voor twee antilichaamparatopes met identieke microscopische bindende constanten, de statistische factoren die het proces van bevolking van Abbeschrijven · Ag en Ab· Ag₂ complexen dicteren dat de schijnbare macroscopische evenwichtsconstanten K_a1 en K_a2 zal niet numeriek gelijk zijn, en K_a1 = 4K_a2. Daarom wijzen de experimentele waarden van K_a1 < 4K_a2 op een positieve samenwerking tussen de twee antilichaambindingslocaties. K _a1 > 4K_a2 geeft ook negatieve samenwerking aan.

MP-metingen van de antigeen-antilichaambinding zijn snel en vereisen een kleine hoeveelheid materiaal. De MP-massaverdelingen die worden gebruikt voor evenwichtsconstante berekeningen bieden aanvullende informatie over de eigenschappen van het monster en maken de beoordeling van de monsterzuiverheid, oligomerisatie en aggregatie in één experiment mogelijk. Dezelfde methode kan worden gebruikt om hoge affiniteit eiwit-eiwit binding te meten, en MP is vooral nuttig voor studies van multi-valent eiwit interacties. Multi-eiwit complexen hebben meestal grote moleculaire massa's, optimaal voor MP detectie, en single-molecule gegevens kunnen worden gebruikt om stoichiometrie te meten en affinities van meerdere bindende sites tegelijk te berekenen. Deze informatie is meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van bulk-gebaseerde methoden.

Zonder wijzigingen is het huidige protocol geschikt voor metingen van relatief hoge affiniteit, submicromolar interacties met antigenen van een moleculaire massa van 20 kDa of groter. Voor optimale resultaten moeten eiwitvoorraden van hoge zuiverheid zijn, maar er zijn geen specifieke buffervereisten. Door mp te gebruiken, kan de antigeen-antilichaambinding in minder dan vijf minuten worden beoordeeld. Het verzamelen en analyseren van gegevens die nodig zijn voor nauwkeurige K_{d-berekeningen} kan binnen 30 minuten worden uitgevoerd.

Protocol

1. Bereid de stroomkamers voor

1. Maak de glazen hesjes schoon
   1. Met behulp van wasflessen met gedestilleerd water, ethanol en isopropanol, spoel de 24 mm x 50 mm covers in de volgende volgorde: water, ethanol, water, isopropanol, water. Droog de coverslips met een stroom van schone stikstof. Het is belangrijk om de coverslips van boven naar beneden te spoelen, waarbij de onderste hoek met zachte tangen wordt vastgehouden. Droog de afdekken in dezelfde richting om besmetting van de tangen te voorkomen (figuur 2A).
   2. Spoel ook de 24 mm x 24 mm coverslips af met gedestilleerd water, ethanol en gedestilleerd water. Droog de coverslips met een stroom van schone stikstof.
   3. Identificeer de werkzijde van de coverslip, plaats een druppel gedestilleerd water op het oppervlak van de schone coverslip en volg de stappen 3.1–3.2 van het protocol. Meestal slechts een kant van de 24 mm x 50 mm coverslip heeft de optische kwaliteit geschikt voor MP metingen.
      OPMERKING: Na het scherpstellen mogen er geen significante oppervlakteonvolkomenheden worden gedetecteerd en moet de "signaal"-waarde in de software voor het verzamelen van gegevens minder dan 0,05% bedragen(figuur 1A-C). De werkende kanten van alle coverslips in de doos zijn in dezelfde richting georiënteerd. Dezelfde procedure moet worden gebruikt om de efficiëntie van de coverslip reiniging te testen.
2. De stroomkamer monteren
   1. Plaats de 24 mm x 24 mm coverslip op een stuk aluminiumfolie. Plaats stroken dubbelzijdige tape bovenop de 24 mm x 24 mm coverslip zoals afgebeeld in figuur 2B en snijd de tape langs de rand van het glas. Scheid de coverslip van de aluminiumfolie en bevestig deze aan de werkzijde van de 24 mm x 50 mm coverslip (figuur 2C).
      LET OP: De kanaalgrootte kan variëren, maar een breedte van 3 mm–5 mm wordt aanbevolen. Bredere kanalen vereisen grotere steekproefvolumes en zeer smalle kanalen kunnen moeilijk te laden zijn. Meestal kunnen twee parallelle kanalen eenvoudig worden gemaakt op de 24 mm x 24 mm coverslip. Protocol kan hier worden onderbroken.

2. Bereid de antilichaam-antigeenmonsters voor op de affiniteitsmetingen

1. Filter ten minste 2 mL van de PBS-buffer met 0,22 μm spuitfilters om stofdeeltjes of aggregaten te verwijderen. Centrifugeren de eiwitvoorraad gedurende 10 minuten bij de maximale snelheid van de centrifuge van het tafelblad (ongeveer 16.000 x g).
   OPMERKING: PBS is de aanbevolen buffer voor dit protocol, maar MP heeft geen specifieke buffervereisten en andere biologische buffers zijn ook aanvaardbaar. Hoge glycerolconcentraties (>10%) en zeer lage ionische sterktes (zoutconcentratie <10 mM) kunnen de beeld- en gegevenskwaliteit beïnvloeden en worden niet aanbevolen.
2. Bepaal de werkelijke concentraties van de antilichaam- en antigeenvoorraden door hun 280 nm UV-absorptie te meten.
3. Bereken de meetconcentraties van het antigeen-antilichaammengsel. Als de geschatte waarde van de antilichaambindende affiniteit niet bekend is, plan dan om een monster te bereiden met 30 nM-antigeen en 20 nM-antilichaamconcentratie. Wanneer de geschatte affiniteit bekend is, moeten het antilichaam tegen antigeenverhouding en hun concentraties worden geoptimaliseerd op basis van de verwachte K_d-waarden. Gebruik de totale antigeenconcentratie in het mengsel gelijk aan de som van de verwachte K_d en de totale concentratie van antilichamen in de onderstaande vergelijking. Uitgaande van K_d1 = K_d2 voor de twee paratopen van het antilichaam, zal dit resulteren in vergelijkbare concentraties van het vrije antilichaam en de antilichaam-antigeencomplexen in het monster.
   
   Pas de concentratie van antilichamen aan om de totale eiwitconcentratie in het monster binnen het bereik van 10 nM en 50 nM te houden. De beste resultaten worden verkregen met behulp van mengsels met antilichaamconcentraties tussen 5 nM en 25 nM.
   OPMERKING: MP detecteert eiwitten met een moleculaire massa groter dan 40 kDa. Bijgevolg kunnen monsterconcentraties van antigenen met een moleculaire massa kleiner dan 40 kDa de typische 50 nM-limiet overschrijden. Bij concentraties hoger dan ongeveer 100 nM kunnen zelfs lage moleculaire massaantigenen echter de beeldkwaliteit en nauwkeurigheid van de K_d-bepaling beïnvloeden.
4. Bereid 50 μL van het antilichaam-antigeenmengsel voor bij de uiteindelijke meetconcentratie, berekend in stap 2.3.
   OPMERKING: Voor de K_d-bepaling is slechts één monster van het antigeen-antilichaammengsel vereist. Het voorbereiden van verschillende monsters met verschillende antigeen-antilichaamverhoudingen kan echter helpen bij het optimaliseren van de monsterconcentratie. Als gegevens van meerdere monsters worden verzameld, kunnen ze worden geanalyseerd via een globale pasvorm.
5. Het antigeen-antilichaammengsel(s) ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden om de bindingsreactie in staat te stellen het chemische evenwicht te bereiken. Vermijd onnodig lange incubatietijden.
   OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de bindende kinetiek. Om te bevestigen dat het chemische evenwicht is bereikt, kunnen steekproefmetingen op verschillende incubatietijden worden herhaald. Time-invariant K_d-waarden geven voldoende lange incubatie aan. Langdurige incubatie kan leiden tot aanzienlijke eiwitadsorptie aan het oppervlak van het plastic labware en bijgevolg tot aanzienlijke fouten in de bepaling van de eiwitconcentratie. Om deze reden wordt labware met een lage hechting sterk aanbevolen voor MP-monstervoorbereiding¹³.

3. Verzamel de massafotometriegegevens

1. Breng een druppel microscoop onderdompelingsolie aan op de MP-instrumentdoelstelling en plaats de geassembleerde stroomkamer op het microscoopstadium. Zorg ervoor dat de olie de kloof tussen de coverslip en het doel omspant.
2. Laad de stroomkamer en focus de massafotometer.
   1. Deponeren 10 μL van een schone, gefilterde bufferoplossing aan het ene uiteinde van het kanaal van de stroomkamer dat in stap 1 is voorbereid. Vloeistof zal het kanaal binnendreeen door capillaire actie.
   2. Pas de Z-positie van de stage aan om de microscoop te richten op het werkoppervlak van de 24 x 50 mm coverslip.
      1. Gebruik op het tabblad Focusbeheer van de software voor het verzamelen van gegevens de grof gefasede beweging Omhoog en Omlaag om de eerste aanpassingen te maken.
      2. Klik op de knop Scherpte om de uitlezing van het scherptesignaal weer te geven en gebruik de fijne aanpassingsknoppen Omhoog en Omlaag om de scherptewaarde te maximaliseren.
      3. Klik op de knoppen Focus en Focus instellen om de focustrackingfunctie te activeren. Een goed gericht beeld (figuur 1A,C) moet de "signaal" waarde onder 0,05% hebben.
         OPMERKING: Als de "signaal"-waarde op de maximale scherptepositie boven 0,05% ligt, kan dit duiden op onzuiverheden op het glasoppervlak of in de buffer.
3. Met behulp van hetzelfde kanaal laad je 20 μL van het antilichaam-antigeenmonster door het aan de ene kant van het kanaal te deponeren en de vloeistof van het andere uiteinde te besmloten met een klein stukje vloeipapier(figuur 2D).
   LET OP: Het volume van een 3-5 mm breed kanaal is ongeveer 10 μL. Het extra monstervolume wordt aanbevolen om de in het kanaal aanwezige buffer volledig te vervangen en monsterverdunning te voorkomen.
4. Na het laden van het monster, onmiddellijk op de knop Opnemen om te beginnen met het verzamelen van gegevens, het verwerven van een 100 s video (Figuur 1D).
5. Voer aan het einde van de gegevensverzameling de bestandsnaam in en klik op OK om het gegevensbestand op te slaan.
6. Gooi de coverslips weg en veeg de olie van de objectieve lens met wattenstaafjes nat met isopropanol.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

4. Analyseer de MP-gegevens

1. Verwerk het verzamelde videobestand met behulp van de MP-gegevensverwerkingssoftware om de landingsgebeurtenissen te identificeren.
   1. Gebruik de menuoptie Bestand/Openen om het bestand voor de analyse te laden en klik op Analyseren.
   2. Klik op de knop Laden om de kalibratiefunctie te laden en sla de geanalyseerde gegevens op met de menuoptie Resultaten bestand/opslaan als.
2. Pas de moleculaire massaverdeling aan met Gaussische functies om relatieve concentraties van elke soort in het monster te verkrijgen. Deze analyse kan worden uitgevoerd met behulp vaneen gemeenschappelijke wetenschappelijke grafische software (zie Tabel van materialen ).
   1. Importeer het bestand 'eventsFitted.csv' in de software en plot de moleculaire massaverdeling (kolom M in het .csv-bestand) met behulp van de functie Plot/Statistieken/Histogram.
   2. Dubbelklik op het histogram om het venster Ploteigenschappen te openen. Schakel automatische binning uit en selecteer een opslaglocatiegrootte van 2,5 kDa. Klik op de knoppen Toepassen en Ga om de gegevens Bin Centers and Counts te maken.
   3. Selecteer de kolommen Bin Centers and Counts en gebruik de menufunctie Analysis/Peaks en Baseline/Multiple Peak Fit om het histogram te passen bij Gaussian-functies. Dubbelklik om de geschatte piekposities op het distributieperceel aan te geven en klik vervolgens op de knop NLFit openen.
   4. Controleer de vaste selectievakjes voor de "xc" piekcentra en stel hun waarden in op de verwachte moleculaire massa's van het vrije antilichaam en de enkele en dubbele antigeen-antilichaam complexen. Controleer de optie Delen op de breedteparameters. Klik op de knop Aanpassen. De ingerichte piekhoogtewaarden van de Gaussische componenten vertegenwoordigen de relatieve concentratie van elke soort in het monster¹¹.
      OPMERKING: De opslaglocatiegrootte kan worden aangepast om de resolutie van het massadistributieperceel te optimaliseren. De MP-precisielimiet is ongeveer 1 kDa en kleinere bakgroottes kunnen het geluid van de distributie versterken, zonder extra informatie te onthullen. Zeer grote bak maten zal verduisteren de fijne details van massaverdelingen.
3. Bereken de concentratiefractie van elke soort aan de hand van de volgende vergelijking:
   
   wanneer de waarden h_i en f_i respectievelijk piekhoogten en concentratiefracties van het vrije antilichaam en het enkel- en dubbelgebonden antilichaam in het monster vertegenwoordigen.

5. Bereken evenwichtsconstante waarden

1. Pas de concentratiefracties van de interactiesoorten die in stap 4.3 met Eq. 1 en 2 zijn berekend met behulp van een geschikte analytische software. Hier demonstreren we een methode om evenwichtsconstanten te berekenen met behulp van een spreadsheetprogramma¹⁴ (zie Aanvullende informatie).
   1. Open het werkblad 'Kd-berekening.xlsx'. In dit werkblad kunnen de celwaarden in de in geel gemarkeerde rijen 1 tot en met 10 worden gewijzigd om de berekeningen van de evenwichtsconstanten uit te voeren.
   2. Voer de geschatte K_d-waarden in nanomolar-eenheden in de cellen B1 en B2 in de tabel in. Deze startwaarden worden geoptimaliseerd in de montageprocedure. Als de geschatte K_d-waarden niet bekend zijn, blijven de standaardwaarden in de cellen B1 en B2 ongewijzigd.
   3. Voer de waarden van (c_Ab)_tot en (c_Ag)_tot in nanomolar-eenheden in de cellen D2 en E2 in. Voer de breukwaarden in die in stap 4.3 zijn berekend in de cellen F2, G2 en H2. Indien meerdere monsters met verschillende concentratieverhoudingen worden gemeten, kunnen in rijen 2 tot en met 10 extra concentratiewaarden worden ingevoerd.
   4. Selecteer de menufunctie Gegevens/Oplosser. Typ '$B$15' in het vak 'Objectief instellen' en '$B$1:$B$2' in het vak 'Variabele cellen wijzigen:' Selecteer de knop Min-keuzerondje voor de optie Aan: Schakel het selectievakje Niet-negatieve variabelen maken en selecteer GRG Nonlinear als oplosmethode. Klik op de knop Oplossen. De beste K_d1- en K_d2-waarden worden weergegeven in cel B1 en B2 en de uiteindelijke som van vierkante fouten in cel B15.
      OPMERKING: Als de functie Oplosser niet actief is, selecteert u Opties onder het menu Bestand in het spreadsheetprogramma. Selecteer in de categorie Invoegtoepassingen de invoegtoepassing Oplosser onder de invoegtoepassingen voor inactieve toepassingen en klik op de knop Ga. Schakel het selectievakje Invoegtoepassing op solver in en klik op OK.

Figuur 1: Massa fotometrie beelden. (A) Representatieve native view beeld van de beeldvorming buffer verzameld op een schone coverslip en (B) op een coverslip met oppervlakte onvolkomenheden. (C) Differentiële ratiometrische beeld van de beeldverffer en (D) de AHT· HT-oplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: MP flow chamber voorbereiding en laden. a) De positie van coverslip voor de reinigingsprocedure. (B) Uitlijning van de 24 x 24 mm coverslip (middelste laag) en de dubbelzijdige tape (bovenste laag) op het oppervlak van aluminiumfolie (onderste laag, niet getoond). Blauwe stippellijnen tonen de locatie van snijlijnen. (C) Boven- en zijaanzicht van de geassembleerde stroomkamer met twee monsterkanalen en een afbeelding van de geassembleerde stroomkamer. (D) Procedure voor het laden van monsters in een stroomkanaal dat eerder met buffer was gevuld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Representative Results

We hebben eerder onderzocht de interactie van de menselijke α-trombin (HT) en muis monoklonale anti-menselijke trombine antilichaam (AHT) met behulp van de MP gebaseerde test¹¹. Aangezien de moleculaire massa van de HT (37 kDa) onder de detectiegrens van 40 kDa ligt, kan de maximale steekproefconcentratie de concentratiebeperking van 50 nM MP overschrijden zonder de resolutie van massaverdelingen negatief te beïnvloeden. Het experiment was gepland als een titratieserie met het AHT-antilichaam bij een vaste concentratie van 25 nM en de HT bij concentraties van 7,5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM en 120 nM. Figuur 3 toont de moleculaire massaverdelingen van de antigeen-antilichaammengsels en het monster alleen antilichamen. Hier analyseren we de gegevens met behulp van de methode beschreven in het protocol. Een wetenschappelijke grafische software werd gebruikt om de massadistributies te passen met drie Gaussische componenten die de gratis AHT, AHT· HT en AHT· HT₂. De bekende moleculaire massawaarden van de drie componenten werden vastgesteld en voor de drie soorten werd één piekbreedteparameter aangebracht. Best-fit piekhoogte parameters van de Gaussische componenten werden genormaliseerd met behulp van Eq. 3 om soorten concentratie fracties te verkrijgen (Tabel 1). Deze waarden, samen met de totale concentratie van antilichamen en antigeen voor elk monster, werden opgenomen in de "Kd-berekening.xlsx". De globale pasvorm in de spreadsheet levert K_d1 = 40 nM (68,3% betrouwbaarheidsinterval: 28 nM, 68 nM) en K_d2 = 28 nM (68,3% betrouwbaarheidsinterval: 17 nM, 45 nM). De experimentele concentratiefracties en de fitresultaten zijn uitgezet in figuur 4. De hier verkregen dissociatieconstante waarden door de geïntegreerde concentratiefracties te monteren, zijn in overeenstemming met die welke eerder zijn verkregen door rechtstreeks te passen aan mp-distributies, en met dissociatieconstante waarden verkregen door Isothermal Titration Calorimetry (ITC)¹¹.

Figuur 3: MP moleculaire massaverdelingen van de 25 nM AHT gemengd met HT op respectievelijk 0, 7,5, 15, 30, 60 en 120 nM (A-F). Zwarte stippen tonen de experimentele MP-gegevens uitgezet met 2,5 kDa bin grootte. Cyaan, groene en blauwe lijnen vertegenwoordigen de best passende Gaussische distributies van het vrije antilichaam, enkele gebonden antilichaam, en dubbele gebonden antilichaam soorten, respectievelijk. Rode lijnen tonen de som van de drie Gaussische componenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Fracties van de gratis AHT (blauw), AHT· HT (rood), en AHT· HT₂(zwart) als functie van HT-concentratie. De punten vertegenwoordigen experimentele waarden die uit de Montage Gaussian van de MP distributies worden verkregen. Vaste lijnen vertegenwoordigen de best-fit met eq. 1 en Eq. 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Technische replica's van de AHT moleculaire massadistributiemetingen. Plots toont de reproduceerbaarheid van de MP-metingen en de zuiverheid van het antilichaampreparaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Ab conc (M)	Ag conc (M)	f_Ab	f_AbAg	f_AbAg2
2.50E-08	7.50E-09	0.88	0.10	0.02
2.50E-08	1.50E-08	0.81	0.15	0.04
2.50E-08	3.00E-08	0.72	0.21	0.07
2.50E-08	6.00E-08	0.27	0.37	0.35
2.50E-08	1.20E-07	0.05	0.23	0.72

Tabel 1: Genormaliseerde piekhoogten van Gaussische componenten verkregen door montage van de MP-distributies (figuur 3).

Aanvullende informatie: Implementatie van het evenwichtsconstantesmontageprocedure in het berekeningswerkblad Excel en Affinity. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het op massafotometrie gebaseerde protocol dat hier wordt beschreven, biedt een snelle en nauwkeurige methode voor het meten van antigeen-antilichaambindingsafdijningen. MP-analyse maakt gebruik van een zeer kleine hoeveelheid materiaal, en aanvullende informatie, waaronder stoichiometrie, oligomerisatie en zuiverheid, kan worden beoordeeld aan de hand van dezelfde gegevens(figuur 5). Zonder wijzigingen is deze methode van toepassing op de metingen van dissociatieconstanten in het ongeveer 5 nM tot 500 nM-bereik, en voor ligandmoleculen met moleculaire massa van ongeveer 20 kDa of groter. Hetzelfde protocol kan niet alleen worden gebruikt om de antigeen-antilichaam binding te analyseren, maar ook om eiwit-eiwit interactie affiniteiten te meten wanneer de moleculaire massa van ten minste een van de bindende partners groter is dan 50 kDa. Aangezien de MP-detectie niet-specifiek is, kunnen MP-metingen niet worden uitgevoerd op monsters die een hoge concentratie dragereiwitten of grote moleculaire massaonzuiverheden bevatten.

SPR wordt vaak gebruikt voor de karakterisering van de antigeen-antilichaam binding, en directe vergelijking van beide methoden kan helpen bij de test selectie. In vergelijking met SPR is de MP-bindingstest sneller en vereist het geen eiwitimmobilisatie. Voor een typisch bindend experiment vereist de MP minder materiaal dan SPR. MP-gegevens onthullen de stoichiometrie van de complexen die niet direct beschikbaar is van de SPR^10,11. Kinetische bindingsparameters kunnen worden verkregen uit de MP-gegevens^13,maar SPR meet de bindende kinetiek rechtstreeks en is in staat om een breder scala van associatie- en dissociatiepercentages te meten. De associatieconstanten van twee afzonderlijke bindingssites kunnen alleen worden verkregen uit de SPR-gegevens wanneer de associatie- en dissociatiepercentages van beide sites voldoende verschillend zijn. Aan de andere kant kan de MP moleculaire complexen nauwkeurig karakteriseren met meerdere bindingsplaatsen^10,11. SPR is in staat om bindende affiniteit te meten voor kleine moleculaire massa liganden, en MP werkt het beste voor liganden met moleculaire massa van ongeveer 20 kDa of groter.

Het verzamelen van MP-gegevens van goede kwaliteit is een cruciale stap in het verkrijgen van nauwkeurige resultaten van dit protocol. Onzuiverheden in de buffer of op het oppervlak van de coverslips zullen het verzamelen van MP-gegevens verstoren. Onjuiste scherpstelling verstoort het MP-signaal dat leidt tot fouten in moleculaire massaschattingen en evenwichtsconstantenberekeningen. Beide factoren moeten worden onderzocht bij het oplossen van problemen met het protocol. Een belangrijke overweging bij het werken met eiwitoplossingen met een lage concentratie is dat oppervlakteadsorptie kan leiden tot het verlies van materiaal en veranderingen in de monsterconcentratie. De resulterende fouten kunnen worden geminimaliseerd door het gebruik van lage adsorptie labware en door het toepassen van oppervlakte passivatie. Om nauwkeurige resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om alle eiwitverdunningen en mengsels in het chemische evenwicht te laten komen, maar onnodig lange incubatietijden moeten worden vermeden. Voor elk eiwitsysteem wordt aanbevolen de tarieven van de niet-specifieke eiwitbinding aan het coverslipglas te beoordelen op de MP-gegevens. Als voor verschillende soorten aanzienlijk verschillende percentages worden waargenomen , kunnen MP-gegevens gemakkelijk worden gecorrigeerd om mogelijke fouten in de K_{d-berekeningen} ^10,11te voorkomen .

Bij de planning van de monstervoorbereiding moet rekening worden gehouden met verschillende factoren. Nauwkeurige resultaten kunnen worden verkregen door één monster te meten, maar de antigeen- en antilichaamconcentraties moeten worden aangepast om een vergelijkbare concentratie van de vrije en gebonden soorten te verkrijgen. Analyse van een enkele massaverdeling die wordt gedomineerd door een van de reactiesoorten kan aanvaardbare ramingen van de K_d-waarden opleveren , maar levert meestal relatief grote montagefouten op¹¹. Een alternatieve strategie omvat een wereldwijde analyse van titratiegegevens. De spreadsheet software gebaseerde montage tool die met dit protocol kan worden gebruikt voor het monteren van zowel individuele gegevens en voor wereldwijde analyse. Als één experiment of gegevensset wordt geanalyseerd, kunnen de betrouwbaarheidsintervallen van best-fit parameters worden geschat met behulp van de foutprojectiemethode. Een gedetailleerde beschrijving van de betrouwbaarheidsintervallen berekeningsprocedure in de spreadsheetsoftware wordt elders verstrekt¹⁴. Bij het ontwerpen van de test wordt aanbevolen om experimenten te plannen. Wanneer gegevens uit repliceren experimenten worden geanalyseerd, kan standaarddeviatie worden gebruikt om fouten van de K_d-waarden te melden.

Het hier beschreven protocol kan worden aangepast om de toepasbaarheid ervan uit te breiden tot buiten de typische moleculaire massa- en affiniteitsbereikbeperkingen. Het bereik van meetbare affiniteiten wordt beperkt door het eiwitconcentratiebereik dat toegankelijk is voor MP, meestal van 10 nM tot 50 nM. Dit bereik kan worden uitgebreid en eiwitmonsters bij concentraties onder de 10 nM kunnen worden gemeten met behulp van geperfundeerde stroomcellen en langere data-acquisitietijden. Eiwitmonsters bij hogere concentraties kunnen mogelijk worden gemeten met behulp van passivated coverslips voor de MP-metingen. Voor antigenen met een kleine moleculaire massa worden de vrije antilichaam- en antigeen-antilichaamcomplexe pieken in de MP-massaverdelingen onopgelost. Dit sluit het gebruik van de gaussische piekfittingsanalyse zoals beschreven in het protocol uit. In dat geval kan de bindende affiniteit nog steeds worden gemeten door het antilichaam te titreren met het antigeen en de MP-distributies te gemiddeld te laten werken om de gemiddelde moleculaire massa van alle soorten voor elk monster te verkrijgen. De bindende vergelijking kan dan aan deze gegevens worden aangepast om de antigeen-antilichaambindende affiniteit¹¹te verkrijgen .

Wanneer nauwkeurige affiniteitsinformatie niet nodig is, kan het protocol worden vereenvoudigd en gebruikt voor snelle antilichaam interactiescreening. In dat geval kunnen de commercieel verkrijgde pakkingputten worden gebruikt in plaats van monsterkanalen om de experimentele procedure verder te vereenvoudigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering