Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

Summary

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Abstract

Somitogenez, omurgalı embriyonik gelişiminin bir işaretidir. Yıllardır, araştırmacılar bu süreci ex vivo ve in vitro yaklaşımları kapsayan çok çeşitli teknikler kullanarak çeşitli organizmalarda inceliyorlar. Bununla birlikte, çoğu çalışma hala iki boyutlu (2D) görüntüleme verilerinin analizine dayanmaktadır, bu da karmaşık bir 3D alanda oldukça dinamik etkileşimler içeren eksenel genişleme ve somitogenez gibi gelişimsel bir sürecin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sınırlar. Burada, bu gelişimsel süreçlerde yer alan hücreleri (örneğin, nöromezodermal progenitörler) incelemek için fare canlı görüntüleme elde etme, veri kümesi işleme, görselleştirme ve 3D ve 4D olarak analiz etme tekniklerine izin veren teknikleri açıklıyoruz. Ayrıca, fare embriyolarında optik projeksiyon tomografisi ve tam montajlı immünofloresan mikroskopisi için adım adım bir protokol sağlıyoruz (numune hazırlamadan görüntü elde etmeye kadar) ve 3D görüntü verilerini işlemek ve görselleştirmek için geliştirdiğimiz bir boru hattını gösteriyoruz. Bu tekniklerden bazılarının kullanımını genişletiyoruz ve eksenel genişleme ve somit oluşumu (örneğin, 3D rekonstrüksiyonlar) hakkındaki mevcut anlayışımızı geliştirmek için kullanılabilecek farklı yazılımların (örneğin, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira ve Imaris) belirli özelliklerini vurguluyoruz. Toplamda, burada açıklanan teknikler, gelişim biyolojisinde 3D veri görselleştirme ve analizinin önemini vurgulamaktadır ve diğer araştırmacıların omurgalı eksenel uzantısı ve segmentasyonu bağlamında 3D ve 4D görüntü verilerini daha iyi ele almalarına yardımcı olabilir. Son olarak, çalışma omurgalı embriyonik gelişimini öğretmeyi kolaylaştırmak için yeni araçlar da kullanmaktadır.

Introduction

Omurgalı vücut ekseni oluşumu, embriyonik gelişim sırasında meydana gelen oldukça karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Gastrulasyonun sonunda [farede, embriyonik gün (E) 8.0 civarında], nöromezodermal progenitörler (NMP'ler) olarak bilinen bir grup epiblast progenitör hücre, boyun, gövde ve kuyruk oluşumu sırasında nöral tüp ve paraksiyal mezodermal dokuları üreterek baştan kuyruğa sekansta eksenel genişlemenin önemli bir itici gücü haline gelir 1,2,3,4 . İlginçtir ki, bu NMP'lerin kaudal epiblastta işgal ettiği pozisyon, mezoderm veya nöroektoderm^5'e farklılaşma kararında kilit bir rol oynamaktadır. Şu anda NMP'ler için kesin bir moleküler parmak izine sahip olmasak da, bu hücrelerin genellikle T (Brachyury) ve Sox2 ^5,6'yı birlikte eksprese ettiği düşünülmektedir. NMP kader kararlarını düzenleyen kesin mekanizmalar (yani, nöral veya mezodermal yollar alıp almadıkları) sadece kesin olarak tanımlanmaya başlanmaktadır. İlkel çizgi bölgesindeki Tbx6 ekspresyonu, NMP kader kararının erken bir belirtecidir, çünkü bu gen mezoderm ^6,7'nin indüksiyonu ve spesifikasyonunda rol oynar. İlginç bir şekilde, erken mezoderm hücrelerinin yüksek düzeyde Epha1⁸ eksprese ettiği görülmektedir ve Wnt / β-katenin sinyallemesinin yanı sıra Msgn1'in de paraksiyel mezoderm farklılaşmasında ve somit oluşumunda önemli rol oynadığı gösterilmiştir ^9,10. NMP'lerin tek hücre düzeyinde tam bir mekansal-zamansal analizi, mezoderm spesifikasyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaları tam olarak anlamak için kesinlikle etkili olacaktır.

Somitlerin (vertebra öncülleri) oluşumu omurgalıların önemli bir özelliğidir. Eksenel uzama sırasında, paraksiyel mezoderm, somitler olarak bilinen bir dizi iki taraflı tekrarlama biriminde bölümlere ayrılır. Somitlerin sayısı ve yeni segmentlerin oluşumu için gereken süre^11,12 türleri arasında değişmektedir. Somitogenez, presomitik mezodermdeki (örneğin, Lfng) Notch, Wnt ve Fgf sinyal yollarının birkaç geninin döngüsel ekspresyonu ile gözlemlenebilen periyodik sinyal salınımlarını ("segmentasyon saati" olarak bilinir) içerir ^11,12. Mevcut somitogenez modeli ayrıca, her yeni somitin arka sınırının konumunu tanımlayan Fgf, Wnt ve retinoik asit sinyalini içeren bir dizi karmaşık sinyal gradyanı olan bir "olgunlaşma dalga cephesinin" varlığını da varsaymaktadır. Bu nedenle, "segmentasyon saati" ve "olgunlaşma dalga cephesi" arasındaki koordineli bir etkileşim, bu omurların öncü modüllerinin üretilmesi için esastır, çünkü bu anahtar morfogenetik süreçlerdeki pertürbasyonlar embriyonik ölümcüllüğe veya konjenital malformasyonların oluşumuna (örneğin, skolyoz) neden olabilir13,14,15.

Görüntüleme teknikleri, biyogörüntü analiz yöntemleri ve yazılımlarındaki son zamanlardaki önemli ilerlemelere rağmen, eksenel uzama ve somitogenez ile ilgili çalışmaların çoğu, tam bir çok boyutlu doku görselleştirmesine izin vermeyen ve embriyonik gelişim sırasında meydana gelen normal morfolojik varyasyon ile patolojik malformasyonlar (yani mutasyonlar nedeniyle) arasındaki net farklılaşmayı zorlaştıran tek/izole iki boyutlu görüntü verilerine (örneğin, kesitler) dayanmaktadır¹⁶ . 3D görüntüleme, daha önce standart 2D yöntemlerle tanımlanmayan yeni morfogenetik hareketleri ortaya çıkardı^17,18,19,20, omurgalı somitogenezi ve eksenel genişleme mekanizmalarını anlamak için toto görüntülemenin gücünü vurguladı.

Fare embriyolarının 3D ve 4D mikroskopisi, özellikle canlı görüntüleme, teknik olarak zordur ve doğru ve anlamlı mekansal-zamansal analize izin vermek için numune hazırlama, görüntü toplama ve veri ön işleme sırasında kritik adımlar gerektirir. Burada, eksenel genişleme ve segmentasyon sırasında hem NMP'leri hem de mezodermal hücreleri incelemek için kullanılabilecek fare embriyolarının canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyaması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, yaşlı embriyoların ve fetüslerin optik projeksiyon tomografisi (OPT) için, somitogenez sırasındaki sorunlardan (örneğin, kemik füzyonu ve skolyoz) kaynaklanabilecek patolojik anormalliklerin toto görselleştirmesinde ve nicelleştirilmesinde ^3D'ye izin veren bir protokol de tanımlıyoruz13,21,22. Son olarak, omurgalı segmentasyonu ve eksenel uzama çalışması ve öğretiminde 3D görüntüleme rekonstrüksiyonlarının gücünü gösteriyoruz.

Protocol

Hayvanları içeren deneyler, barınma, hayvancılık ve refah ile ilgili Portekiz (Portaria 1005/92) ve Avrupa (Direktif 2010/63/AB) mevzuatlarını takip etti. Proje, 'Instituto Gulbenkian de Ciência' Etik Komitesi ve Portekiz Ulusal Kuruluşu 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (lisans referansı: 014308) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. 3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama

NOT: Burada, canlı görüntüleme için fare E8.25 ila E10.5 embriyolarının (1.1), tüm mount immünofloresan mikroskobu için E7.5 ila E11.5 embriyolarının (1.2) ve optik projeksiyon tomografisi için fetüslerin nasıl diseke edileceği ve hazırlanacağı hakkında ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz.

1. Canlı görüntüleme için numune hazırlama
   1. Fare embriyo diseksiyonu ve canlı görüntüleme için hazırlık (örneğin, LuVeLu muhabiri ²³).
      1. Fare embriyolarını E8.25 ve E10.5 arasında önceden ısıtılmış M2 ortamında (37 °C) disseke edin. Temiz forseps kullanarak yumurta sarısı kesesini nazikçe çıkarın ve diseksiyon sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için embriyoyu bir kez taze M2 ortamı ile yıkayın.
         NOT: Embriyoya herhangi bir şekilde zarar vermekten kaçınmak önemlidir, aksi takdirde canlı görüntüleme prosedürü sırasında düzgün gelişmez.
      2. Canlı görüntüleme prosedürü sırasında, embriyoları ısıtılmış bir odada (37 °C), % 65 O2 ve% 5 CO 2 ortamında (_N2 dengeli), % 10 HyClone tanımlı fetal sığır serumu,₂ mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM ortamında inkübe edin.
         NOT: Bu kültür koşulları, embriyonik gelişimin yaklaşık 10 saat boyunca gerçekleşmesine izin verir. Diğer protokoller ^9,10, farklı kültür koşullarını kullanarak, daha uzun sürelere izin verebilir.
2. İmmünofloresan mikroskopi için numune hazırlama
   1. Fare embriyo diseksiyonu ve fiksasyon prosedürü
      1. Fare embriyolarını E7.5'ten E11.5'e kadar soğuk (4 °C) fosfat tamponlu salin (PBS) veya M2 ortamında disseke edin. Tüm ekstraembriyonik membranların (örneğin, Reichart'ın zarı veya yumurta sarısı kesesi) çıkarılmasından sonra, diseksiyon prosedürü sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için embriyoyu taze PBS'de yıkayın.
      2. Embriyoları 4 °C'de, PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde, Tablo 1'de belirtilen süre boyunca sabitleyin.
         DİKKAT - PFA bir duman davlumbazının içinde kullanılmalıdır

         Gelişim aşaması	Önerilen fiksasyon süresi (%4)
         E7.5	1s30
         E8,5	2 saat
         E9.5	3 saat
         E10,5	4 saat
         E11,5	4 saat

         Tablo 1 - Farklı gelişim aşamalarındaki embriyoların fiksasyon süreleri
      3. Fiksasyondan sonra, PFA'yı tamamen çıkarmak için embriyoları PBS'de en az iki kez (her biri 5-10 dakika) yıkayın. Bu noktada, embriyolar doğrudan immünofloresan boyama protokolüne (Adım 1.2.2) alınabilir veya dehidre edilebilir ve gelecekte kullanılmak üzere saklanabilir (Adım 1.2.1.4).
      4. Gerekirse, embriyoları -20 ° C'de% 100 metanol içinde uzun süre saklayın.
         1. Doku korumasını iyileştirmek için, embriyoyu% 100 metanole ulaşana kadar, her adımda bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) 10 dakika metanol konsantrasyonunda% 10 artışla (PBS'de seyreltilmiş) kademeli olarak dehidre edin. % 100 metanolü taze bir aliquot kullanarak bir kez değiştirin.
         2. Dondurulmuş embriyoları, ters metanol / PBS serisini takiben, her adım bir çalkalayıcıda RT'de 10 dakika ve immün boyama protokolüne girmeden önce PBS'de son yıkamalarla (her biri iki kez, 5-10 dakika) rehidrasyon yoluyla geri kazanın.
            DİKKAT - Metanol bir duman davlumbazının içinde kullanılmalıdır.
   2. Tam montajlı immünofloresan boyama
      NOT: Aşağıdaki immünofloresan boyama protokolü, Osorno ve ^ark.24'te açıklanan prosedürden uyarlanmıştır. Tüm yıkamalar bir çalkalayıcı üzerinde yapılmalıdır. Blokaj adımından sonra, antikor bütünlüğünü / korunmasını sağlamak için inkübasyonlar 4 ° C'de gerçekleştirilir.
      1. Geçirgenliği artırmak için embriyoları% 0.1 Triton X-100 (% 0.1 PBST) içeren PBS'de üç kez (her biri 30 dakika) ve daha sonra% 0.5 PBST'de bir kez 1 saat (RT) boyunca yıkayın.
      2. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, RT'de 30 dakika boyunca PBS'de (pH 7.5) 1 M glisin içinde yıkayın.
      3. Glisini tamamen çıkarmak için 30 dakika boyunca% 0.1 PBST'de üç kez yıkayın.
      4. PBS'de serumun% 3'ü (ikincil antikorların üretildiği hayvan türlerinden), sığır serum albüminin% 1'i (BSA) ve Triton X-100'ün% 0.1'ini içeren bloke edici çözeltide embriyoları 4 ° C'de bir gecede inkübe edin.
      5. Bloke edici çözeltideki birincil antikorları seyreltin (normalde T ve Sox2 antikorları için 1:200) ve 4 ° C'de iki ila üç gün boyunca inkübe edin.
      6. İkincil antikorları eklemeden önce, embriyoları 4 ° C'de% 0.1 PBST'de% üç kez (her biri 30 dakika) yıkayın. Sekonder antikorları bloke edici çözeltide (1:1000) seyreltin ve ışıktan korunarak 4 ° C'de 2 gün boyunca inkübe edin.
      7. Embriyoları 4 ° C'de% 0.1 PBST'de altı kez (her biri 30 dakika) yıkayın.
      8. Nükleer karşı boyama için, embriyoları 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür (DAPI), PBST'de 1:500 seyreltilmiş, gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcıda, ışıktan korunmuş olarak inkübe edin.
      9. Son olarak, embriyoları 4 ° C'de% 0.1 PBST'de% 30 dakika) üç kez (her biri 30 dakika) yıkayın.
   3. Doku temizleme ve slayt hazırlama
      1. Metil salisilat veya benzil benzoat (BABB) ile benzil alkol karışımı kullanılarak doku temizliği
         1. Metil salisilat veya BABB kullanarak temizlemeden önce, metanol konsantrasyonundaki ardışık %10'luk artışlardan oluşan bir metanol / PBS serisi (4 ° C'de her biri 10 dakikalık kuluçka süreleri) yoluyla embriyoları% 100 metanole getirerek tamamen dehidrate edin. Tam dehidrasyon elde etmek için,% 100 metanolü yenisiyle değiştirin ve 10 dakika daha bekleyin.
         2. Metanol içinde bir dizi metil salisilat veya BABB içine gömülerek, konsantrasyonda% 20 ardışık artış, her adım için 20 dakikalık inkübasyon ile embriyo temizliği gerçekleştirin. Metil salisilat veya BABB çözeltisi% 100'e ulaştığında, taze bir çözelti için iki ek değişiklik yapın.
            DİKKAT: Hem metil salisilat hem de BABB bir duman davlumbazının içinde tutulmalıdır.
            NOT: Doğru temizleme için, embriyoların tamamen dehidrate olması esastır. Metanolün, temizleme çözeltisi serisinde metil salisilat veya BABB ile tamamen karıştırılması da önemlidir.
         3. Embriyolar tamamen şeffaf hale geldikten sonra, doku hasarı olasılığını azaltmak için tercihen bir floresan stereoskobu kullanarak bunları ayrı ayrı ele alın.
         4. Görüntüleme için, embriyoları 75 mm x 25 mm çöküntülü içbükey cam kızağa veya 20 mm x 60 mm #1,5 kapak camına monte edin. İkinci seçenek, gerekirse her iki taraftan da görüntülemeye izin verecektir, ancak çok daha kırılgan ve sızdırmazlığı zordur. Bir kürdan, ince bir pamuk ucu, bir Pasteur pipeti veya benzeri bir alet kullanarak embriyoları mikroskop slaytlarına aktarın.
         5. Embriyoların sıkışmasını önlemek için, #1 kapak camı parçalarından (170 μm kalınlığında), silikon veya ince metal pullardan yapılmış ara parçalar ekleyin. Ardından bir damla montaj ortamı ekleyin, #1 veya #0 20x20 mm kapak camı ve conta ile örtün.
         6. Cam veya metal ara parçalar kullanıyorsanız, preparatı daha iyi stabilize etmek için erimiş parafin ile kapatın - çivi cilası ile kapatmayın, çünkü metil salisilat veya BABB ile çözülür. Kabarcıkları önlemek için, kapak kaymasını bir tarafa yerleştirin ve ardından yavaş yavaş ve yavaşça yana doğru kaydırın; gerekirse daha fazla ortam ekleyin.
            NOT: Temizlenen embriyoların nasıl manipüle edileceğini ve mikroskop slaydına nasıl monte edileceğini daha iyi anlamak için lütfen videoya bakın.
      2. RapiClear ile doku temizliği
         1. RapiClear kullanırken, embriyo dehidrasyonu gerekli değildir. Adım 1.2.2.9'dan sonra, embriyoları 75 mm x 25 mm çöküntü içbükey cam slaytın ortasına yerleştirin, mikroskop çöküntü slaytındaki tüm PBST'yi çıkarın ve 200 μL temizleme çözeltisi ekleyin.
         2. Işıktan korunan 10 dakika sonra, embriyolar şeffaf hale gelmeye başladığında, temizleme solüsyonunu değiştirin, 20 dakika daha bekleyin (ışıktan korunmuş) ve ardından bir taraftan başlayıp yavaşça diğerine doğru hareket eden bir kapak kayması ile doldurun.
            NOT: Embriyoyu tamamen temizleme süresi, embriyoların evresine ve büyüklüğüne bağlı olarak birkaç dakikadan bir geceye kadar sürebilir. Ayrıca, tüm süreç bir stereomikroskop altında yapılmalıdır. Temizleme ve mikroskop slayt hazırlığını daha iyi anlamak için lütfen video protokolüne bakın.
3. Optik projeksiyon tomografisi için numune hazırlama
   NOT: Aşağıdaki prosedürler önceki protokollerden uyarlanmıştır^19,25,26. E18.5 fare fetüslerinin analizi için protokol açıklanacaktır.
   1. Fare fetus diseksiyonu ve fiksasyon prosedürü
      1. E18.5 fare fetüslerini soğuk (4 °C) PBS'de diseke edin, tüm ekstraembriyonik membranları çıkarın ve daha sonra diseksiyon prosedürü sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için fetüsleri taze PBS'de birkaç kez yıkayın.
      2. PBS'de yapılan% 4 PFA'da, 5 ila 7 gün boyunca 4 ° C'de fetüsleri sabitleyin.
      3. Fetüsleri PBS'de bir kez (15 dakika) ve daha sonra demineralize suda veya PBS'de üç kez (her biri 30 dakika) yıkayın. Yıkamaları bir çalkalayıcıda yapın.
      4. Fetüsleri,% 100 metanole kadar artan konsantrasyonlarda (demineralize su veya PBS'de seyreltilmiş% 10 artış) metanol çözeltilerinde inkübasyon yoluyla (bir çalkalayıcıda RT'de 25 dakikalık seri) dehidre edin.
      5. Tam dehidrasyon sağlamak için% 100 metanol çözeltisini (taze bir aliquot kullanın) üç kez (her biri 20 dakika) değiştirin. Embriyolar daha sonra -20 ° C'de saklanabilir veya doğrudan (bir gün sonra) beyazlatma işlemine alınabilir (Adım 1.3.2).
   2. Beyazlatma işlemi
      1. Doğal pigmentasyonu gidermek için, fetüsleri (ayrı ayrı) bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin, önce metanolde% 5_H20 2'de bir gün ve daha sonra% 10 H₂0_2'de metanolde, embriyolar tüm doğal pigmentasyonu kaybedene kadar 3 güne kadar.
         DİKKAT:_H2O_2, bir duman başlığı içinde yavaşça kullanılmalıdır. Numune ile temas ettiğinde_{H2 O2} içeren beyazlatma çözeltisi buhar oluşturur ve bu nedenle fetüsleri içeren tüp tüm beyazlatma prosedürü boyunca açık kalmalıdır. Bazı beyazlatma protokolleri H2_O2'ninformamid_ile kombinasyonunu önermektedir. Bu alternatif kullanılırsa, seyreltilmemiş formamide H_2O2 eklenmesi patlamaya neden olabileceğinden, ekstra özen gösterilmelidir.
      2. Embriyoları demineralize suda ters metanol serisinde (% 10 azalma ile) kademeli olarak yeniden sulandırın, her biri bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 20 dakika boyunca inkübe edilir ve son olarak demineralize suda üç kez (her biri 30 dakika) yıkayın. Bir gün bekleyin, mineralden arındırılmış suyu değiştirin ve devam edin.
         NOT: Beyazlatma işleminin temsili bir sonucu için Ek Şekil 1'e bakınız.
   3. Demineralizasyon protokolü
      NOT: Demineralizasyon isteğe bağlıdır, ancak fetüsler veya yavrular için önerilir.
      1. Fetüsleri birkaç saat boyunca 42 ° C'de 0.1 M EDTA'da yıkayarak demineralizasyon yapın [ayrıca bakınız Cho ve ark.27] ve ardından EDTA'yı tamamen çıkarmak için demineralize su ile beş yıkama (her biri ²⁰ dakika). Tüm prosedürleri bir çalkalayıcıda gerçekleştirin.
   4. Takas için numune hazırlama
      1. Fetüsleri% 1'lik bir agaroz bloğuna yerleştirin. Bu blokları hazırlamak için 50 mL'lik bir plastik tüp veya şırıngayı (şırınganın çıkış tarafını keserek ve karşı tarafı bloke etmek için pistonu kullanarak silindirik bir boşluk inşa ederek) erimiş agarozla doldurun, fetüsü agaroza dikey bir konumda yerleştirin ve agarozun katılaşması sırasında forseps yardımıyla bu pozisyonu bloğun merkezinde tutun.
      2. Agarozun tamamen jölelenmesi için kalıbı blokla birlikte 4 ° C'ye (30 dakika) yerleştirin. Fetüsün blok içinde yanlış konumlandırılması veya hava kabarcıklarının ortaya çıkması durumunda, bloğu gece boyunca 50 ° C'ye yerleştirerek agarozu eritin ve ertesi gün prosedürü tekrarlayın.
      3. Agaroz bloğunu fetüsle birlikte kalıptan çıkarın ve demineralize su içeren bir kaba koyun. 15 dakika sonra taze demineralize su ile değiştirin.
      4. BABB ile temizlemeden önce, numuneyi dehidrate edin. Doku bütünlüğünü daha iyi korumak için, metanol konsantrasyonunda% 10'luk artışlarla (demineralize su veya PBS'de seyreltilmiş) fetüs dehidrasyonunu kademeli olarak gerçekleştirin, her adım% 100 metanole ulaşana kadar, bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 45 dakikadan fazla bir süre boyunca.
      5. % 100 metanolü değiştirin (taze bir aliquot kullanın), önce bir saatlik aralıklarla dört kez ve daha sonra tam dehidrasyon sağlamak için ertesi gün tekrar değiştirin.
   5. OPT görüntüleme için temizleme işlemi ve numune montajı
      1. Metanol içindeki bir dizi (her biri 2.5 saat) BABB çözeltisi ile bir çalkalayıcı üzerindeki fetüsleri temizleyin,% 100 BABB'ye ulaşana kadar% 25 artışla.
      2. BABB çözeltisini, fetüs tamamen şeffaf olana kadar her gün taze bir çözelti ile değiştirin. Bu işlem 3 ila 5 gün sürebilir. Fetüsü içeren bloğu, tüm prosedür boyunca bir çalkalayıcıda tutun. Fetüsler uzun süreler boyunca% 100 BABB çözeltisinde kalabilirler.
         NOT: Eğer fetüs doğru şekilde susuz bırakılmazsa, ilk önce BABB eklendikten sonra hafif yarı saydam ("beyazımsı" emülsiyon) hale gelecektir. Bu durumda, saf metanole geri dönün ve taze metanol içinde iki ek yıkama yapın. Dehidrasyon ve temizleme işlemleri sırasında numuneleri asla soğutmayın, çünkü sıcaklıktaki değişiklikler su yoğuşmasına neden olabilir.
      3. Temizlenmiş agaroz bloğunu OPT tarayıcısının motor eksenine takın, tüm fetüsün görüntüsünü elde etmek için optikleri ayarlayın ve tam bir projeksiyon veri kümesi^19,28 elde etmeye devam edin.

2. Mikroskop / Görüntü yakalama

1. Doğru 3D ve 4D görüntüleme için, deneysel hedefe en uygun mikroskobu seçin. Tablo 2 , seçim boyunca yol gösterecek genel bilgiler sağlar.

Optik mikroskopi teknikleri	Görüntüleme prensibi	Deneysel amaç ve dikkat edilmesi gereken noktalar
Geniş alan görüntüleme	Floresan, yansıyan veya iletilen ışığı kullanır.	Embriyoya hızlı ve genel bir bakış için idealdir (örneğin taramalar ve gelişimsel aşamaları ve belirgin fenotipleri değerlendirmek için). Yüksek büyütmelerde gözlemlenebilir kalınlığa kıyasla azaltılmış alan derinliği, 3D morfolojinin doğru yorumlanmasına veya analizine izin vermez.
Konfokal (lazer tarama; CLSM)	Lazer tarama aydınlatmasını ve bir iğne deliğinden floresan algılamasını kullanır.	Floresan etiketli numunelerin optik dilimlerinin, ideal olarak güçlü bir sinyalle görüntülenmesini sağlar. Bir iğne deliğinden görüntüleme, sinyali alan derinliğinin dışından uzaklaştırır, böylece 3D'de bilgilerin doğru bir şekilde ayırt edilmesini sağlar. Satın alma, geniş alandan daha yavaş büyüklük sıralarıdır, ancak benzersiz kontrast ve morfolojinin 3D ayrımcılığı ile. Yüksek zamansal çözünürlük elde edilemez, çünkü görüntüler bir seferde 1 piksel elde edilir. E9.5'e kadar sabit fare embriyolarının 3D görüntülenmesi için iyidir. Tüm presomitik mezoderm veya somitler boyunca görüntüleme, daha derin dokularda ışık saçılması nedeniyle doku temizliği gerektirir. Fototoksisite ve beyazlatma bir husustur. Fotobeyazlatma, sınırlar dahilinde, a posteriori olarak telafi edilebilir. Bununla birlikte, canlı örneklerdeki fototoksik etkiler belirlenemez ve çoğu zaman belirlenmesi kolay değildir. Bu, örnekler düşük ekspresyon gösteriyorsa ve yüksek lazer güçlerine ihtiyaç duyulursa daha belirgindir.
İki foton uyarma floresansı (TPEFM)	Görünür lazer aydınlatması yerine darbeli yakın kızılötesi (NIR) lazer uyarımı kullanır.	TPEFM, CLSM'den daha kalın numuneler aracılığıyla optik dilimlemeye izin verir. Çözünürlük biraz daha düşüktür, ancak daha derin dokulardaki kontrast önemli ölçüde daha iyidir, bu da fare embriyolarının canlı görüntülenmesi için idealdir. TPEFM genellikle geleneksel CLSM'den daha az fototoksik olarak kabul edilmesine rağmen, hücreler ve dokular üzerinde zararlı etkileri olabilecek yüksek lazer güçleri gerektirir. E11.5'e kadar embriyoların 3D görüntülenmesi için idealdir, ancak tüm presomitik mezoderm boyunca görüntüleme hala doku temizliği gerektirir.
Konfokal (dönen disk)	Tek bir lazer yerine, birden fazla nokta benzeri kaynak kullanan bir konfokal form.	Birden çok nokta benzeri yapının kullanılması, optik dilimlerin CLSM'den daha hızlı oluşturulmasını sağlar (saniyede birkaç kare veya dakikada yığın elde edilebilir). Satın alma, makul 3D ayrımcılığı ile pratik olarak geniş alan kadar hızlıdır. Bununla birlikte, sadece fare embriyosunun en yüzeysel dokularının görüntülenmesine izin verir. CLSM'den daha hassas algılamaya izin verir, bu da onu düşük floresan protein ekspresyonuna sahip embriyolar için bir alternatif haline getirir.
Işık tabakası / tek düzlem (LSFM/SPIM)	Geniş alan veya nokta benzeri aydınlatma yerine, numune bir seferde bir ortogonal düzlem aydınlatılır. Çoğu konfigürasyonda, birden fazla açıdan görüntülemeye izin verir.	Ayrıca floresan etiketli numuneler gerektirir. Optik dilimlerin elde edilmesi son derece hızlıdır (saniyede birden fazla kare) ve fototoksisite veya ağartmanın etkilerini azaltmıştır. Ancak, çoklu görünüm gerekiyorsa, sonraki veri kümesi ön işleme adımları saat/gün hesaplama gerektirebilir. LSFM/SPIM, CLSM'den daha düşük ifade düzeylerinin daha iyi algılanmasını sağlar. Gastrulasyon sırasında in toto fare embriyolarının 3D görüntülenmesi için idealdir. Numunelerin genellikle süspansiyona monte edilmesi ve muhafaza edilmesi gerekir (geleneksel olmayan hazırlık).
Optik projeksiyon tomografisi (OPT)	Optik dilimler tespit edilmez, ancak tüm embriyonun farklı açılardan ("projeksiyonlar") bir dizi geniş alan görüntüsünden hesaplanır.	Daha sonraki aşamadaki fare embriyolarının/fetüslerinin (>5mm) 3D görüntülenmesi için idealdir, ancak yalnızca sabit ve temizlenmiştir. Hem floresan hem de floresan olmayan numunelerin optik dilimlerinin 3D yığınlarını üretme avantajına sahiptir. Veri kümeleri izometriktir (her üç boyutta da eşit çözünürlüğe sahip dilimler) anatomik analiz için idealdir. Bir projeksiyon veri kümesi edinmek sadece birkaç dakika sürebilir, ardından 15-30 dakika yeniden yapılandırma gerekebilir.
Optik Koherens Tomografi (OKT)	Işık yansıması ile girişime dayalı optik dilimler elde etmek için numune boyunca NIR aydınlatmasını kullanır.	OCT, birkaç düzine mikrometre çözünürlükle canlı doku (floresan kontrastı olmadan numunenin birkaç milimetre derinliğinde) aracılığıyla kolay görüntüleme sağlar. Satın alma işlemi çok hızlıdır (saniyede birkaç dilim). OPT için olası bir alternatif olmasına rağmen, bu teknik yaygın olarak mevcut değildir.
Süper çözünürlüklü (SR), atomik kuvvet (AFM) veya yakın alan görüntüleme (NSOM)	SR normalde tek moleküllü lokalizasyona ve alt kırınım çözünürlüklerinde (birkaç nanometre) tarama yüzeylerinde AFM / NSOM'a dayanır.	Alt kırınım seviyesinde (<200nm çözünürlük), genellikle hücre yüzeyindeki tek molekülleri veya molekülleri tespit etmek amacıyla görüntülemeye izin verir. Fare embriyoları gibi büyük örneklerin morfolojik analizi için ideal değildir. Edinme genellikle yavaş bir süreçtir (görüntü başına saniyeler ila dakikalar).

Tablo 2 - Araştırmacının spesifik deneysel hedefine daha uygun görüntüleme tekniğinin/mikroskobunun seçimine rehberlik edecek genel bilgiler.

3. Görüntü veri kümesi ön işleme

NOT: Burada, görüntü veri kümesi ön işlemenin bazı önemli adımlarını, yani gürültü azaltma (3.1) ve dekonvolüsyonu (3.2) vurguluyoruz ve 3B veri kümelerinin zaman serilerinin (3.3) ve tam montajlı immünofloresan boyamalarının (3.4) uygun şekilde hazırlanmasına ve ön işlenmesine izin veren algoritmalar sağlıyoruz. Son olarak, OPT veri kümesi ön işleme ve yeniden yapılandırma için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklayan referansları belirtiyoruz.

1. Gürültü azaltma
   1. Görüntüler düşük sinyal-gürültü oranı gösteriyorsa, Fiji/ImageJ 29'da bulunan "Medyan" filtre veya "Anizotropik difüzyon" gibi klasik bir yöntem veya "CARE"³⁰ veya "^Noise2Void"³¹ gibi Makine Öğrenimine dayalı daha ayrıntılı bir yöntem uygulamayı düşünün.
      NOT: Bu, özellikle fotobeyazlatma ve fotohasarın önemli bir endişe kaynağı olduğu ve daha düşük pozlamaların ve daha yüksek dedektör kazanımlarının gerekli olduğu canlı görüntüleme veri kümeleri için geçerlidir.
2. Dekonvolüsyon
   1. Görüntüler yüksek çözünürlükle (Nyquist örneklemesinin yakınında veya yanında) elde edildiyse, analizden önce veri kümesinin kalitesini artırmak için dekonvolüsyonla görüntü restorasyonu gerçekleştirmeyi düşünün. Bazı deconvolution araçlarının da bir gürültü giderme adımı içerdiğine dikkat edin.
      NOT: Bu, Krull ve ^ark.32'de ve Huygens dekonvolüsyon yazılımı web sitesinde (https://svi.nl/HomePage) bulunan belgelerde kapsamlı bir şekilde ele alınmıştır.
3. Uygun görselleştirme ve analiz için 3B veri kümesi zaman serisi hazırlama
   NOT: Genellikle hızlandırılmış görüntüleme sırasında embriyo veya evre sürüklenmesi meydana gelebilir. Analiz yapmadan önce bunun düzeltilmesi gerekir. Bazen, sürüklenme, satın almanın kesintiye uğraması ve ayarlamaların yapılması gereken kadar şiddetlidir. Bu durumda, aynı X, Y ve Z boyutlarını korumak en iyisidir.
   1. Ayrı 4B yığınlar, Fiji'nin "birleştirme" işlevi kullanılarak tek bir 4B hiper yığında birleştirilebilir. Bununla birlikte, bu araç kompozit / hiper yığınları işlemez, bu nedenle işlem Image | kullanarak tüm 4B segmentleri basit yığınlara dönüştürmek gerekir. Hiper yığınlar | Yığınlamak için hiper yığın. Bu 4B segmentlerin sırasını korumak için bazı numaralandırma sistemleri tutun ve her biri hakkındaki bilgileri (kanallar, dilimler, zaman noktaları) not alın. Tüm segmentler için yordamı yineleyin ve ardından Görüntü | yordamını kullanarak bunları birleştirin Yığınlar | Araçlar | Birleştirin.
   2. Birleştirilmiş hiper yığını Image | işlemiyle yeniden oluşturma Hiper yığınlar | Hyperstack'e yığınlayın ve farklı boyutların doğru sırasını seçin. Tüm boyutların doğru sıralandığından emin olmak için Hyperstack'i inceleyin.
      NOT: Kanal (c ) ve Dilim (z) sayısı tüm 4B segmentler için aynı olmalıdır; (zaman) Karelerinin (t) sayısı, tüm 4B segmentler için eklenen toplam zaman noktalarına eşit olmalıdır. Hiper yığına dönüştürme işlemini gerçekleştirmeden önce, farklı boyutların nasıl enterpolasyona tabi tutulduğunu anlamak için yığına göz atmak önemlidir. Fiji/ImageJ varsayılan değeri alternatif kanallar, ardından alternatif Z dilimleri ve ardından alternatif zaman noktalarıdır ("XYCZT"). Bunun mikroskop tarafından üretilen veriler için geçerli olduğunu onaylayın.
   3. Görüntü modu olarak Kompozit'i seçin ve Etiketli Görüntü Dosyası Biçimi (TIFF) olarak kaydedin. Büyük veri kümeleri için Eklentiler işlemini gerçekleştirerek BigDataViewer³³ biçimine dönüştürmeyi | BigDataViewer | Geçerli Görüntüyü XML/HDF5 olarak dışa aktarın. Bu, BigDataViewer kullanılarak daha verimli ve 3B olarak taranabilen ve büyük veri veri kümeleri için diğer Fiji/ImageJ araçları tarafından işlenebilen bir veri kümesi oluşturur.
   4. Gerekli sürüklenme düzeltmesinin derecesine bağlı olarak "Doğru 3B Sürüklenme" ImageJ eklentisi³⁴ veya BigStitcher eklentisi^35'i kullanarak embriyo/aşama sürüklenmesini telafi etmek için birleştirilmiş hiperyığını (3B yığınların zaman serisi) kaydedin. XML/HDF5 dosyaları BigStitcher ile açılabilir.
      NOT: Hücre izleme veya hareket analizi yapmak için herhangi bir girişimde bulunmadan önce embriyo sürüklenmesini gösteren 3D hızlandırılmış görüntülerin kaydının yapılması gerekir; Sürüklenmenin düzeltilmesi, morfogenetik hareketleri doğru bir şekilde yorumlamak için de gereklidir.
4. İmmünofloresan görüntüleme veri setlerinin ön işlenmesi
   1. Z-derinlik sinyali zayıflaması
      NOT: Sinyal zayıflamasını düzeltmek için önerdiğimiz yöntem yararlı olsa da, bu dikkatli kullanılmalıdır, çünkü derinlikteki daha az sinyal aslında optik bir fenomeni değil, biyolojik bir fenomeni yansıtabilir. İlgilenilen molekülün mevcut veya ifade edilmesinin beklenmediği bir doku alanındaki çürümeyi ölçmeyi düşünün ve o alan için tazminatı ayarlayın. Derinlikte hala daha düşük bir pozitif sinyal varsa, gerçek bir biyolojik fenomeni ortaya çıkarabilir. Ayrıca, numunenin bazı alanlarının diğerlerinden daha fazla saçılma veya lazer zayıflaması üretebileceğini ve bu basit yöntemle tam olarak düzeltilmeyeceğini de göz önünde bulundurun.
      1. Daha kalın / geç evre embriyolar için, kiriş zayıflaması, fotobeyazlatma ve kırılma indekslerinin uyumsuzluğundan kaynaklanan küresel sapma (montaj ortamı ile mikroskop hedefi arasında), floresan yoğunluğunun Z-yığınının daha derin dilimlerinde büyük ölçüde azaldığı veri kümelerine neden olabilir. Bu nedenle, analizden önce bu sinyal kaybını telafi edin. Analitik olarak en doğru zayıflamanın belirlenmesi karmaşıktır ve yüksek oranda numuneye bağımlıdır³⁶, ancak ImageJ / Fiji'de Proses | kullanılarak ampirik olarak hızlı bir yaklaşım belirlenebilir. Matematik | Makro işlevi ve Önizleme'ye tıklama.
      2. Z-yığınını Fiji/ImageJ içine yükleyin ve ardından Image | Yığınlar | Yeniden dilimleyin. Şuradan başlayın: üstte, enterpolasyondan kaçının işaretli ve Tamam olarak tutun. Şimdi "Z", "Y" ekseni olacak. Ardından, Resim | Arama tabloları (LUT) | Ateş (veya başka bir çok renkli LUT). Bu, sonraki adımlarda görsel olarak en iyi tazminatın değerlendirilmesine yardımcı olacaktır. Embriyonun ortasında, derinlemesine zayıflamanın etkilerinin açıkça görülebildiği bir dilime geçin (yoğunluk üstten [yüzeysel] aşağıya [daha derin]) düşer).
      3. Prosedür ile dikey ("y") yoğunluk düşüşünün düzeltilmesini belirlemeye devam edin İşlem | Matematik | Makro tıklayın ve aşağıdaki "Kod"u tam olarak burada yazıldığı gibi ekleyin:
         v = v * A * exp ( B * y / s )
         Bu ifadede, "v" piksel yoğunluğu için değişkendir (derinlikte bir işlev olarak ayarlanacaktır), derinlik için "y" değişkeni ve tam derinlik için "h" ve "exp" üstel bir fonksiyondur; "A", 0,5 ile 1,0 arasında bir sayı ile değiştirilmelidir (Z-yığınının üst katmanlarının aşırı doygunluğunu önlemek için daha düşük değerler seçin); B, Z-derinliği zayıflamasının ne kadar şiddetli olduğuna bağlı olarak 0,5 ile 2,0 arasında bir sayı ile değiştirilir - ideal olarak 1 olmalıdır, ancak bazı durumlarda alt katmanları doğru bir şekilde telafi etmek için daha az (veya daha fazla) gereklidir; daha yüksek bir B değeri, daha fazla zayıflama tazminatı ile sonuçlanacaktır. İlk değerlendirmeyi yapmak için Önizleme'ye tıklayın. Görüntünün üstünden aşağısına kadar yeterli telafi elde edene kadar A ve B'nin farklı değerlerini test edin ("Ateş" LUT bu değerlendirme için yardımcı olabilir). Memnun kaldığınızda, Tamam'ı tıklatarak ayarları uygulayın.
         NOT: Bu, her kanalda ayrı ayrı yapılmalıdır, çünkü kırmızıya kaymış boyalar ve lazerler daha az zayıflayabilir ve bazı boyalar diğerlerinden daha hızlı ağartabilir. Bu prosedürün, derinlikteki floresan yoğunluğu varyasyonlarının güvenilir bir şekilde ölçülmesine izin verecek kadar doğru olmayabileceğini unutmayın, ancak sinyalin derinlemesine zayıflamasından ciddi şekilde etkilenen orijinal 3D veri kümesinde doğrudan nicelleştirmeler yapmaktan kesinlikle daha güvenilirdir. Bu etkiyi tanımlamanın ve kontrol etmenin bir yolu, dorsal veya ventral taraflardan farklı embriyoların görüntülenmesini karşılaştırmaktır.
      4. Görüntü | yaparak telafi edilen Z-yığınının orijinal geometrisini geri yükleyin Yığınlar | Yeniden dilimleyin, en üstten başlayın, İnterpolasyondan kaçının işaretli tutun ve şimdi "Y" tekrar "Z" düzlemi olmalıdır; "Görüntü | Arama tabloları | Griler" (veya tercih edilen diğer LUT). Orijinal telafi edilmemiş z-stack'i atın ve telafi edilmiş versiyonu kaydedin.
         NOT: Z-derinlik sinyali zayıflama yönteminin temsili bir sonucu olarak Ek Şekil 2'ye bakınız.
   2. Z ekseni ölçekleme düzeltmesi
      1. Embriyoların montajı için kullanılandan farklı bir kırılma indisi için tasarlanmış bir hedefle görüntüleme yapılırsa, dilim kalınlığının yeniden ölçeklendirilmesi gerekir, aksi takdirde derinlemesine ölçümler yanlış olacaktır (doku temizlenmiş bir embriyo üzerinde "kuru" bir hedef kullanılıyorsa potansiyel olarak% 50 oranında). Bu, ³⁷ ve ^38'de açıklandı, gözden geçirildi ve farklı yöntemler tartışıldı. Gerçek Z ekseni bozulma ölçeğinin analitik olarak belirlenmesi karmaşıktır, ancak numunenin kırılma indisi ile hedefin kırılma indisi arasındaki oran bulunarak kabul edilebilir bir yaklaşım kolayca belirlenebilir (örneğin; kuru 20 x hedefi ile görüntülenen metil salisilat temizlenmiş bir embriyo için 1.53/1.0 veya BABB ile temizlenmiş ve suya daldırma hedefi ile görüntülenen bir embriyo için 1.56/1.33).
      2. Z-stack veri kümesi Fiji/ImageJ'de zaten açıkken (çok kanallı görüntüler için, tüm kanallarla "kompozit" olarak birleştirildikten sonra), Görüntü | Özellikler ve Voksel derinliğini , görüntü yakalama sırasında elde edilen dilim kalınlığına değiştirin ve önceki adımda belirlenen Z ekseni ölçekleme düzeltmesi ile çarpılır (4.2.1; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü). Görüntü | kullanarak sonucu onaylayın Yığınlar | Ortogonal Görünümler.
   3. Fiji/ImageJ kullanarak embriyonun anatomik olarak standart bir pozisyona yeniden konumlandırılması
      NOT: Embriyonun yeniden konumlandırılması (bkz. Ek Şekil 3) Fiji/ImageJ kullanılarak standartlaştırılmış bir ön-arka [A-P] ve dorsal-ventral [D-V] eksen pozisyonuna, TransformJ'nin kurulmasını gerektirir ³⁹ Fiji'nin "ImageScience" güncelleme web sitesinden eklentiler paketi.
      NOT: Bu teknik, kenara takma ad yapıtlarına ve çözünürlüğün bozulmasına neden olacak üç düzlemdeki rotasyon turlarına tercih edilir. Ancak, Fiji/ImageJ 3D görüntüleyici eklentisi 200-300 Mb'den büyük veri kümelerini düzgün bir şekilde işleyemediğinden (eklenti, görüntüleme açısını döndürmeye çalışırken öngörülemeyen davranışlar oluşturamayabilir veya göstermeyebilir), önce orijinal 3B veri kümesinin alt örneklenmesi gerekir.
      1. Fiji'nin Görüntü | veri kümesi boyutunu küçülterek başlayın Veri kümesini 200 Mb'ın altına düşürmek için gereken X, Y ve Z "ölçek" değerlerini ölçeklendirin ve ekleyin (örneğin, 0,5 x 0,5 x 0,5 aşağı örnekleme, veri kümesinin 8 kat daha küçük olmasına neden olur). Yeni pencere oluştur seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun.
      2. Ardından Eklentiler | 3D görüntüleyiciye gidin. 3B görüntüleyici penceresinin içinde, embriyoyu seçmek için üzerine tıklayın ve kırmızı bir 3B kutu görünmelidir. Bu modu kullanırken (kırmızı kutu etkinken), veri kümesinin dönüşü, görüntüleme açısını döndürmek olan varsayılan davranışın aksine, fare ile kontrol edilebilir. Embriyoyu fare ile yeniden konumlandırırken, asla dışarıya tıklamayın, aksi takdirde veri kümesinin seçimi kaldırılır.
      3. Embriyonun yeni konumundan memnun kaldığınızda, Düzenle'yi seçin | Dönüşüm | Dönüştürülmüş görüntüyü "3D görüntüleyici" penceresinin menüsünde dışa aktarın. Farklı ortogonal düzlemleri incelemek için Görüntü | Yığınlar | Ortogonal Görünümler. Embriyo doğru konumlandırılmamışsa, pencereyi kapatın ve 3B görüntüleyici penceresine geri dönün ve yeniden ayarlayın. 4.3.2 adımını yineleyin.
      4. Embriyo doğru konumlandırıldığında, "3B görüntüleyici" pencere menüsünden Düzenle | Dönüşüm | Dönüştürmeyi kaydedin ve dönüştürme matrisini *.mat uzantılı bir metin dosyasına kaydedin. Bu metin dosyasını Fiji/ImageJ kullanarak açın, ilk iki satırı (metin) kaldırın ve yeniden kaydedin. Bu, ^39'da açıklanan "TransformJ" eklentisiyle uyumlu bir dönüşüm matrisi dosyası oluşturur.
      5. Tam çözünürlüklü veri kümesine geçin (çok kanallı bileşik hiperyığın olabilir) ve Eklentiler | TransformJ | TransformJ affine. Yeni pencerede, daha önce kaydedilmiş matris dosyasını aramak için göz atın, izotropik olarak yeniden örneklemek | Kübik B-Spline enterpolasyonunu seçin | Tamam.
         NOT: Bu işlem bellek ve CPU yoğundur. İş istasyonuna ve veri kümesinin boyutuna bağlı olarak, işlem dakikalar ile saatler arasında sürebilir. İzotropik olarak yeniden örnekleme seçeneğinin kullanılması, dönüştürme işlemi sırasında hiçbir çözünürlüğün kaybolmamasını garanti eder, bu nedenle veri kümesinin boyutu önemli ölçüde artacak ve artık orijinal konfokal z-yığını gibi anizotropik olmayacaktır; Z eksenindeki dilim sayısının her dilimin aynı X ve Y piksel sayısına yükselmesi ve yığının orijinal boyutun 5-10 katına şişirilmesi beklenir. Bu, rotasyon ve çeviri sırasında voksellerin enterpolasyonu sırasında hiçbir bilginin kaybolmamasını garanti etmek için gereklidir.
      6. Embriyo uygun şekilde yeniden konumlandırıldıktan sonra, embriyonun etrafında oluşturulan boş alanın çoğunu kesmek genellikle mümkündür. Tam bir Z-projeksiyon Görüntü | gerçekleştirin Yığınlar | Z Projesi... tıklayın ve Maksimum yoğunluk'u seçin; X ve Y'de tüm embriyoyu içeren minimum yatırım getirisini çizin. Orijinal veri kümesi görüntü pencerelerine geçin, Düzenle | Seçim | Seçimi geri yükleyin ve Image | crop (Görüntü) seçeneğini belirleyerek kırpın.
      7. Embriyo dokularıyla kesişmeyen başlangıç ve uçtaki dilimleri kesin. Bunun için Görüntü |'ni seçin Yığınlar | Araçlar | Sökücüyü dilimleyin ve çıkarılacak ilk ve son dilimi belirtin, "artışı" 1 olarak değiştirdiğinizden emin olun (aksi takdirde yalnızca diğer tüm dilimleri kaldırır).
      8. Yeni veri kümesini yeniden konumlandırdıktan ve kırptıktan sonra yeni bir TIFF dosyası olarak kaydettiğinizden emin olun. Bu veri kümesi çok büyükse (GPU RAM'den daha fazlaysa), adım 3.3'te ("Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümünden) açıklandığı gibi XML/DHF5 olarak dışa aktarmak için BigDataViewer'ı kullanmayı düşünün.
5. OPT veri kümesi ön işleme ve yeniden yapılandırma
   1. Martins ve ^ark.19 ve Gualda ve ^ark.28'de açıklanan OPT veri kümesi ön işleme ve rekonstrüksiyonu için protokolü kullanın.

4.3D işleme, görselleştirme ve analiz

NOT: Burada, 3B görüntüleme veri kümelerinin görselleştirilmesine ve analizine izin veren veya bunları geliştiren farklı yazılım araçlarının olası uygulamalarının bir listesini sunuyoruz.

1. Drishti kullanarak 3B görüntüleme ve görselleştirme
   NOT: Drishti⁴⁰ , mikro-BT, konfokal/multifoton ve ışık tabakası mikroskobundan 3D ve 4D veri kümelerini keşfetmek ve sunmak için tasarlanmış ücretsiz bir bilimsel görselleştirme yazılımıdır. Burada bu yazılımı, tam montajlı immünofloresan boyama işleminin 3D render edilmesi ve görselleştirilmesi için kullanıyoruz (Adım 2; "3D görüntüleme için örnek hazırlama" bölümü). Kullanıcıların Drishti'yi nasıl çalıştıracaklarını anlamalarına yardımcı olmak için çevrimiçi olarak birden fazla öğretici vardır; "Ajay Limaye Drishti 3D tutorials" için çevrimiçi arama yapın. Drishti, TIFF dosyalarının yığınlarını doğrudan okuyamaz, bu nedenle önce yerel "pvl.nc" biçimine dönüştürülmeleri gerekir.
   1. Drishti yükleme klasöründe bulunan "drishtiimport.exe" aracını çalıştırın: Dosyalar | Yükleme | Dosya | "Gri tonlamalı TIFF görüntü dosyalarını seçin ve Fiji/ImageJ'den kaydedildiği gibi tek kanallı bir 3B yığın yükleyin. Çok kanallı bileşik yığın durumunda, kanalları Fiji/ImageJ'de bölün ve her birini ayrı ayrı kaydedin. Voksel tipi "ushort"; "Dosya"..."Farklı kaydet"..."TIF", tüm sorulara "y" yanıtını verin. Voksel boyutunu soran Ek bilgiler penceresinde, doğru "X Y Z" voksel boyutlarını eklediğinizden emin olun.
   2. *.pvl.nc dosyalarını Drishti'ye yükleme ve oluşturma: Drishti'nin ana penceresinde, Dosya | Yükleme | Kullanılabilir kanal sayısına bağlı olarak 1 ( - 4 ) birim yükleyin ( ayrı dosyalar olarak). Yükledikten sonra, yüksek kaliteli işleme için F2 tuşuna basın. Bu eylem güçlü bir GPU kartı gerektirir. İşleme parametrelerini işlemek için bilgiler, Aktarım işlevi düzenleyicisi, çevrimiçi öğreticilerde arama yapın. İşleme özelliklerinden memnun kaldıktan sonra, animasyonlu bir işleme oluşturmaya devam edin.
   3. Görüntüle'ye gidin ve Anahtar Kare düzenleyicisini etkinleştirin. Embriyoyu tutun ve istenen başlangıç pozisyonunda konumlandırın. Gerekirse embriyoyu merkeze "sürüklemek" için farenin sağ tuşunu kullanın veya yakınlaştırmak için fareyi kaydırın. Anahtar Kare düzenleyicide anahtar kareyi ayarla'ya basın, sonra başka bir konum, açı veya yakınlaştırma seçin, zaman çizgisi işaretçisini farklı bir zaman noktasına sürükleyin ve Anahtar kareyi yeniden ayarlayın. Artık embriyonun 2 farklı konumda / açıda / yakınlaştırmada temsil edildiği 2 ana kare ve aralarında bir dizi kare var. Oynat düğmesine basan Drishti, eksik koşulları interpolasyon yapabilir ve bir animasyon olarak oynatabilir. Dosya | Git Tüm karelerin animasyonlu dizisini kaydetmek için görüntü sırasını kaydet. Bu kare dizisi daha sonra Fiji/ImageJ'de açılabilir ve AVI (Dosya | | içe aktar Görüntü dizisi ... Dosya | Farklı Kaydet | Makul bir kare hızına sahip JPEG sıkıştırma (15 - 30 öneririz).
      NOT: Drishti, * .wmv videoların kaydedilmesine izin vermesine rağmen, bunun yerine ayrı kareler olarak kaydetmeniz ve yalnızca daha sonra seriyi AVI veya MOV video formatına dönüştürmeniz önerilir (bu, Fiji / ImageJ kullanılarak yapılabilir).
2. 3D sulandırmalar ve Amira kullanarak dokuların manuel olarak bölümlendirilmesi
   NOT: Bu ticari yazılım, 3B veri kümelerinde embriyonik dokuların manuel veya otomatik olarak / yarı otomatik olarak 3B segmentasyonuna izin verir. Bu yazılım için birden fazla öğretici içeren çevrimiçi bir "Öğrenme Merkezi" ^{bulunmaktadır 41}. Aşağıda, embriyonik dokuları immünofloresan boyalı embriyolardan manuel olarak segmentlere ayırmak için gereken temel adımlar açıklanmaktadır (adım 1.2). Embriyo standart bir A-P/D-V eksenine doğru şekilde yerleştirildikten sonra manuel segmentasyon çok daha kolaydır ("Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümüne, adım 4.3'e bakın).
   1. 3B TIFF veri kümesi yükleyin. Sorulduğunda doğru voksel boyutlarını belirttiğinizden emin olun. Bir görselleştirme modülü (ör. "Orthoslice" veya "Volren") oluşturup bağlayın ve veri kümesini 3B olarak inceleyin.
   2. Etiket alanını bağlayın (veya Amira'nın daha yeni sürümlerinde Yeni Etiket Alanını Düzenle). Bu yazılımda, manuel segmentasyonun sonuçları "malzemeler" içinde saklanır, bu nedenle ilgilenilen her doku için bir malzeme oluşturun. Manuel segmentasyon için "kement" aracını kullanın. Bunun nasıl gerçekleştirileceğini açıklayan birkaç öğretici vardır ("Amira Segmentasyon Editörü öğreticisi" için çevrimiçi arama yapın).
   3. İlgilendiğiniz tüm dokuların segmentasyonu tamamlandığında, Proje moduna geri dönerek Segmentasyon Düzenleyicisi'nden çıkın. Veri kümesinin yeni bir sürümünü (artık orijinal veri kümesi modülüne eklenmiş olan "etiketler alanı") oluşturduktan sonra, her malzemeye ait piksellerin aynı değere sahip olduğu.
   4. "Etiketler" veri kümesinden 3B yüzey modelleri oluşturarak bu "malzemeleri" 3B nesnelere dönüştürün. Bu, bir "Yüzey Oluştur" modülü takarak, parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak yapılabilir ("sıkıştır", "kenarlık", "Koordları Ayarla" ve "Sınırsız Düzgünleştirme" seçeneklerini etkinleştirin). Uygula'ya tıkladığınızda yeni bir *.surf modülü oluşturulur.
   5. Yüzey nesnelerini görselleştirme, ayrı ayrı *obj dosyaları olarak ayıklama ve dışa aktarma. Ekran | ekleme SurfaceView modülünü *.surf modülüne yerleştirin ve ana görüntüleyicide inceleyin. "SurfaceView" modülünün "özellikler" panelinde, "Malzemeler" özelliğinde Tümü + Tümü'nü seçin ve kaldır'ı tıklayın, böylece görüntüleyicinin arabelleği boşaltılır. Ardından, Malzemeler özelliğinin ikinci aşağı çekilmesinde yalnızca bir malzeme seçin ve Arabelleğe ekle'ye tıklayın; sadece o malzeme görünür olmalıdır.
   6. Çizim stili özelliğinde, yüzey oluşturmak | daha fazla seçeneğe tıklayın ve yeni bir *.surf modülü oluşturulur ve projeye eklenir. Dokunun adıyla yeniden adlandırın (klavyede F2 tuşuna basın) ve Dosya | Verileri Dışa Aktar... ve Kayıt türü: Wavefront (*.obj). Her malzeme için işlemi tekrarlayın.
      NOT: Her biri Amira'da bölümlere ayrılmış dokulardan birini içeren bu *.obj dosyaları, diğer araçlar ("Fiji/ImageJ ve SimLab'den 3Dviewer" eklentisi) tarafından kullanılabilir.
3. SimLab Composer kullanarak taşınabilir bir belge formatında (PDF) etkileşimli 3B görselleştirme
   NOT: Bu 3B Bilgisayar Grafikleri yazılımı, yüzeyden işlenmiş görüntülerin, animasyonların ve simülasyonların oluşturulmasını kolaylaştırır. Yararlı öğreticiler ⁴². satırda bulunabilir. Burada, bu yazılımın Amira ile oluşturulan wavefront (*.obj) 3D yüzey dosyalarını kullanarak 3D PDF etkileşimli illüstrasyonların oluşturulmasını nasıl sağladığını açıklıyoruz (Adım 2.3; "3D render, görselleştirme ve analiz" bölümü).
   1. Dosya | Git Yenidir ve boş bir sahne oluşturun. Ardından Dosya | Amira'dan kaydedilen 1. *.obj dosyasını içe ve içe aktarın. Dosyayı içe aktar penceresinin tüm seçeneklerini işaretsiz tutun ve Tamam'ı tıklatın.
   2. Composer'ın görüntüleme penceresinde hiçbir şey görünmüyorsa, Ctrl+F tuşlarına veya Tümünü sığdır simgesini tıklatın. Şimdi segmentlere ayrılmış nesne pencerenin ortasında görünmelidir. Başka bir parçalı nesne eklemek ve 1. nesneye göre konumunu onaylamak için işlemi tekrarlayın (örneğin, 2 bitişik somit).
   3. Farenin sol tuşuyla tıklayarak görüntüleme penceresindeki nesnelerden birini seçin, adını anatomik yapının veya dokunun adını yansıtacak şekilde değiştirin, ardından "3DGeom~1" gösterimine geçin ve Malzemeler panelini kullanarak R,G,B değerlerini değiştirerek rengi değiştirin.
   4. 3B illüstrasyon tamamen birleştirilene kadar tüm nesneler için bu işlemi tekrarlayın. Bazı malzemelerin, RGB değerlerinin yanındaki "Alfa" kanalı manipüle edilerek şeffaf hale getirilebileceğini ve böylece dahili veya tıkanmış nesnelerin gözlemlenmesine izin verilebileceğini unutmayın.
   5. Bu yazılım ile birleştirilen embriyo illüstrasyonu, yayınlara dahil edilebilen bir "3D PDF" dosyası olarak dışa aktarılabilir. İlk olarak, talimatları ve aynı çizimde üç farklı aşamayı içerebilecek şekilde "Sahne durumlarını" değiştirmek için metin ve etkin bağlantılar içeren bir "şablon" oluşturun. Bu, "Sahne oluşturma" modundan "Paylaşım" moduna (Besteci penceresinin solundaki düğmeler) geçerek, ardından PDF ayarlarını göster'i tıklayarak ve yeni bir sayfa şablonu oluşturarak yapılabilir. Bir makaleye dahil etmek üzere basit bir etkileşimli şekil oluşturmak için, şablon kullanmayın ve PDF'yi dışa aktarın.
      NOT: 3B PDF'lerle etkileşim kurmak için Adobe Acrobat Reader yazılımını kullanın (etkileşimli 3B PDF illüstrasyonundaki işlevlerin kullanılabilirliği, mevcut Acrobat Reader sürümlerine bağlı olarak değişebilir). Diğer görüntüleyicilerin çoğu, web tarayıcıları da dahil olmak üzere 3B PDF formatıyla uyumlu değildir. Bu tür 3D PDF etkileşimli illüstrasyonlar yayınlara dahil edilebilir; editörlere bu olasılığı önceden sorun.
4. Imaris kullanarak 3B görselleştirme ve analiz
   NOT: Bu yazılım, sezgisel arayüz ve iş akışları ile 2D-4D mikroskopi veri kümelerinin kapsamlı görüntüleme görselleştirmesine, analizine ve yorumlanmasına olanak tanır. Web sitesinde (https://imaris.oxinst.com/tutorials) bulunan bu yazılıma nasıl başlayacağınıza dair çevrimiçi birkaç yararlı öğretici vardır. Imaris'teki büyük veri kümelerini (genellikle GPU belleğinden daha büyük olanlar) yüklemek ve bunlarla daha etkili bir şekilde etkileşim kurmak için, Imaris yükleme klasöründe yüklü olan "ImarisFileConverter.exe" programını kullanarak veri kümesini önce "*.ims" ye dönüştürmeniz önerilir. ImarisFileConverter, Fiji'nin BigDataViewer tarafından kaydedilen OME ve "h5" dosyaları da dahil olmak üzere birçok mikroskopi görüntü formatını okuyabilir.
   1. 3B görselleştirme
      1. Bu yazılım, "3B Görünüm" modunu kullanarak veri kümesinin 3B görselleştirmesini oluşturabilir ve kullanıcı, veri kümesinin nasıl görüntülendiğine dair çeşitli ayarlamalar yapabilir [örneğin, MIP (Maksimum yoğunluk Projeksiyonu) veya karışım modu (derinlik ipuçları ve gölgelerle daha iyi işleme)] arasında seçim yapabilir.
      2. Ortogonal görünümler" modu - Uygun embriyo konumlandırması ile (Adım 4.3; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü) "Bölüm" sekmesini kullanabilir ve tüm embriyo boyunca gezinebilir ve normal düzlemlerden (enine, koronal ve sagital) optik bölümleri görebilir. Embriyolar uygun şekilde yeniden konumlandırılmazsa, anatomilerini ortogonal düzlemlerle yorumlamak son derece zordur (bakınız Ek Şekil 3). Imaris, 3D embriyoları analiz ederken bu probleme geçici bir çözüm bulmak için "referans çerçevesi" olarak bilinen bir işleve sahip olsa da, veri kümelerini a priori olarak yeniden konumlandırmak tercih edilir.
   2. 3D analiz
      NOT: Bu yazılım ayrıca morfoloji ve floresan yoğunluklarını analiz etmek için çeşitli araçlara sahiptir. Örnek olarak, burada, kullanıcının embriyodaki küresel ilgi alanlarını (ROI'ler) 3D olarak manuel olarak yerleştirdiği Imaris "Spots" aracını kullanarak zaman içindeki doku floresan yoğunluğu değişimlerini analiz etmek için basit bir iş akışını açıklıyoruz ve Imaris daha sonra bu küresel ROI'lerin içindeki doku floresansını ölçebilir.
      1. Imaris'te bir 3B veya 4B veri kümesi yükleyin ve 3B görünüm modunda yeni bir nokta ekleyin. Daha sonra, embriyonun belirli noktalarını seçebilir (ayrıca bir 4D veri kümesi kullanılıyorsa birkaç zaman noktası boyunca) ve bu noktaların içini, örneğin yoğunluk ortalamasını ölçebilir.
         NOT: Bu yazılım aynı zamanda zaman içinde yoğunluğun çizilmesine izin verir. Bu, kullanıcının şu gibi soruları kolayca cevaplamasını sağlar: "floresan zaman içinde bir somit içinde nasıl değişir?".
      2. Yeni spot ekle düğmesine tıklayarak veya 3B görünüm | Imaris menüsündeki noktalar. Otomatik tepkiyi atla, manuel olarak düzenle'yi seçin. Imaris işaretçisi modunu Git'ten Seç'e değiştirin (bu, klavyedeki ESC tuşuna basarak da yapılabilir).
      3. Spot özellikleri penceresinde, Spotun ekleneceği belirli kanalı seçin (örneğin, "Kanal 1") ve Manuel izleme bölümünde Seçilen noktaya otomatik bağlan ve Otomatik ilerlemeden önce gecikmeyi etkinleştir seçeneklerini etkinleştirin.
      4. Fare imlecini görselleştirme penceresine getirdiğinizde, imleç içi boş sarı bir tel küreye dönüşmelidir. Zaman noktası 1'e gidin ve ilgilendiğiniz dokuya tıklayarak bir nokta (=küre) ekleyin. Küre ("Spot") yalnızca shift tuşunu basılı tutarken tıklatıldığında eklenir. Zaman içinde dokunun aynı bölümünü izlediğinizden emin olmak için istediğiniz tüm zaman noktaları için tekrarlayın.
      5. Spot Noktaları Özellikleri penceresinde İstatistikler sekmesine geçin ve İstatistikler'in içinde Genel istatistikler'den Ayrıntılı istatistikler'e geçin. İlk açılır menüden Belirli değerler'i seçin ve ikinci açılır menüden "Yoğunluk ortalama Ch=*..."yi seçin, burada Ch*, ölçümün gerçekleştirileceği kanaldır. Spot özellikleri penceresinin sol alt kısmında "Zaman grafiği panelini açmak için tıklayın" seçeneğinin sağındaki bir düğme bulunur. Bu düğmeye tıklamak, zaman içinde çizilen "noktaların" içindeki medyan floresan yoğunluğuna sahip bir grafik açar. Bu değerler, daha fazla analiz için bir elektronik tabloya da aktarılabilir.

Representative Results

Bu yazıda hem canlı hem de immünofloresan görüntüleme için gösterilen temsili sonuçlar, 20 × 1.0 NA su hedefi, 960 nm'ye ayarlanmış uyarma lazeri ve GaAsP fotodetektörleri (Dias et al. (2020)^43'te açıklandığı gibi) ile iki fotonlu bir sistem kullanılarak elde edilmiştir. Optik projeksiyon tomografisi, özel yapım bir OPenT tarayıcı kullanılarak yapıldı (Gualda et al. (2013)^28'de açıklandığı gibi).

Canlı görüntüleme (4D analiz)
Eksenel ekstansiyon sırasında fare embriyolarında LuVeLu muhabir aktivitesinin temsili bir analizi, "Canlı görüntüleme için numune hazırlama" için açıklanan protokollere göre elde edilmiştir (Adım 1.1; "3D görüntüleme için örnek hazırlama" bölümü), "Canlı görüntüleme veri kümesi ön işleme" (Adım 3; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü) ve "Imaris kullanarak 3B görselleştirme ve analiz" (Adım 4.4; "3D işleme, görselleştirme ve analiz") Şekil 1 ve Video 1'de gözlemlenebilir.

3B görselleştirme ve analiz
"İmmünofloresan mikroskobu için numune hazırlama" ("3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama" bölümü, adım 1.2), "Dekonvolüsyon" ve "İmmünofloresan görüntüleme veri kümesi ön işleme" ("Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü, sırasıyla adım 3.2 ve 3.4) ve "İmmaris kullanarak 3D görselleştirme ve analiz" için açıklanan protokollerin ardından elde edilen potansiyel NMP'leri ve mezoderm farklılaşmasının anahtar düzenleyicilerini tespit etmek için immünofloresan tahlillerinin kullanımı için temsili bir sonuç. ("3B işleme, görselleştirme ve analiz", adım 4.4) Şekil 2'de gözlemlenebilir.

İmmünofloresan boyamaların 3D renderizasyonu
Video 2, "İmmünofloresan mikroskobu için numune hazırlama" için açıklanan protokollere göre elde edilen potansiyel NMP'leri tespit etmek için bir immünofloresan testi için temsili bir sonuç göstermektedir (Adım 1.2; "3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama" bölümü), "Dekonvolüsyon" ve "İmmünofloresan görüntüleme veri kümesi ön işleme" (sırasıyla Adım 3.2 ve 3.4; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü) ve "Drishti kullanarak 3B oluşturma ve görselleştirme" (Adım 4.1; "3D render, görselleştirme ve analiz" bölümü).

3D rekonstrüksiyonlar
Video 3 , "İmmünofloresan mikroskobu için numune hazırlama" için açıklanan yöntemler izlenerek oluşturulmuştur (Adım 1.2; "3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama" bölümü), "İmmünofloresan görüntüleme veri kümesi ön işleme" (Adım 3.4; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü) ve "Amira kullanarak dokuların 3B rekonstrüksiyonları ve manuel segmentasyonu" (Adım 4.2; "3D işleme, görselleştirme ve analiz"). Bir E9.5 vahşi tip (WT) fare embriyosunun kaudal dokularının immünofloresan boyamasına dayanan bir 3D rekonstrüksiyonunu gösterir.

İnteraktif 3B illüstrasyonlar
Şekil 3'te, fare embriyolarının kaudal dokularının taşınabilir bir belge formatında (3D PDF) rekonstrüksiyonunun etkileşimli bir 3D görselleştirmesini, "İmmünofloresan mikroskobu için örnek hazırlama" için açıklanan protokolleri izleyerek hazırlanmış olarak sunuyoruz (Adım 1.2; "3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama" bölümü), "İmmünofloresan görüntüleme veri kümesi ön işleme" (Adım 3.4; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü), "Amira kullanarak dokuların 3B rekonstrüksiyonları ve manuel segmentasyonu" ve "SimLab kullanarak taşınabilir bir belge formatında (PDF) etkileşimli 3B görselleştirme" ("sırasıyla 3B işleme, görselleştirme ve analiz", Adım 4.2 ve 4.3). Bu tür bir format, özellikle bir öğretim ortamında, bilimsel içeriği daha genel bir kitleye iletmeyi kolaylaştırmak için kolayca kullanılabilir. Etkileşimli görselleştirme, Adobe Acrobat Reader kullanımını gerektirir (3B eklentiye izin verin).

OPT veri kümesi görselleştirmesi
Video 4 , bir E18.5 fare fetüsünü görüntüledikten sonra OPT yeniden yapılandırılmış bir veri kümesinin temsili bir örneğini göstermektedir. Örnek, "Optik projeksiyon tomografisi için numune hazırlama" ("3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama" bölümü; Adım 1.3) "OPT veri kümesi ön işleme ve yeniden yapılandırma" (Adım 3.5) ve "3B işleme, görselleştirme ve analiz" in farklı modülleri (Adım 4). Bu veri kümesinde Fiji/ImageJ, Amira veya Imaris yazılımı kullanılarak ayrıntılı bir anatomik analiz (örneğin ölçümler) de gerçekleştirilebilir. Film dört video bölümü içeriyor: ilki Fiji/ImageJ ile üretilen bir dizi siyah beyaz sagital dilimi gösteriyor; İmaris ile üretilen ve ortogonal doku kısımlarının etkileşimli 3D dilimlenmesini ve oluşturulmasını gösteren ikinci ortogonal görünümler; üçüncüsü, Amira'da hazırlandığı gibi renkli sagital dilimlerden "toplanan" fetüsü gösterir; Son video segmenti, Drishti ile hazırlanan fetüsün farklı görünümlerden 3D olarak bir animasyonunu görüntüler.

Video 1 -Snai1-cKO'da LuVeLu muhabir ekspresyonunun iki fotonlu canlı görüntülenmesi ve E8.5 embriyolarının kontrolü (ref. 43'ten uyarlanmıştır). İlk bölümler muhabir etkinliğini zaman = 0 (5 μm adım boyutunda z-yığını) gösterir ve ikinci bölümler tam canlı görüntülemeyi içerir (her 8,5 dakikada bir 10 μm z-yığınları). Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2 - E10.5 vahşi tip kuyruk tomurcuğunun T (Brachyury) ve Sox2 için tam montajlı bir immünofloresan boyamanın 3D render'ı. T ifadesi macenta, Sox2 sarı ve DAPI gri renkte gösterilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 3 - Mezoderm de dahil olmak üzere farklı kaudal dokuların konturlanmasına odaklanarak, geç bir E9.5 vahşi tip fare embriyosunun kaudal kısmının 3D rekonstrüksiyonu. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız. 

Video 4 - E18.5 vahşi tip embriyo, optik projeksiyon tomografisi ile görüntülendiği gibi, in toto görüntülemeyi ve 3D veri kümelerini görselleştirmek ve işlemek için çeşitli teknikleri vurgulamaktadır. İlk bölüm Fiji/ImageJ'de hazırlanan bir dizi sagital dilimi, ikincisi Imaris'te işlenen "canlı" ortogonal görünümleri, üçüncüsü Amira'da hazırlanan renkli sagital dilimlerden sıralı bir render'ı ve dördüncüsü Drishti'de hazırlanan animasyonlu bir render'ı göstermektedir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 1: E8.5 Snai1-cKO ve kontrol embriyolarında LuVeLu muhabir ekspresyonunun 4D analizi (ref. 43'ten uyarlanmıştır). (A) LuVeLu muhabirinin Snai1-cKO(Meox2-Cre^+/0::Snai1^flox/-) (Aa) ve kontrol (Ab) embriyolarında zaman noktasında anlık görüntü = 0. Presomitik mezodermdeki normal LuVeLu sinyaline ek olarak, Snai1-cKO embriyoları ayrıca ilkel çizgiden (beyaz oklar) kaynaklanan ektopik çıkıntıda LuVeLu ekspresyonunu gösterir. (B) Snai1-cKO::LuVeLu^+/0 zamansal yoğunluk, kırmızı nokta (Ba) ile vurgulanan bölgedeki ortalama kantitatif analiz, iki pikin (t = 1.3 h ve t = 3.6 h hızda) varlığını ve bunlar arasında önemli bir azalma olduğunu gösterir, bu nedenle koşullu mutant embriyonun şişkinliğinde döngü aktivitesini düşündürür. İlkel çizginin yakınında LuVeLu bisiklet aktivitesine dair hiçbir işaret gözlenmedi (yeşil nokta; Bb) LuVeLu^+/0 kontrol embriyolarında. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: E9.5 Snai1-cKO ve WT embriyolarında tam montajlı immünohistokimya (ref. 43'ten uyarlanmıştır). (A) T (yeşil) ve Sox2 (kırmızı) için immün boyamalar. (B) Tbx6 (yeşil) ve Lam1 (kırmızı) için immün boyamalar. DAPI mavi renkle gösterilir. Farklı embriyoların (Aa, Ab, Ba ve Bb) kaudal kısmının 3D oluşturulması (karışım modu). Farklı embriyolar için enine (Aa1, Ab1, Ba1, Ba2, Bb1 ve Bb2) ve sagital (Aa2, Ab2, Ba3 ve Bb3) optik kesitler ile birlikte büyütmeler (Mag.) de gösterilmiştir. Büyütmeler DAPI olmadan gösterilir. Beyaz oklar, mutant embriyolardaki bazı NMP'lerin (T ve Sox2 çift pozitif hücreler) konumundaki farklılıkları vurgular. Sarı oklar ve ok uçları, Snai1-cKO embriyolarında sırasıyla ektopik / anormal Tbx6 ve Lam1 ekspresyonuna işaret eder. Ölçek çubukları 50 μm'ye karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 - 3B PDF - Eksenel genişleme sırasında wildtype fare embriyolarının parçalanmış kaudal dokularının 3D rekonstrüksiyonlarını gösteren 3D PDF formatında etkileşimli 3D illüstrasyon (E8.5, E9.5 ve E10.5). Segmentasyon Amira'da manuel olarak yapıldı ve 3D PDF Simlab Composer'da toplandı ve dışa aktarıldı. Etkileşimli görselleştirme Adobe Acrobat Reader gerektirir (3D eklentisine izin verin). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1 - Ağartılmış embriyonun temsili sonucu (Adım 3.2'den sonra; "3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama" bölümü). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2 - Z-derinlik sinyali zayıflamasının temsili sonucu (Adım 4.1; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü). A - Z-derinlik sinyali zayıflamasından önce; B - iyi Z-derinlik sinyali zayıflaması; C - yanlış Z-derinlik sinyali zayıflaması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3 - "Fiji/ImageJ kullanılarak embriyonun anatomik olarak standart bir konuma yeniden konumlandırılması" (Adım 3.4.3; "Görüntü veri kümesi ön işleme" bölümü) yeniden konumlandırılmadan aynı embriyoya karşı (B). Görselleştirme Imaris kullanılarak elde edilmiştir (bakınız Adım 4.1.2; "3D render, görselleştirme ve analiz" bölümü). Sarı renkte T, macenta Sox2 ve mavi renkte DAPI. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Eksenel uzama ve segmentasyon, omurgalı embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen en karmaşık ve dinamik süreçlerden ikisidir. Tek hücreli izleme ile 3D ve 4D görüntülemenin kullanımı, erişilebilirlik ve kültür koşullarının karmaşık görüntülemeyi kolaylaştırdığı zebra balığı ve tavuk embriyolarında bu süreçleri incelemek için bir süredir uygulanmaktadır 19,44,45,46,47,48,49 . Buna karşılık, fare embriyosunun orta ve geç organogenez aşamaları, örneğin intravital görüntülemede⁵⁰ gibi bazı ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, bu kadar ayrıntılı olarak yeterince çalışılmamıştır. Bu yazıda, boyun, gövde ve kuyruk oluşumu sırasında NMP'lerin ve mezoderm türevlerinin incelenmesini kolaylaştırmak için çok boyutlu görüntülerin elde edilmesi ve analizlerinin elde edilmesinde kullanılabilecek çeşitli metodolojiler için özel protokoller sunuyoruz. Bu protokoller fare embriyoları için tasarlanmış olmasına rağmen, eksplant sistemleri ve gastruloids^51,52 gibi 3D embriyonik kök hücre agregaları gibi in vitro modeller için çalışmak üzere kolayca ayarlanabilirler. Gerçekten de, insan gastruloidlerine⁵³ uygulanırsa, bu yöntemler, özellikle bu in vitro model sistemlerinin uzun süreli 4D canlı görüntüleme ile uyumluluğu göz önüne alındığında, insan eksenel uzama ve segmentasyonunun toto görüntülemesinde ve veri analizinde daha iyi bir olanak sağlayacaktır. Bu protokollere ek olarak, mevcut farklı mikroskopi teknikleri ve belirli deneysel hedeflere uymak için nasıl kullanılabilecekleri hakkında genel bilgiler de sağlıyoruz. Bu bilgilerin, araştırmacıların deneysel tasarımlarını geliştirmelerine ve laboratuvarlarında ve kurumlarında bulunan mikroskopi ekipmanlarından ve görüntü analiz araçlarından tam olarak yararlanmalarına yardımcı olacağını umuyoruz.

Numune hazırlama, bu makalede açıklanan protokollerin en önemli adımlarından biridir, çünkü diseksiyondan mikroskopta montaja kadar tüm prosedür boyunca embriyonun uygun şekilde korunması ve işlenmesi, yüksek kaliteli veriler elde etmek için esastır. Dehidrasyon (ve rehidrasyon), ağartma ve temizleme prosedürleri, numune hazırlama sırasındaki en kritik adımlardır ve görüntülemenin nihai sonucunu güçlü bir şekilde etkiler. Bu nedenle, bu adımları protokolümüzde detaylandırdık ve araştırmacıların örneklerinin lekesiz bir şekilde hazırlanmasını sağlamalarına yardımcı olacak ipuçları sağladık. Özellikle, implantasyon sonrası fare embriyolarını temizlemek için üç farklı çözümün kullanımını detaylandırdık (E11.5'e kadar). Metil salisilat ve BABB birkaç yıldır kullanılmasına ve etkili temizleme reaktifleri olmasına rağmen, bazı dokularda, özellikle mezodermde tam lazer penetrasyonunu elde etmek bazen zordur. Tersine, RapiClear'ın bu gelişim aşamalarında fare embriyolarının temizlenmesinde çok etkili olduğu bulunmuştur. Ellerimizde, çeşitli embriyonik dokularda tam lazer penetransı sağladığı kanıtlanmıştır ve toksik olmadığından ve embriyo dehidrasyon gerektirmediğinden, embriyoları mikroskopi slaytına monte etmenin temel adımını büyük ölçüde basitleştirir. Ayrıca, slayttaki embriyoları manipüle etme zorunluluğunun (temizlenmiş embriyolar şeffaf olduklarında manipüle edilmesi çok kırılgan ve zor hale gelir) veya ticari yazılıma (örneğin, Amira veya Imaris) başvurma ihtiyacının üstesinden gelmek için, görüntü ön işleme sırasında embriyonun veri kalitesini kaybetmeden anatomik olarak standart / spesifik bir konuma yeniden konumlandırılmasını sağlayan Fiji / ImageJ (ücretsiz açık kaynaklı yazılım) kullanarak basit ama verimli bir boru hattı sağladık. Bu nedenle, bu makalede sunduğumuz yöntem ve detayların, immünofloresan tahlilleri sırasında numune hazırlamanın kilit adımını kolaylaştırmasını ve iyileştirmeye katkıda bulunmasını bekliyoruz.

Görüntü elde etme sırasında, canlı görüntüleme için numunelerin nasıl muhafaza edilmesi gerektiğini veya 3D'de optimum gözlem için nasıl monte edilmesi gerektiğini etkileyen sistemin konfigürasyonunu dikkate almak önemlidir. Örneğin, fare embriyoları bir ısıtma kaynağına, yüksek seviyelerde_O2 ve sıvı besin bakımından zengin ortamlara (katı değil) ihtiyaç duyar, bu da dik veya geleneksel bir ışık tabakası konfigürasyonuna sahip bir mikroskopta canlı tutulmayı zorlaştırır. Embriyoların doğru 3D görüntülenmesi için immobilizasyon da önemlidir. Mevcut optikler de dikkate alınması gereken bir diğer önemli faktördür; Doğru 3D görüntüleme için, yüksek sayısal diyafram açıklığı hedefleri tercih edilmelidir, ancak bunlar özellikle büyük çalışma mesafeleri gerektiğinde (birkaç yüz mikrometreden fazla) her zaman mevcut değildir. Fizyolojik (yani, "daldırma") lensler canlı görüntüleme için çok yaygındır, ancak bunlar cam tabanlı bir tabakta görüntüleme veya BABB veya metil salisilat üzerine monte edilmiş temizlenmiş numuneler için ideal değildir. Temizlenmiş dokular için optimize edilmiş hedefler daha yaygın hale gelse de, çoğu laboratuvarda bulmak hala nispeten nadirdir. Temizlenmiş dokuları geleneksel hedeflerle görüntülemek de mümkündür, ancak kullanıcılar yukarıdaki bölümlerde açıkladığımız gibi, veri kümelerini yorumlamadan ve analiz etmeden önce sınırlamaların ve gerekli özenin farkında olmalıdır. Ayrıca, görüntüleme sonuçlarının doğru tespiti ve yorumlanması her zaman sadece cihazın değil, aynı zamanda çalışma koşullarının ve parametrelerin ayarlanmasının da dikkatli bir şekilde seçilmesini gerektirir. Kullanıcıların, uygun dijital görüntüleme ve biyogörüntülerin yorumlanması ilkelerini tam olarak anlamak için aşağıdaki yorumları 54,55,56,57 okumaları önerilir.

(2D) histolojik kesitlere uygulanan immünofloresan, embriyoların içindeki doku ve hücre organizasyonunu anlamaya çalışan çalışmaların ayırt edici özelliği olmuştur. Tam montajlı immünoetiketleme yöntemlerinin ve tahribatsız 3D görüntüleme tekniklerinin (burada tarif edilenler gibi) ortaya çıkması, gelişimsel biyologlara, gen ve protein ekspresyonunu ve bunların morfogenetik süreçlerle ilişkilerini anlamanın daha kolay ve daha doğru olduğu bozulmamış embriyolarda doku ve hücre mekansal organizasyonunu araştırmak için araçlar sağlamıştır. Toto görüntülemede, sanal histoloji (keyfi dilimlerde sanal bölümleme; Ek Şekil 3) ve 3B görselleştirme ve analiz araçları, hücre ve doku mimarisi ve iletişimi ile ilgili farklı hipotezleri kolayca keşfetmek için kullanılabilir (bkz. Şekil 2, Video 2 ve Video 4). Birçok derginin (örneğin, eLife ve Development) artık makalenin çevrimiçi versiyonuna video ekleme fırsatı verdiğini göz önünde bulundurarak, araştırmacıları bu fırsattan yararlanmaya ve yalnızca 3D ve 4D görüntüleme deneyleri ve analizleri yapmakla kalmayıp, aynı zamanda sonuçlarını vurgulayan 3D videolar yapmaya çağırıyoruz. Verilerin sunulma ve yayınlanma şeklindeki bu önemli değişiklik, sonuçların araştırmacılar ve meslektaşları tarafından daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Nihayetinde, bu yöntemler, özellikle NMP'lerin rolü ile ilgili olarak, omurgalı segmentasyonu hakkındaki anlayışımızı geliştirme potansiyeline sahiptir (Attardi ve ark. (2018)⁴⁵ ve Dias ve ark. (2020)⁴³ iki iyi örnektir).

Bu çalışmada, bazı yazılım araçlarının (örneğin, Amira ve Imaris, aynı zamanda Fiji / ImageJ ve Drishti gibi ücretsiz açık kaynaklı araçlar) kullanımının, omurgalı eksenel uzantısı ve somitogenezi bağlamında 3D veri görselleştirme ve analizine nasıl izin verdiğini ve geliştirdiğini vurguladık. Çoğu durumda, birkaç biyoinformatik araçta olduğu gibi, burada açıklanan yazılım potansiyel olarak bir başkasıyla değiştirilebilir (yani, birkaç yazılım çözümü ve işten çıkarma vardır). Bununla birlikte, Imaris'teki "3D View" işlevinin, örneğin MIP veya karışım modları arasında seçim yapmanıza izin veren "3D Viewer" Fiji / ImageJ eklentisi kullanılarak elde edilenden çok daha iyi kalitede bir 3D görselleştirmeye izin verdiğini görüyoruz. Ek olarak, Imaris'teki "Ortogonal Görünümler" işlevini ve 3D analiz ve niceleme için boru hattını (örneğin, "Spot" modülü) daha kullanıcı dostu buluyoruz. Bu konuda, pratik olarak tüm yazılım araçları bir tür 3D işlemeye izin verse de, son derece gerçekçi işlemelerin oluşturulmasını sağlayan benzersiz ışık modeli ve gölgelendirmesi nedeniyle Drishti'yi öneriyoruz ( Video 4'ün son bölümüne bakın). Görüntü veri kümelerinin tüm biyoinformatik işlemleri (ön işleme ve 3D görüntülemeler) için temel kural, nihai sonucun embriyoda gözlemlenenlerin sadık bir temsili olarak kalması gerektiğidir. Bu nedenle, görüntü veri kümelerinin kalitesini ve yorumlanmasını ciddi şekilde etkileyen Z ekseni ölçekleme bozulması (kırılma indisi uyumsuzluğu nedeniyle) ve derinlik sinyali zayıflamasının (derin örneklerde ışık saçılmasının neden olduğu) yarattığı sorunları azaltmak için basit yöntemler sağladık. Bu algoritmaları kullanarak, Amira yazılımını kullanarak manuel konturlama (genellikle otomatik segmentasyon araçlarıyla mümkün değildir) ile mezodermal dokuları tam montajlı immünofloresan boyamalardan manuel olarak segmentlere ayırmak ve 3D olarak yeniden yapılandırmak için talimatlar sağladık. Bu yazılımı, aralarında net bir fiziksel ayrım veya kontrast farkı olmayan dokuların manuel sayımı için özellikle yararlı buluyoruz (örneğin, belirli bir transkripsiyon faktörünün ifadesi). Amira için ticari olmayan bir alternatif, daha az güçlü olmasına rağmen, LabKIT Fiji / ImageJ eklentisidir (https://imagej.net/Labkit).

Ayrıca, temsili sonuçlar arasında, optik görüntüleme ve 3D görüntü analizinin yeteneklerini tüm fare embriyogenezi^22'ye genişleten optik projeksiyon tomografisi ile görüntülenen toto E18.5 fare fetüsünün 3D görselleştirme örneğini de ekledik. Bu metodolojiler, daha sonra somitogenez sırasındaki problemlerden (örneğin, Lfng mutasyonu) kaynaklanan sorunlar nedeniyle ortaya çıkabilecek kaynaşmış omurlar, skolyoz veya spondilokostal disostoz gibi iskelet anormalliklerini anlamak ve analiz etmek (örneğin, morfolojik ölçümler yoluyla) için kullanılabilir13,58,59,60,61,62 . Önemli olarak, bu görüntüleme yaklaşımı, vertebral kolon^63'ü etkileyen fenotiplere de katkıda bulunabilecek diğer dokular (örneğin, kaslar) dahil olmak üzere iskelet malformasyonlarının küresel bir bağlamda gözlemlenmesine izin verir.

Son olarak, eMouse Atlas Project^64'ten görüntüleme veri kümeleriyle yapılan hacimsel modelleri vurgulayan son çalışmalarla uyumlu olarak, hem 3D modellerin (örneğin, 3D PDF) gücünü daha genel bir kitleye göstermek hem de omurgalı eksenel uzama ve segmentasyonunun incelenmesine ve öğretilmesine yardımcı olmak için kullanılabilecek ayrıntılı bir adım adım yöntem tanımladık. Bu makalede sunulan bilgilerin, araştırmacıların deneylerini tasarlama, analiz etme ve sunma şeklini değiştirmeye ve omurgalı vücut ekseni oluşumu hakkındaki bilgimizi geliştirmeye katkıda bulunacağını umuyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher   Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence