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Developmental Biology

कशेरुक अक्षीय बढ़ाव और विभाजन का अध्ययन करने के लिए तीन और चार आयामी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण दृष्टिकोण

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62086
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

Summary

यहां, हम कम्प्यूटेशनल उपकरणों और विधियों का वर्णन करते हैं जो अक्षीय बढ़ाव और विभाजन के संदर्भ में माउस भ्रूण के तीन और चार आयामी छवि डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण की अनुमति देते हैं, टोटो ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी में प्राप्त किया जाता है, और मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव इमेजिंग और पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा।

Abstract

सोमिटोजेनेसिस कशेरुकी भ्रूण विकास की एक पहचान है। वर्षों से, शोधकर्ता विभिन्न प्रकार के जीवों में इस प्रक्रिया का अध्ययन कर रहे हैं, जो पूर्व विवो और इन विट्रो दृष्टिकोणों को शामिल करने वाली तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर रहे हैं। हालांकि, अधिकांश अध्ययन अभी भी दो-आयामी (2 डी) इमेजिंग डेटा के विश्लेषण पर भरोसा करते हैं, जो अक्षीय विस्तार और सोमिटोजेनेसिस जैसी विकासात्मक प्रक्रिया के उचित मूल्यांकन को सीमित करता है जिसमें एक जटिल 3 डी स्पेस में अत्यधिक गतिशील इंटरैक्शन शामिल हैं। यहां हम उन तकनीकों का वर्णन करते हैं जो माउस लाइव इमेजिंग अधिग्रहण, डेटासेट प्रसंस्करण, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण को 3 डी और 4 डी में इन विकास प्रक्रियाओं में शामिल कोशिकाओं (जैसे, न्यूरोमेसोडर्मल पूर्वजों) का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। हम माउस भ्रूण में ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी और पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं (नमूना तैयारी से छवि अधिग्रहण तक) और एक पाइपलाइन दिखाते हैं जिसे हमने 3 डी छवि डेटा को संसाधित करने और कल्पना करने के लिए विकसित किया है। हम इनमें से कुछ तकनीकों के उपयोग का विस्तार करते हैं और विभिन्न उपलब्ध सॉफ़्टवेयर (जैसे, फिजी / इमेजजे, दृष्टि, अमीरा और इमारिस) की विशिष्ट विशेषताओं को उजागर करते हैं जिनका उपयोग अक्षीय विस्तार और सोमाइट गठन (जैसे, 3 डी पुनर्निर्माण) की हमारी वर्तमान समझ में सुधार करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित तकनीकें विकासात्मक जीव विज्ञान में 3 डी डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के महत्व पर जोर देती हैं, और अन्य शोधकर्ताओं को कशेरुक अक्षीय विस्तार और विभाजन के संदर्भ में 3 डी और 4 डी छवि डेटा को बेहतर ढंग से संबोधित करने में मदद कर सकती हैं। अंत में, काम कशेरुक भ्रूण विकास को पढ़ाने की सुविधा के लिए उपन्यास उपकरणों को भी नियोजित करता है।

Introduction

कशेरुकी शरीर अक्ष गठन भ्रूण के विकास के दौरान होने वाली एक अत्यधिक जटिल और गतिशील प्रक्रिया है। गैस्ट्रुलेशन के अंत में [माउस में, भ्रूण दिवस (ई) 8.0 के आसपास], एपिब्लास्ट पूर्वज कोशिकाओं का एक समूह जिसे न्यूरोमेसोडर्मल पूर्वजों (एनएमपी) के रूप में जाना जाता है, एक सिर से पूंछ अनुक्रम में अक्षीय विस्तार का एक प्रमुख चालक बन जाता है, जिससे गर्दन, ट्रंक और पूंछ गठन के दौरान तंत्रिका ट्यूब और पैराएक्सियल मेसोडर्मल ऊतक उत्पन्न होतेहैं 1,2,3,4 . दिलचस्प बात यह है कि इन एनएमपी की स्थिति जो पुच्छल एपिब्लास्ट में कब्जा करती है, वह मेसोडर्म या न्यूरोइक्टोडर्म5 में अंतर करने के निर्णय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। यद्यपि वर्तमान में हमारे पास एनएमपी के लिए एक सटीक आणविक फिंगरप्रिंट की कमी है, इन कोशिकाओं को आमतौर पर टी (ब्रैक्यूरी) और सॉक्स 2 5,6 को सह-व्यक्त करनेके लिए सोचा जाता है। एनएमपी भाग्य निर्णयों को विनियमित करने वाले सटीक तंत्र (यानी, चाहे वे तंत्रिका या मेसोडर्मल मार्ग लेते हैं) केवल सटीक रूप से परिभाषित होना शुरू कर रहे हैं। आदिम लकीर क्षेत्र में Tbx6 अभिव्यक्ति एनएमपी भाग्य निर्णय का एक प्रारंभिक मार्कर है, क्योंकि यह जीन मेसोडर्म 6,7 के प्रेरण और विनिर्देशन में शामिल है। दिलचस्प बात यह है कि शुरुआती मेसोडर्म कोशिकाएं Epha18 के उच्च स्तर को व्यक्त करने लगती हैं, और WNT / β-कैटेनिन सिग्नलिंग, साथ ही Msgn1 को भी पैराक्सियल मेसोडर्म भेदभाव और सोमाइट गठन 9,10 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था। एकल-सेल स्तर पर एनएमपी का एक पूर्ण स्थानिक-अस्थायी विश्लेषण निश्चित रूप से मेसोडर्म विनिर्देश को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को पूरी तरह से समझने के लिए महत्वपूर्ण होगा।

सोमाइट्स (कशेरुका अग्रदूतों) का गठन कशेरुकियों की एक प्रमुख विशेषता है। अक्षीय दीर्घीकरण के दौरान, पराक्षीय मेसोडर्म द्विपक्षीय दोहराई जाने वाली इकाइयों की एक श्रृंखला में विभाजित हो जाता है जिसे सोमाइट्स के रूप में जाना जाता है। सोमाइट्स की संख्या और नए खंडों के गठन के लिए आवश्यक समयप्रजातियों के बीच भिन्न होता है 11,12। Somitogenesis आवधिक सिग्नलिंग दोलनों ("विभाजन घड़ी" के रूप में जाना जाता है) कि नॉच, WNT और Fgf सिग्नलिंग मार्गों के कई जीनों की चक्रीय अभिव्यक्ति द्वारा मनाया जा सकता है presomitic mesoderm (जैसे, Lfng)11,12 में शामिल हैं। सोमिटोजेनेसिस का वर्तमान मॉडल भी "परिपक्वता तरंग के मोर्चे" के अस्तित्व को दर्शाता है, जो एफजीएफ, डब्ल्यूएनटी और रेटिनोइक एसिड सिग्नलिंग को शामिल करने वाले जटिल सिग्नलिंग ग्रेडिएंट की एक श्रृंखला है जो प्रत्येक नए सोमाइट की पश्च सीमा की स्थिति को परिभाषित करती है। "विभाजन घड़ी" और "परिपक्वता तरंग के बीच एक समन्वित बातचीत इसलिए इन कशेरुक अग्रदूत मॉड्यूल की पीढ़ी के लिए मौलिक है क्योंकि इन प्रमुख मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं में गड़बड़ी के परिणामस्वरूप भ्रूण की घातकता या जन्मजात विकृतियों (जैसे, स्कोलियोसिस) के गठन में परिणाम हो सकता है 13,14,15।

इमेजिंग तकनीकों, बायोइमेज विश्लेषण विधियों और सॉफ़्टवेयर में पर्याप्त हालिया प्रगति के बावजूद, अक्षीय बढ़ाव और सोमिटोजेनेसिस के अधिकांश अध्ययन अभी भी एकल / पृथक दो-आयामी छवि डेटा (जैसे, वर्गों) पर भरोसा करते हैं, जो एक पूर्ण बहुआयामी ऊतक विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं देता है और भ्रूण विकास के दौरान होने वाली पैथोलॉजिकल विकृतियों (यानी उत्परिवर्तन के कारण) बनाम सामान्य रूपात्मक भिन्नता के बीच स्पष्ट अंतर को जटिल बनाता है। . 3 डी में इमेजिंग ने पहले से ही उपन्यास मॉर्फोजेनेटिक आंदोलनों को उजागर किया है, जो पहले मानक 2 डी विधियों 17,18,19,20 द्वारा पहचाना नहीं गया था, कशेरुकी सोमिटोजेनेसिस और अक्षीय विस्तार के तंत्र को समझने के लिए टोटो इमेजिंग की शक्ति को उजागर करता है।

माउस भ्रूण की 3 डी और 4 डी माइक्रोस्कोपी, विशेष रूप से लाइव इमेजिंग, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं और सटीक और सार्थक स्पैटियो-टेम्पोरल विश्लेषण की अनुमति देने के लिए नमूना तैयारी, छवि अधिग्रहण और डेटा पूर्व-प्रसंस्करण के दौरान महत्वपूर्ण चरणों की आवश्यकता होती है। यहां, हम माउस भ्रूण के लाइव इमेजिंग और पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग अक्षीय विस्तार और विभाजन के दौरान एनएमपी और मेसोडर्मल कोशिकाओं दोनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हम पुराने भ्रूण और भ्रूण के ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (ओपीटी) के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं, जो 3 डी इन टोटो विज़ुअलाइज़ेशन और पैथोलॉजिकल असामान्यताओं के परिमाणीकरण की अनुमति देता है जो सोमिटोजेनेसिस (जैसे, हड्डी संलयन और स्कोलियोसिस) के दौरान समस्याओं के परिणामस्वरूप हो सकते हैं 13,21,22। अंत में, हम कशेरुक विभाजन और अक्षीय बढ़ाव के अध्ययन और शिक्षण में 3 डी इमेजिंग पुनर्निर्माण की शक्ति को स्पष्ट करते हैं।

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Protocol

जानवरों से जुड़े प्रयोगों ने पुर्तगाली (पोर्टेरिया 1005/92) और यूरोपीय (निर्देश 2010/63/EU) आवास, पशुपालन और कल्याण से संबंधित कानूनों का पालन किया। परियोजना की समीक्षा की गई थी और 'Instituto Gulbenkian de Ciência' की नैतिकता समिति द्वारा और पुर्तगाली राष्ट्रीय इकाई द्वारा अनुमोदित किया गया था, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (लाइसेंस संदर्भ: 014308)।

1. 3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

नोट: यहां हम माउस E8.25 को लाइव इमेजिंग (1.1) के लिए E10.5 भ्रूण को विच्छेदन और तैयार करने के तरीके पर एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, E7.5 से E11.5 भ्रूण पूरे माउंट immunofluorescence माइक्रोस्कोपी (1.2) और ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (1.3) के लिए भ्रूण के लिए।

  1. लाइव इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी
    1. माउस भ्रूण विच्छेदन और लाइव इमेजिंग के लिए तैयारी (उदाहरण के लिए, LuVeLu रिपोर्टर 23).
      1. पूर्व-गर्म M2 माध्यम (37 °C) में E8.25 और E10.5 के बीच माउस भ्रूण को विच्छेदित करें। धीरे से साफ संदंश का उपयोग करके जर्दी की थैली को हटा दें और विच्छेदन के दौरान उत्पादित रक्त और मलबे को हटाने के लिए ताजा एम 2 माध्यम के साथ भ्रूण को एक बार धो लें।
        नोट: भ्रूण को किसी भी तरह से नुकसान पहुंचाने से बचना महत्वपूर्ण है, अन्यथा यह लाइव इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान ठीक से विकसित नहीं होगा।
      2. लाइव इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, एक गर्म कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस) में भ्रूण को इनक्यूबेट करें, 65% ओ2 और 5% सीओ2 वातावरण (एन2 संतुलित) में, कम ग्लूकोज डीएमईएम माध्यम में 10% HyClone परिभाषित भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 mM L-glutamine और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
        नोट: ये संस्कृति की स्थिति भ्रूण के विकास को लगभग 10 घंटे के लिए होने की अनुमति देती है। अन्य प्रोटोकॉल 9,10, विभिन्न संस्कृति स्थितियों का उपयोग करते हुए, और भी लंबी अवधि की अनुमति दे सकते हैं।
  2. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी
    1. माउस भ्रूण विच्छेदन और निर्धारण प्रक्रिया
      1. या तो ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (PBS) या M2 माध्यम में E7.5 से E11.5 करने के लिए माउस भ्रूण विच्छेदन। सभी अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली (उदाहरण के लिए, रीचार्ट की झिल्ली या जर्दी थैली) को हटाने के बाद विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान उत्पादित रक्त और मलबे को हटाने के लिए भ्रूण को ताजा पीबीएस में धोएं।
      2. तालिका 1 में निर्दिष्ट समय के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को ठीक करें।
        सावधानी - पीएफए को एक धुएं के हुड के अंदर संभाला जाना चाहिए
        विकास की अवस्था अनुशंसित निर्धारण समय (पीएफए 4%)
        E7.5 1h30
        E8.5 2h
        E9.5 3h
        E10.5 4h
        E11.5 4h
        तालिका 1 - विभिन्न विकास ता्मक चरणों में भ्रूण के लिए निर्धारण समय
      3. निर्धारण के बाद, पीएफए को पूरी तरह से हटाने के लिए पीबीएस में कम से कम दो बार (5-10 मिनट प्रत्येक) भ्रूण को धोएं। इस बिंदु पर, भ्रूण को सीधे इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल (चरण 1.2.2) में लिया जा सकता है या भविष्य के उपयोग के लिए निर्जलित और संग्रहीत किया जा सकता है (चरण 1.2.1.4)।
      4. यदि आवश्यक हो, तो लंबी अवधि के लिए 100% मेथनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण स्टोर करें।
        1. ऊतक संरक्षण में सुधार करने के लिए, मेथनॉल एकाग्रता (पीबीएस में पतला) में 10% वृद्धि के साथ भ्रूण को धीरे-धीरे निर्जलित करें, प्रत्येक चरण 100% मेथनॉल तक पहुंचने तक, एक शेकर पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट। एक बार ताजा ऐलीकोट का उपयोग करके 100% मेथनॉल को बदलें।
        2. एक रिवर्स मेथनॉल / पीबीएस श्रृंखला के बाद पुनर्जलीकरण द्वारा जमे हुए भ्रूण को पुनर्प्राप्त करें, प्रत्येक चरण एक शेकर पर आरटी पर 10 मिनट, और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल में प्रवेश करने से पहले पीबीएस (दो बार, 5-10 मिनट प्रत्येक) में अंतिम धोने के साथ।
          सावधानी - मेथनॉल को एक धुएं के हुड के अंदर संभाला जाना चाहिए।
    2. पूरे माउंट immunofluorescence धुंधला
      नोट:: निम्न immunofluorescence धुंधला प्रोटोकॉल Osorno et al.24 में वर्णित प्रक्रिया से अनुकूलित किया गया था। सभी धोने को शेकर पर किया जाना चाहिए। अवरुद्ध चरण के बाद, एंटीबॉडी अखंडता / संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए ऊष्मायन 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है।
      1. पीबीएस में तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (0.1% पीबीएसटी) और फिर 0.5% पीबीएसटी में एक बार 1 घंटे (आरटी) के लिए 0.5% पीबीएसटी में एक बार परमेबिलाइजेशन में सुधार करने के लिए धोएं।
      2. गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए, RT पर 30 मिनट के लिए PBS (pH 7.5) में 1 M ग्लाइसिन में धोएं।
      3. ग्लाइसिन को पूरी तरह से हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 0.1% पीबीएसटी में तीन बार धोएं।
      4. ब्लॉकिंग समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को रात भर इनक्यूबेट करें जिसमें शामिल हैं: सीरम का 3% (पशु प्रजातियों से जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी का उत्पादन किया गया था), गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) का 1% और ट्राइटन एक्स -100 का 0.1%, पीबीएस में।
      5. ब्लॉकिंग समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें (आमतौर पर टी और सॉक्स 2 एंटीबॉडी के लिए 1: 200) और 4 डिग्री सेल्सियस पर दो से तीन दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
      6. द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ने से पहले, भ्रूण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% पीबीएसटी में तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) धोएं। ब्लॉकिंग समाधान (1: 1000) में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें, जो प्रकाश से संरक्षित है।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% PBST में छह बार (30 मिनट प्रत्येक) भ्रूण धोएं।
      8. परमाणु काउंटरस्टेनिंग के लिए, 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) में भ्रूण को इनक्यूबेट करें, PBST में 1:500 पतला, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रात भर, प्रकाश से संरक्षित।
      9. अंत में, भ्रूण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% पीबीएसटी में तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) धोएं।
    3. ऊतक समाशोधन और स्लाइड तैयारी
      1. मिथाइल सैलिसिलेट या बेंज़िल बेंज़ोएट (BABB) के साथ बेंज़िल अल्कोहल के मिश्रण का उपयोग करके ऊतक समाशोधन
        1. मिथाइल सैलिसिलेट या बीएबीबी का उपयोग करके साफ़ करने से पहले, मेथनॉल / पीबीएस श्रृंखला के माध्यम से 100% मेथनॉल में लाकर भ्रूण को पूरी तरह से निर्जलित करें, जिसमें मेथनॉल एकाग्रता में लगातार 10% की वृद्धि होती है (4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 10 मिनट का इनक्यूबेशन गुना)। पूर्ण निर्जलीकरण प्राप्त करने के लिए, एक ताजा के लिए 100% मेथनॉल को बदलें और अतिरिक्त 10 मिनट की प्रतीक्षा करें।
        2. मेथनॉल में मिथाइल सैलिसिलेट या बीएबीबी की एक श्रृंखला में एम्बेड करके भ्रूण समाशोधन करें, जिसमें एकाग्रता में 20% क्रमिक वृद्धि होती है, प्रत्येक चरण के लिए 20 मिनट इनक्यूबेशन। जब मिथाइल सैलिसिलेट या बीएबीबी समाधान 100% तक पहुंच जाता है, तो एक ताजा समाधान के लिए दो अतिरिक्त परिवर्तन करें।
          सावधानी: मिथाइल सैलिसिलेट और बीएबीबी दोनों को एक धुएं के हुड के अंदर संभाला जाना चाहिए।
          नोट: उचित समाशोधन के लिए, यह आवश्यक है कि भ्रूण पूरी तरह से निर्जलित हों। यह भी आवश्यक है कि मेथनॉल पूरी तरह से मिथाइल सैलिसिलेट या बीएबी के साथ समाशोधन समाधान श्रृंखला में मिश्रित हो।
        3. भ्रूण पूरी तरह से पारदर्शी होने के बाद, ऊतक क्षति की संभावना को कम करने के लिए अधिमानतः एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके उन्हें व्यक्तिगत रूप से संभालें।
        4. इमेजिंग के लिए, या तो 75 मिमी x 25 मिमी अवसाद अवतल ग्लास स्लाइड या 20 मिमी x 60 मिमी # 1.5 कवरग्लास में माउंट भ्रूण। यदि आवश्यक हो तो उत्तरार्द्ध विकल्प दोनों पक्षों से इमेजिंग की अनुमति देगा, लेकिन यह अधिक नाजुक और सील करना मुश्किल है। एक टूथपिक, एक ठीक कपास टिप, एक पाश्चर पिपेट या किसी अन्य समान उपकरण का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड में भ्रूण स्थानांतरित करें।
        5. भ्रूण को संपीड़ित करने से बचने के लिए, # 1 कवरग्लास शार्ड्स (170 μm मोटी), सिलिकॉन या पतली धातु वाशर से बने स्पेसर जोड़ें। फिर बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें, # 1 या # 0 20x20 मिमी कवरग्लास और सील के साथ कवर करें।
        6. यदि ग्लास या धातु स्पेसर्स का उपयोग कर रहे हैं, तो तैयारी को बेहतर ढंग से स्थिर करने के लिए पिघले हुए पैराफिन के साथ सील करें - नेल-पॉलिश के साथ सील न करें क्योंकि यह मिथाइल सैलिसिलेट या बीएबीबी के साथ घुल जाता है। बुलबुले से बचने के लिए, कवरस्लिप को एक तरफ रखें और फिर, धीरे-धीरे और धीरे-धीरे इसे बग़ल में स्लाइड करें; यदि आवश्यक हो तो अधिक माध्यम जोड़ें।
          नोट: कृपया वीडियो को बेहतर ढंग से समझने के लिए देखें कि कैसे साफ़ किए गए भ्रूण में हेरफेर किया जाए और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उन्हें कैसे माउंट किया जाए।
      2. RapiClear के साथ ऊतक समाशोधन
        1. RapiClear का उपयोग करते समय, भ्रूण निर्जलीकरण की आवश्यकता नहीं होती है। चरण 1.2.2.9 के बाद, भ्रूण को 75 मिमी x 25 मिमी अवसाद अवतल ग्लास स्लाइड के केंद्र में रखें, माइक्रोस्कोप अवसाद स्लाइड में सभी पीबीएसटी को हटा दें और समाशोधन समाधान के 200 μL जोड़ें।
        2. प्रकाश से संरक्षित 10 मिनट के बाद, जब भ्रूण पारदर्शी बनना शुरू करते हैं, तो समाशोधन समाधान को बदलें, अतिरिक्त 20 मिनट (प्रकाश से संरक्षित) प्रतीक्षा करें और फिर एक कवरस्लिप के साथ शीर्ष पर, एक तरफ से शुरू होकर धीरे-धीरे दूसरी ओर बढ़ रहे हैं।
          नोट: भ्रूण को पूरी तरह से साफ करने का समय भ्रूण के चरण और आकार के आधार पर कुछ मिनटों से रात भर तक जा सकता है। इसके अलावा, पूरी प्रक्रिया को एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए। समाशोधन और माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयारी को बेहतर ढंग से समझने के लिए, कृपया वीडियो प्रोटोकॉल देखें।
  3. ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी के लिए नमूना तैयारी
    नोट:: निम्न कार्यविधियाँ पिछले प्रोटोकॉल से अनुकूलित किए गए थे19,25,26. प्रोटोकॉल E18.5 माउस भ्रूण के विश्लेषण के लिए वर्णित किया जाएगा।
    1. माउस भ्रूण विच्छेदन और निर्धारण प्रक्रिया
      1. ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस में E18.5 माउस भ्रूण को विच्छेदित करें, सभी अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली को हटा दें और फिर विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान उत्पादित रक्त और मलबे को हटाने के लिए भ्रूण को ताजा पीबीएस में कई बार धोएं।
      2. पीबीएस में बने 4% पीएफए में भ्रूण को ठीक करें, 5 से 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      3. पीबीएस में भ्रूण को एक बार (15 मिनट) धोएं और फिर तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) अखनिजीकृत पानी या पीबीएस में धोएं। एक शेकर पर washes प्रदर्शन.
      4. 100% मेथनॉल तक बढ़ती सांद्रता (10% अखनिजीकृत पानी या पीबीएस में पतला 10% की वृद्धि) के मेथनॉल समाधानों में इनक्यूबेशन (एक शेकर पर आरटी पर 25 मिनट श्रृंखला) द्वारा भ्रूण को निर्जलित करें।
      5. पूर्ण निर्जलीकरण सुनिश्चित करने के लिए 100% मेथनॉल समाधान (एक ताजा एलीकोट का उपयोग करें) को तीन बार (प्रत्येक 20 मिनट) बदलें। भ्रूण को तब -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या सीधे (एक दिन बाद) ब्लीचिंग प्रक्रिया (चरण 1.3.2) में ले जाया जा सकता है।
    2. विरंजन प्रक्रिया
      1. प्राकृतिक रंजकता को दूर करने के लिए, एक शेकर पर भ्रूण (अलग से) को इनक्यूबेट करें, पहले मेथनॉल में 5% एच202 में एक दिन के लिए और फिर मेथनॉल में 10% एच202 में 3 दिनों तक के लिए जब तक कि भ्रूण सभी प्राकृतिक रंजकता को खो न दें।
        सावधानी: एच2ओ2 को एक धुएं के हुड के अंदर धीरे से संभाला जाना चाहिए। नमूने के संपर्क में आने पर एच2ओ2 युक्त ब्लीचिंग समाधान वाष्प बनाता है और इसलिए, भ्रूण युक्त ट्यूब को पूरी ब्लीचिंग प्रक्रिया के दौरान खुला रहना चाहिए। कुछ ब्लीचिंग प्रोटोकॉल फॉर्मामाइड के साथ एच2ओ2 के संयोजन का सुझाव देते हैं। यदि इस विकल्प का उपयोग किया जाता है, तो अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि एच2ओ2 को अनडिल्यूटेड फॉर्मामाइड में जोड़ने से विस्फोट हो सकता है।
      2. धीरे-धीरे एक रिवर्स मेथनॉल श्रृंखला (10% की कमी के साथ) में भ्रूण को फिर से हाइड्रेट करें, प्रत्येक को एक शेकर पर आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, और अंत में तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) को अखनिजीकृत पानी में धोया जाता है। एक दिन प्रतीक्षा करें, अखनिजीकृत पानी बदलें और आगे बढ़ें।
        नोट:: विरंजन प्रक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम के लिए पूरक चित्र1 देखें।
    3. अखनिजीकरण प्रोटोकॉल
      नोट: अखनिजीकरण वैकल्पिक है लेकिन भ्रूण या पिल्ले के लिए अनुशंसित है।
      1. कुछ घंटों के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम ईडीटीए में भ्रूण को धोकर अखनिजीकरण करें [चो एट अल.27 भी देखें] इसके बाद ईडीटीए को पूरी तरह से हटाने के लिए अखनिजीकृत पानी के साथ पांच वॉश (20 मिनट प्रत्येक) होते हैं। एक शेकर पर सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
    4. समाशोधन के लिए नमूना तैयारी
      1. एक 1% agarose ब्लॉक में भ्रूण एम्बेड. इन ब्लॉकों को तैयार करने के लिए एक 50 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब या सिरिंज को भरने के लिए (सिरिंज के निकास पक्ष को काटकर और विपरीत पक्ष को अवरुद्ध करने के लिए प्लंजर का उपयोग करके एक बेलनाकार स्थान का निर्माण) पिघले हुए एगारोज़ के साथ, भ्रूण को एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में एगारोज़ में रखें और इस स्थिति को ब्लॉक के केंद्र में रखें।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस (30 मिनट) पर ब्लॉक के साथ मोल्ड रखें agarose के लिए पूरी तरह से jellify करने के लिए। ब्लॉक के भीतर भ्रूण की गलत स्थिति या हवा के बुलबुले की उपस्थिति के मामले में, ब्लॉक को रात भर 50 डिग्री सेल्सियस पर रखकर एगारोज़ को पिघलाएं, और अगले दिन प्रक्रिया को दोहराएं।
      3. मोल्ड से भ्रूण के साथ agarose ब्लॉक निकालें और इसे demineralized पानी के साथ एक कंटेनर में जगह है। 15 मिनट के बाद ताजा अखनिजीकृत पानी के साथ बदलें।
      4. BABB के साथ समाशोधन करने से पहले, नमूने को निर्जलित करें। ऊतक अखंडता को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए, मेथनॉल एकाग्रता में 10% वृद्धि के साथ धीरे-धीरे भ्रूण निर्जलीकरण करें (अखनिजीकृत पानी या पीबीएस में पतला), एक शेकर पर आरटी में 45 मिनट से अधिक समय तक प्रत्येक कदम, 100% मेथनॉल तक पहुंचने तक।
      5. 100% मेथनॉल बदलें (एक ताजा ऐलीकोट का उपयोग करें), पहले एक घंटे के अंतराल में चार बार और फिर पूर्ण निर्जलीकरण सुनिश्चित करने के लिए अगले दिन फिर से।
    5. OPT इमेजिंग के लिए समाशोधन प्रक्रिया और नमूना बढ़ते
      1. मेथनॉल में BABB समाधान की एक श्रृंखला (2.5 घंटे प्रत्येक) के माध्यम से एक शेकर पर भ्रूण को साफ़ करें, जिसमें 100% BABB तक पहुंचने तक BABB एकाग्रता में 25% की वृद्धि हुई है।
      2. BABB समाधान को हर दिन एक ताजा के साथ बदलें, जब तक कि भ्रूण पूरी तरह से पारदर्शी न हो जाए। इस प्रक्रिया में 3 से 5 दिन लग सकते हैं। पूरी प्रक्रिया के दौरान एक शेकर पर भ्रूण युक्त ब्लॉक रखें। भ्रूण लंबे समय तक 100% BABB समाधान में रह सकते हैं।
        नोट: यदि भ्रूण सही ढंग से निर्जलित नहीं है, तो यह पहले BABB जोड़ने के बाद थोड़ा पारभासी ("सफेद" इमल्शन) हो जाएगा। यदि ऐसा होता है, तो शुद्ध मेथनॉल में वापस कदम रखें और ताजा मेथनॉल में दो अतिरिक्त वॉश करें। निर्जलीकरण और समाशोधन करते समय नमूनों को कभी भी ठंडा न करें, क्योंकि तापमान में परिवर्तन से पानी के संघनन हो सकते हैं।
      3. ओपीटी स्कैनर की मोटर धुरी के लिए साफ किए गए एगारोज़ ब्लॉक को संलग्न करें, पूरे भ्रूण की छवि प्राप्त करने के लिए प्रकाशिकी को समायोजित करें और एक पूर्ण प्रक्षेपण डेटासेट19,28 प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें।

2. माइक्रोस्कोप /

  1. सही 3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए, माइक्रोस्कोप चुनें जो प्रयोगात्मक लक्ष्य को सबसे अच्छा फिट बैठता है। तालिका 2 चयन के माध्यम से मार्गदर्शन करने के लिए सामान्य जानकारी प्रदान करती है।
ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक इमेजिंग सिद्धांत प्रयोगात्मक लक्ष्य और विचार
वाइडफील्ड इमेजिंग प्रतिदीप्ति, परावर्तित या संचारित प्रकाश का उपयोग करता है। भ्रूण के त्वरित और सामान्य अवलोकन के लिए आदर्श (उदाहरण के लिए स्क्रीनिंग के लिए और विकास के चरणों और स्पष्ट फेनोटाइप का आकलन करने के लिए)। उच्च आवर्धन पर अवलोकन योग्य मोटाई की तुलना में कम गहराई-क्षेत्र 3 डी आकृति विज्ञान की सटीक व्याख्या या विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है।
Confocal (लेजर स्कैनिंग; CLSM) लेजर स्कैनिंग रोशनी और एक pinhole के माध्यम से प्रतिदीप्ति का पता लगाने का उपयोग करता है. फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले नमूनों के ऑप्टिकल स्लाइस की इमेजिंग की अनुमति देता है, आदर्श रूप से एक मजबूत संकेत के साथ। एक पिनहोल के माध्यम से इमेजिंग सिग्नल को गहराई-क्षेत्र से बाहर निकालती है, जिससे 3 डी में जानकारी के सटीक भेदभाव की अनुमति मिलती है। अधिग्रहण वाइडफील्ड की तुलना में धीमी गति से परिमाण का आदेश है, लेकिन अद्वितीय विपरीत और आकृति विज्ञान के 3 डी भेदभाव के साथ। उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने योग्य नहीं है क्योंकि छवियों को एक समय में 1-पिक्सेल प्राप्त किया जाता है। E9.5 तक निश्चित माउस भ्रूण के 3 डी इमेजिंग के लिए अच्छा है। पूरे प्रीसोमिटिक मेसोडर्म या सोमाइट्स के माध्यम से इमेजिंग को गहरे ऊतकों में प्रकाश-प्रकीर्णन के कारण ऊतक-समाशोधन की आवश्यकता होती है। फोटोटॉक्सिसिटी और ब्लीचिंग एक विचार है। Photobleaching, सीमा के भीतर, एक पश्चवर्ती क्षतिपूर्ति की जा सकती है। हालांकि, लाइव नमूनों में फोटोटॉक्सिक प्रभाव नहीं हो सकते हैं, और अक्सर यह निर्धारित करना आसान नहीं होता है। यह अधिक स्पष्ट है यदि नमूने कम अभिव्यक्ति दिखाते हैं, और उच्च-लेजर शक्तियों की आवश्यकता होती है।
दो फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति (TPEFM) यह दृश्यमान लेजर रोशनी के बजाय स्पंदित निकट-अवरक्त (एनआईआर) लेजर उत्तेजना का उपयोग करता है। TPEFM CLSM की तुलना में मोटे नमूनों के माध्यम से ऑप्टिकल स्लाइसिंग की अनुमति देता है। रिज़ॉल्यूशन थोड़ा कम है, लेकिन गहरे ऊतकों में इसके विपरीत काफी बेहतर है, जिससे यह माउस भ्रूण की लाइव इमेजिंग के लिए आदर्श है। हालांकि TPEFM को अक्सर पारंपरिक CLSM की तुलना में कम फोटोटॉक्सिक माना जाता है, इसके लिए उच्च लेजर शक्तियों की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं और ऊतकों पर हानिकारक प्रभाव भी डाल सकती हैं। E11.5 तक भ्रूण के 3 डी इमेजिंग के लिए आदर्श, हालांकि पूरे प्रीसोमिटिक मेसोडर्म के माध्यम से इमेजिंग को अभी भी ऊतक-समाशोधन की आवश्यकता होती है।
Confocal (कताई डिस्क) कॉन्फोकल का एक रूप जो एक लेजर के बजाय, कई बिंदु-जैसे स्रोतों का उपयोग करता है। कई बिंदु जैसी संरचनाओं का उपयोग CLSM की तुलना में ऑप्टिकल स्लाइस (कई फ्रेम प्रति सेकंड या प्रति मिनट स्टैक प्राप्त करने योग्य हैं) के तेजी से निर्माण की अनुमति देता है। अधिग्रहण व्यावहारिक रूप से वाइडफील्ड के रूप में तेजी से है, उचित 3 डी भेदभाव के साथ। हालांकि, यह केवल माउस भ्रूण के सबसे सतही ऊतकों की इमेजिंग की अनुमति देता है। CLSM की तुलना में अधिक संवेदनशील पहचान की अनुमति देता है, जिससे यह प्रतिदीप्ति प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति वाले भ्रूण के लिए एक विकल्प बन जाता है।
लाइट शीट / एकल विमान (LSFM / SPIM) वाइडफील्ड या बिंदु जैसी रोशनी के बजाय, नमूने को एक समय में एक ओर्थोगोनल विमान को रोशन किया जाता है। अधिकांश कॉन्फ़िगरेशन में, यह कई कोणों से इमेजिंग की अनुमति देता है। इसके अलावा फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले नमूनों की आवश्यकता होती है। ऑप्टिकल स्लाइस अधिग्रहण का अधिग्रहण बेहद तेज है (प्रति सेकंड कई फ्रेम) और फोटोटॉक्सिसिटी या ब्लीचिंग के प्रभाव को कम कर दिया है। हालांकि, यदि मल्टीव्यू की आवश्यकता होती है, तो बाद के डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण चरणों को गणना के घंटों / दिनों की आवश्यकता हो सकती है। LSFM / SPIM CLSM की तुलना में कम अभिव्यक्ति के स्तर का बेहतर पता लगाने की अनुमति देता है। गैस्ट्रुलेशन के दौरान टोटो माउस भ्रूण में 3 डी इमेजिंग के लिए आदर्श। नमूनों को अक्सर निलंबन (अपरंपरागत तैयारी) में घुड़सवार और बनाए रखने की आवश्यकता होती है।
ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (OPT) ऑप्टिकल स्लाइस का पता नहीं लगाया जाता है, लेकिन विभिन्न कोणों ("अनुमानों") से पूरे भ्रूण की वाइडफील्ड छवियों की एक श्रृंखला से गणना की जाती है। बाद के चरण माउस भ्रूण / भ्रूण (>5 मिमी) के 3 डी इमेजिंग के लिए आदर्श, लेकिन केवल तय और साफ किया गया। फ्लोरोसेंट और गैर-फ्लोरोसेंट नमूनों दोनों के ऑप्टिकल स्लाइस के 3 डी स्टैक का उत्पादन करने का लाभ है। डेटासेट आइसोमेट्रिक (सभी तीन आयामों में समान रिज़ॉल्यूशन के साथ स्लाइस) हैं जो इसे शारीरिक विश्लेषण के लिए आदर्श बनाते हैं। एक प्रक्षेपण डेटासेट प्राप्त करने के लिए केवल कुछ मिनटों की आवश्यकता हो सकती है, इसके बाद पुनर्निर्माण के 15-30 मिनट हो सकते हैं।
ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी (OCT) प्रकाश परावर्तन के साथ हस्तक्षेप के आधार पर ऑप्टिकल स्लाइस प्राप्त करने के लिए नमूने के माध्यम से एनआईआर रोशनी का उपयोग करता है। OCT कुछ दर्जन माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन के साथ लाइव ऊतक (फ्लोरोसेंट कंट्रास्ट के बिना नमूने में कुछ मिलीमीटर गहरे) के माध्यम से आसान इमेजिंग की अनुमति देता है। अधिग्रहण बहुत तेज है (प्रति सेकंड कुछ स्लाइस)। हालांकि यह OPT के लिए एक संभावित विकल्प है, यह तकनीक आमतौर पर उपलब्ध नहीं है।
सुपर-रिज़ॉल्यूशन (SR), परमाणु बल (AFM) या निकट-क्षेत्र इमेजिंग (NSOM) एसआर आमतौर पर उप-विवर्तन रिज़ॉल्यूशन (कुछ नैनोमीटर) पर स्कैनिंग सतहों पर एकल-अणु स्थानीयकरण और एएफएम / एनएसओएम पर आधारित होता है। उप-विवर्तन स्तर (<200nm रिज़ॉल्यूशन) पर इमेजिंग की अनुमति देता है, अक्सर सेल की सतह पर एकल अणुओं या अणुओं का पता लगाने के इरादे से। माउस भ्रूण जैसे बड़े नमूनों के रूपात्मक विश्लेषण के लिए आदर्श नहीं है। अधिग्रहण आमतौर पर एक धीमी प्रक्रिया है (छवि प्रति सेकंड से मिनट)।

तालिका 2 - शोधकर्ता के विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्य के लिए अधिक उपयुक्त इमेजिंग तकनीक / माइक्रोस्कोप के चयन का मार्गदर्शन करने के लिए सामान्य जानकारी।

3. छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण

नोट: यहां हम छवि डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण के कुछ प्रमुख चरणों को उजागर करते हैं, अर्थात् शोर में कमी (3.1) और डिकंवोल्यूशन (3.2), और एल्गोरिदम प्रदान करते हैं जो 3 डी डेटासेट समय-श्रृंखला (3.3) और पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग (3.4) की उचित तैयारी और पूर्व-प्रसंस्करण की अनुमति देते हैं। अंत में, हम उन संदर्भों को इंगित करते हैं जो OPT डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं।

  1. शोर में कमी
    1. यदि छवियां कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात दिखाती हैं, तो फिजी / इमेजजे29 में उपलब्ध "मीडियन" फ़िल्टर या "अनिसोट्रोपिक प्रसार" जैसी शास्त्रीय विधि को लागू करने पर विचार करें, या मशीन लर्निंग पर आधारित एक अधिक विस्तृत विधि जैसे "CARE" 30 या "Noise2Void"31।
      नोट: यह लाइव इमेजिंग डेटासेट के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है, जहां फोटोब्लीचिंग और फोटोडैमेज एक प्रमुख चिंता का विषय है, और कम एक्सपोज़र और उच्च डिटेक्टर लाभ आवश्यक हैं।
  2. विवहन
    1. यदि छवियों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन (पास या Nyquist नमूनाकरण पर) के साथ अधिग्रहित किया गया था, तो विश्लेषण से पहले डेटासेट की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए deconvolution के साथ छवि बहाली करने पर विचार करें। सावधान रहें कि कुछ deconvolution उपकरण भी एक denoising कदम शामिल हैं.
      नोट: यह बड़े पैमाने पर Krull et al.32 में संबोधित किया गया है और Huygens deconvolution सॉफ़्टवेयर वेबसाइट (https://svi.nl/HomePage) पर उपलब्ध प्रलेखन में।
  3. उचित विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के लिए 3D डेटासेट समय-श्रृंखला तैयार करना
    नोट: अक्सर भ्रूण या चरण बहाव समय-अंतराल इमेजिंग के दौरान हो सकता है। विश्लेषण करने से पहले इसे ठीक करने की आवश्यकता है। कभी-कभी, बहाव काफी गंभीर होता है कि अधिग्रहण को बाधित करने और समायोजन करने की आवश्यकता होती है। इस मामले में, एक ही एक्स, वाई और जेड आयामों को रखना सबसे अच्छा है।
    1. अलग-अलग 4 डी स्टैक को फिजी के "कॉन्कटेनेट" फ़ंक्शन का उपयोग करके एकल 4 डी हाइपरस्टैक में संयोजित किया जा सकता है। हालाँकि, यह उपकरण समग्र/हाइपरस्टैक्स को हैंडल नहीं करता है, इसलिए ऑपरेशन छवि | का उपयोग करके सभी 4 डी सेगमेंट को सरल स्टैक में कनवर्ट करना आवश्यक है हाइपरस्टैक्स | स्टैक करने के लिए हाइपरस्टैक। इन 4 डी खंडों के क्रम को बनाए रखने के लिए कुछ नंबरिंग सिस्टम रखें और प्रत्येक (चैनल, स्लाइस, समय-बिंदु) के बारे में जानकारी पर ध्यान दें। सभी खंडों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ, और उसके बाद प्रक्रिया छवि | का उपयोग कर उन्हें concatenate स्टैक्स | उपकरण | Concatenate.
    2. कार्रवाई छवि | के साथ concatenated hyperstack reconstruct हाइपरस्टैक्स | हाइपरस्टैक के लिए स्टैक करें और विभिन्न आयामों का सही क्रम चुनें। यह सुनिश्चित करने के लिए हाइपरस्टैक का निरीक्षण करें कि सभी आयाम सही ढंग से अनुक्रमित हैं।
      नोट:: चैनलों की संख्या (c) और स्लाइस (z) सभी 4D खंडों के लिए समान होना चाहिए; (समय) फ्रेम (टी) की संख्या सभी 4 डी खंडों के लिए जोड़े गए समय बिंदुओं के कुल के बराबर होनी चाहिए। हाइपरस्टैक में रूपांतरण करने से पहले, यह समझने के लिए स्टैक के माध्यम से ब्राउज़ करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न आयामों को इंटरपोलेट कैसे किया जाता है। फिजी /ImageJ डिफ़ॉल्ट वैकल्पिक चैनल है, फिर जेड स्लाइस को बारी-बारी से, और फिर बारी-बारी से समय-बिंदु ("XYCZT")। पुष्टि करें कि यह माइक्रोस्कोप द्वारा उत्पन्न डेटा पर लागू होता है।
    3. प्रदर्शन मोड के रूप में समग्र चुनें और टैग की गई छवि फ़ाइल स्वरूप (TIFF) के रूप में सहेजें। बड़े डेटासेट के लिए, ऑपरेशन प्लगइन्स | का प्रदर्शन करके, BigDataViewer33 प्रारूप में कनवर्ट करने पर विचार करें BigDataViewer | वर्तमान छवि को XML/HDF5 के रूप में निर्यात करें. यह एक डेटासेट उत्पन्न करता है जिसे BigDataViewer का उपयोग करके अधिक कुशलता से और 3 D में ब्राउज़ किया जा सकता है और बड़े डेटा डेटासेट के लिए अन्य फिजी / ImageJ टूल द्वारा संभाला जा सकता है।
    4. concatenated hyperstack (3 डी स्टैक की समय श्रृंखला) पंजीकृत करने के लिए भ्रूण / चरण बहाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए या तो "सही 3 डी बहाव" ImageJ प्लगइन34 या BigStitcher प्लगइन35 का उपयोग कर, बहाव सुधार की डिग्री की जरूरत पर निर्भर करता है. XML/HDF5 फ़ाइलों को BigStitcher के साथ खोला जा सकता है।
      नोट: सेल ट्रैकिंग या आंदोलन विश्लेषण करने के किसी भी प्रयास से पहले भ्रूण बहाव दिखाने वाले 3 डी टाइम-लैप्स का पंजीकरण करना आवश्यक है; बहाव के लिए सही भी ठीक से morphogenetic आंदोलनों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक है.
  4. immunofluorescence इमेजिंग के डेटासेट के पूर्व प्रसंस्करण
    1. Z-गहराई संकेत क्षीणन
      नोट: यद्यपि हम सिग्नल क्षीणन को सही करने के लिए जिस विधि का प्रस्ताव करते हैं, वह उपयोगी हो सकती है, इसका उपयोग सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए, क्योंकि अक्सर गहराई में कम सिग्नल वास्तव में एक जैविक को प्रतिबिंबित कर सकता है और ऑप्टिकल घटना नहीं। ऊतक के एक क्षेत्र में क्षय को मापने पर विचार करें जहां ब्याज के अणु को मौजूद या व्यक्त करने की उम्मीद नहीं है और उस क्षेत्र के लिए मुआवजे को समायोजित करें। यदि अभी भी गहराई में कम सकारात्मक संकेत है, तो यह एक वास्तविक जैविक घटना को प्रकट कर सकता है। यह भी विचार करें कि नमूने के कुछ क्षेत्र दूसरों की तुलना में अधिक प्रकीर्णन या लेजर क्षीणन का उत्पादन कर सकते हैं, और यह कि यह इस सरल विधि के साथ पूरी तरह से सही नहीं होगा।
      1. मोटे / देर से चरण के भ्रूण के लिए, बीम क्षीणन, फोटोब्लीचिंग और गोलाकार विपथन अपवर्तक सूचकांकों (बढ़ते माध्यम और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के बीच) के बेमेल के कारण डेटासेट में परिणाम कर सकता है जहां प्रतिदीप्ति तीव्रता जेड-स्टैक के गहरे स्लाइस में बहुत क्षीण हो जाती है। इसलिए, विश्लेषण से पहले सिग्नल के इस नुकसान की भरपाई करें। विश्लेषणात्मक रूप से सबसे सटीक क्षीणन का निर्धारण जटिल और अत्यधिक नमूना निर्भर36 है, लेकिन एक त्वरित सन्निकटन को प्रक्रिया का उपयोग करके इमेजजे / फिजी में अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है | गणित | मैक्रो फ़ंक्शन और पूर्वावलोकन पर क्लिक करें.
      2. फिजी/ImageJ में Z-स्टैक लोड करें, और उसके बाद प्रक्रिया छवि | स्टैक्स | पुन: स्लाइस करें। पर शुरू करें: शीर्ष, रखें इंटरपोलेशन टिक और ठीक से बचें। अब "Z" "Y" अक्ष होगा। अगला, छवि | लुकअप टेबल (LUT) | आग (या किसी भी अन्य बहु-रंगीन एलयूटी)। यह अगले चरणों के दौरान नेत्रहीन रूप से सबसे अच्छे मुआवजे का आकलन करने में मदद करेगा। भ्रूण के बीच में एक स्लाइस पर स्विच करें, जहां गहराई में क्षीणन के प्रभाव स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं (तीव्रता ऊपर [सतही] से नीचे [गहरी] तक गिरती है)।
      3. प्रक्रिया प्रक्रिया | के साथ ऊर्ध्वाधर ("y") तीव्रता ड्रॉप के सुधार का निर्धारण करने के लिए आगे बढ़ें गणित | मैक्रो, और निम्न "कोड" ठीक के रूप में यहाँ लिखा के रूप में जोड़ें:
        v = v * A * exp ( B * y/h)
        इस अभिव्यक्ति में, "v" पिक्सेल तीव्रता के लिए चर है (जिसे गहराई पर एक फ़ंक्शन के रूप में समायोजित किया जाएगा), "y" गहराई के लिए चर, और पूर्ण गहराई के लिए "एच", और "एक्सपी" एक घातीय फ़ंक्शन है; "ए" को 0.5 और 1.0 के बीच की संख्या के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए (जेड-स्टैक की शीर्ष परतों के अतिसंतृप्ति से बचने के लिए कम मान चुनें); बी को 0.5 और 2.0 के बीच की संख्या के साथ बदल दिया गया, यह इस बात पर निर्भर करता है कि जेड-गहराई क्षीणन कितना गंभीर है - आदर्श रूप से यह 1 होना चाहिए, हालांकि कुछ मामलों में नीचे की परतों को सही ढंग से क्षतिपूर्ति करने के लिए कम (या अधिक) आवश्यक है; बी का एक उच्च मूल्य अधिक क्षीणन मुआवजे में परिणाम होगा। पहला आकलन करने के लिए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें। छवि के ऊपर से नीचे तक पर्याप्त मुआवजा प्राप्त करने तक ए और बी के विभिन्न मूल्यों का परीक्षण करें ("फायर" एलयूटी इस मूल्यांकन के लिए सहायक हो सकता है)। संतुष्ट होने पर, ठीक पर क्लिक करके सेटिंग्स लागू करें।
        नोट: यह प्रत्येक चैनल में व्यक्तिगत रूप से किया जाना चाहिए, क्योंकि लाल-स्थानांतरित रंजक और लेजर कम क्षीण हो सकते हैं, और कुछ रंजक दूसरों की तुलना में तेजी से ब्लीच करते हैं। ध्यान रखें कि यह प्रक्रिया गहराई में प्रतिदीप्ति तीव्रता भिन्नताओं के विश्वसनीय परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त सटीक नहीं हो सकती है, हालांकि यह निश्चित रूप से मूल 3 डी डेटासेट में सीधे परिमाणीकरण करने की तुलना में अधिक विश्वसनीय है जो गहराई में सिग्नल के क्षीणन से गंभीर रूप से प्रभावित है। इस प्रभाव के लिए पहचानने और नियंत्रित करने का एक तरीका, पृष्ठीय या वेंट्रल पक्षों से इमेजिंग विभिन्न भ्रूणों की तुलना करना है।
      4. छवि | करके क्षतिपूर्ति Z-स्टैक की मूल ज्यामिति पुनर्स्थापित करें स्टैक्स | Reslice, शीर्ष पर शुरू करें, इंटरपोलेशन से बचें टिक रखें, और अब "वाई" को फिर से "जेड" विमान बनना चाहिए; "छवि | प्रदर्शन करके रंग को बदलें लुकअप तालिकाएँ | Grays" (या पसंद के अन्य LUT)। मूल गैर-क्षतिपूर्ति z-स्टैक को छोड़ दें और क्षतिपूर्ति किए गए संस्करण को सहेजें।
        नोट:: Z-गहराई संकेत क्षीणन विधि के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में पूरक चित्र2 देखें।
    2. Z-अक्ष स्केलिंग सुधार
      1. यदि भ्रूण को माउंट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अपवर्तक सूचकांक के लिए डिज़ाइन किए गए उद्देश्य के साथ इमेजिंग, तो स्लाइस मोटाई को फिर से स्केलिंग करना आवश्यक है, अन्यथा गहराई में माप गलत होगा (संभावित रूप से 50% तक यदि ऊतक-साफ़ भ्रूण पर "शुष्क" उद्देश्य का उपयोग किया जाता है)। यह समझाया गया है, समीक्षा की गई है और 37 और 38 में विभिन्न तरीकों पर चर्चा की गई है। विश्लेषणात्मक रूप से वास्तविक जेड-अक्ष विरूपण पैमाने का निर्धारण करना जटिल है, लेकिन नमूने के अपवर्तक सूचकांक और उद्देश्य के अपवर्तक सूचकांक के बीच के अनुपात को खोजने के द्वारा एक स्वीकार्य सन्निकटन आसानी से निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, मिथाइल सैलिसिलेट-क्लियर किए गए भ्रूण के लिए 1.53/1.0 एक सूखे 20 x उद्देश्य के साथ चित्रित किया गया है, या बीएबीबी के साथ साफ किए गए भ्रूण के लिए 1.56/1.33 और पानी के विसर्जन उद्देश्य के साथ चित्रित किया गया है)।
      2. Z-स्टैक डेटासेट के साथ पहले से ही फिजी / ImageJ में खोला गया है (मल्टीचैनल छवियों के लिए, जब वे सभी चैनलों के साथ "समग्र" के रूप में इकट्ठे हुए थे), तो छवि | पर जाएं गुण और Voxel गहराई को छवि अधिग्रहण के दौरान प्राप्त स्लाइस मोटाई में परिवर्तित करें, जो पिछले चरण (4.2.1) में निर्धारित जेड-अक्ष स्केलिंग सुधार से गुणा किया जाता है; "छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण" अनुभाग)। छवि | का उपयोग करके परिणाम की पुष्टि करें स्टैक्स | ऑर्थोगोनल दृश्य।
    3. फिजी/इमेजजे का उपयोग करके एक शारीरिक रूप से मानक स्थिति में भ्रूण की पुनर्स्थापना
      नोट: भ्रूण repositioning (में हाइलाइट किए गए लाभ देखें) पूरक चित्र3) में एक मानकीकृत पूर्वकाल-पश्चवर्ती [ए-पी] और पृष्ठीय-वेंट्रल [डी-वी] धुरी की स्थिति फिजी / इमेजजे का उपयोग करके, ट्रांसफॉर्मजे की स्थापना की आवश्यकता होती है 39 फिजी के "ImageScience" अद्यतन वेबसाइट से plugins के सुइट.
      नोट: यह तकनीक तीन विमानों में रोटेशन के दौर के लिए बेहतर है जो एलियासिंग कलाकृतियों और संकल्प के क्षरण का परिचय देगी। हालांकि, क्योंकि फिजी/ImageJ 3D व्यूअर प्लगइन 200-300 Mb से बड़े डेटासेट को ठीक से संभाल नहीं सकता है (प्लगइन देखने के कोण को घुमाने का प्रयास करते समय अप्रत्याशित व्यवहार को रेंडर या दिखा नहीं सकता है), मूल 3 डी डेटासेट को पहले डाउन-सैंपल किया जाना चाहिए।
      1. फिजी की छवि | में डेटासेट आकार को कम करके शुरू करें स्केल करें और फिर डेटासेट को 200 Mb से कम करने के लिए आवश्यक X, Y और Z "स्केल" मान डालें (उदाहरण के लिए 0.5 x 0.5 x 0.5 डाउन-सैंपलिंग के परिणामस्वरूप डेटासेट 8 गुना छोटा होगा)। सुनिश्चित करें कि नई विंडो बनाएँ विकल्प टिक किया गया है।
      2. फिर प्लगइन्स | 3 डी दर्शक पर जाएं। 3 डी व्यूअर विंडो के अंदर, इसे चुनने के लिए भ्रूण पर क्लिक करें, और एक लाल 3 डी बॉक्स दिखाई देना चाहिए। इस मोड का उपयोग करते समय (लाल बॉक्स सक्रिय के साथ), डेटासेट के रोटेशन को माउस के साथ नियंत्रित किया जा सकता है, डिफ़ॉल्ट व्यवहार के विपरीत, जो देखने के कोण को घुमाना है। माउस के साथ भ्रूण repositioning करते समय, बाहर कभी क्लिक करें या डेटासेट अचयनित किया जाएगा।
      3. भ्रूण की नई स्थिति से संतुष्ट होने पर, संपादित करें | रूपांतरण | "3D व्यूअर" विंडो के मेनू में रूपांतरित छवि निर्यात करें. विभिन्न ओर्थोगोनल विमानों का निरीक्षण करने के लिए छवि | पर जाएं स्टैक्स | ऑर्थोगोनल दृश्य। यदि भ्रूण सही ढंग से स्थित नहीं है, तो विंडो को बंद करें और 3 डी व्यूअर विंडो पर वापस जाएं और फिर से समायोजित करें। चरण 4.3.2 को दोहराएँ।
      4. जब भ्रूण सही ढंग से स्थित है, तो "3 डी व्यूअर" विंडो मेनू से चुनें संपादित करें | रूपांतरण | ट्रांस्फ़ॉर्म सहेजें और रूपांतरण मैट्रिक्स को *.mat एक्सटेंशन के साथ किसी पाठ फ़ाइल में सहेजें. फिजी/ImageJ का उपयोग करके इस पाठ फ़ाइल को खोलें, पहली दो पंक्तियों (पाठ) को निकालें और फिर से सहेजें। यह 39 में वर्णित "TransformJ" प्लगइन के साथ संगत एक परिवर्तन मैट्रिक्स फ़ाइल बनाता है।
      5. पूर्ण-रिज़ॉल्यूशन डेटासेट पर स्विच करें (एक बहु-चैनल समग्र हाइपरस्टैक हो सकता है) और ऑपरेशन प्लगइन्स | ट्रांस्फ़ॉर्मजे | TransformJ affine. नई विंडो में, पहले सहेजी गई मैट्रिक्स फ़ाइल की खोज करने के लिए ब्राउज़ करें, क्यूबिक B-Spline इंटरपोलेशन | पुन: नमूना isotropically | ठीक है।
        नोट:: यह कार्रवाई स्मृति और CPU गहन है। कार्यस्थान और डेटासेट आकार के आधार पर, कार्रवाई मिनट से घंटे तक ले जा सकती है। Resample isotropically विकल्प का उपयोग गारंटी देता है कि परिवर्तन ऑपरेशन के दौरान कोई संकल्प खो गया है, इसलिए डेटासेट आकार में काफी वृद्धि होगी और अब मूल confocal z-स्टैक की तरह अनिसोट्रोपिक नहीं होगा; यह उम्मीद की जानी चाहिए कि जेड-अक्ष में स्लाइस की संख्या प्रत्येक स्लाइस के एक्स और वाई पिक्सेल की समान संख्या तक बढ़ जाती है, और स्टैक मूल आकार में 5-10x तक फूला हुआ होता है। यह गारंटी देने के लिए आवश्यक है कि रोटेशन और अनुवाद के दौरान वोक्सेल के इंटरपोलेशन के दौरान कोई जानकारी खो नहीं जाती है।
      6. एक बार जब भ्रूण को ठीक से पुनर्स्थापित किया जाता है, तो भ्रूण के चारों ओर बनाई गई अधिकांश खाली जगह को ट्रिम करना अक्सर संभव होता है। एक पूर्ण Z-प्रक्षेपण छवि | निष्पादित करें स्टैक्स | Z परियोजना... और अधिकतम तीव्रता चुनें; X और Y में पूरे भ्रूण वाले न्यूनतम ROI को आरेखित करें. मूल डेटासेट छवि विंडो पर स्विच करें, संपादन | पर जाएँ चयन | चयन पुनर्स्थापित करें, और छवि | फसल का चयन करके फसल।
      7. शुरुआत और अंत में स्लाइस को ट्रिम करें जो भ्रूण के ऊतकों को प्रतिच्छेद नहीं करते हैं। इसके लिए, छवि | का चयन करें स्टैक्स | उपकरण | रिमूवर स्लाइस करें और हटाने के लिए पहला और अंतिम स्लाइस निर्दिष्ट करें, "वेतन वृद्धि" को 1 में बदलना सुनिश्चित करें (अन्यथा यह केवल हर दूसरे स्लाइस को हटा देता है)।
      8. नए डेटासेट को पुनर्स्थापित करने और ट्रिम करने के बाद एक नई TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजना सुनिश्चित करें। यदि यह डेटासेट बहुत बड़ा है (GPU RAM से अधिक) XML/DHF5 के रूप में निर्यात करने के लिए BigDataViewer का उपयोग करने पर विचार करें, जैसा कि चरण 3.3 ("छवि डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण" अनुभाग से) में समझाया गया है।
  5. OPT डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण
    1. MARTINs et al.19 और Gualda et al.28 में वर्णित OPT डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करें।

4.3D प्रतिपादन, दृश्य और विश्लेषण

नोट: यहां हम विभिन्न सॉफ़्टवेयर टूल के संभावित अनुप्रयोगों की एक सूची प्रदान करते हैं, जो 3 डी इमेजिंग डेटासेट के विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण की अनुमति या वृद्धि करते हैं।

  1. 3 डी रेंडरिंग और दृश्य दृष्टि का उपयोग कर
    नोट: दृष्टि40 एक मुफ्त वैज्ञानिक विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर है जिसे माइक्रो-सीटी, कॉन्फोकल / मल्टीफोटॉन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी से 3 डी और 4 डी डेटासेट का पता लगाने और प्रस्तुत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यहां हम इस सॉफ़्टवेयर का उपयोग 3 डी रेंडरिंग और पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए करते हैं (चरण 2; "3 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग)। उपयोगकर्ताओं को यह समझने में मदद करने के लिए ऑनलाइन कई ट्यूटोरियल हैं कि दृष्टि को कैसे संचालित किया जाए; "अजय Limaye दृष्टि 3 डी ट्यूटोरियल" के लिए ऑनलाइन खोज. दृष्टि सीधे TIFF फ़ाइलों के स्टैक नहीं पढ़ सकती है, इसलिए उन्हें पहले मूल "pvl.nc" प्रारूप में कनवर्ट किया जाना चाहिए।
    1. दृष्टि स्थापना फ़ोल्डर में स्थित "drishtiimport.exe" उपकरण चलाएँ: फ़ाइलें | लोड | फ़ाइलें | "Grayscale TIFF छवि फ़ाइलें चुनें, और फिजी / ImageJ से सहेजे गए के रूप में एक एकल चैनल 3 डी स्टैक लोड करें। एक बहु-चैनल समग्र स्टैक के मामले में, फिजी / इमेजजे में चैनलों को विभाजित करें और प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से सहेजें। Voxel प्रकार "ushort" है; "फ़ाइल"..." के रूप में सहेजें "..." TIF", सभी प्रश्नों के लिए "y" का उत्तर दें। voxel आकार के लिए पूछ अतिरिक्त जानकारी विंडो में सही "X Y Z" voxel आकार जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. दृश्य में *.pvl.nc फ़ाइलें लोड हो रही हैं और प्रतिपादन: दृष्टि की मुख्य विंडो में फाइल | लोड | उपलब्ध चैनलों की संख्या के आधार पर 1 ( - 4 ) वॉल्यूम लोड करें (अलग-अलग फ़ाइलों के रूप में)। लोड होने के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले रेंडर के लिए F2 दबाएँ. इस क्रिया के लिए एक शक्तिशाली GPU कार्ड की आवश्यकता होती है. प्रतिपादन पैरामीटर, स्थानांतरण समारोह संपादक, ऑनलाइन ट्यूटोरियल पर खोज को संभालने के लिए जानकारी. एक बार रेंडरिंग गुणों से संतुष्ट होने के बाद एक एनिमेटेड रेंडरिंग उत्पन्न करने के लिए आगे बढ़ें।
    3. देखें पर जाएँ और Keyframe संपादक को सक्रिय करें। भ्रूण को संभालें और इसे वांछित प्रारंभिक स्थिति में रखें। यदि आवश्यक हो तो भ्रूण को केंद्र में "खींचने" के लिए दाएँ-माउस बटन का उपयोग करें, या ज़ूम करने के लिए माउस स्क्रॉल करें। Keyframe संपादक में सेट कीफ्रेम मारो, फिर एक और स्थिति, कोण या ज़ूम चुनें, समय-रेखा मार्कर को एक अलग समय बिंदु पर खींचें और कीफ्रेम फिर से सेट करें। अब 2 कीफ्रेम हैं जहां भ्रूण को 2 अलग-अलग पदों / कोणों / ज़ूम में दर्शाया गया है, और बीच में कई फ्रेम हैं। प्ले बटन दबाते हुए, दृष्टि लापता स्थितियों को इंटरपोल कर सकती है और इसे एनीमेशन के रूप में खेल सकती है। फ़ाइल | पर जाएँ सभी फ़्रेमों के एनिमेटेड अनुक्रम को सहेजने के लिए छवि अनुक्रम सहेजें. इस फ्रेम अनुक्रम को बाद में फिजी / इमेजजे में खोला जा सकता है और एवीआई के रूप में सहेजा जा सकता है (फ़ाइल | | आयात करें छवि अनुक्रम ... फ़ाइल | | के रूप में सहेजें एक उचित फ्रेम दर के साथ जेपीईजी संपीड़न (हम 15 - 30 का सुझाव देते हैं)।
      नोट: यद्यपि दृष्टि * .wmv वीडियो की बचत की अनुमति देता है, इसके बजाय अलग-अलग फ्रेम के रूप में सहेजने और केवल बाद में श्रृंखला को AVI या MOV वीडियो प्रारूप में परिवर्तित करने की सलाह दी जाती है (यह फिजी / ImageJ का उपयोग करके किया जा सकता है)।
  2. अमीरा का उपयोग करके ऊतकों के 3 डी पुनर्गठन और मैनुअल विभाजन
    नोट: यह वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर 3 डी डेटासेट में भ्रूण ऊतकों के मैनुअल या स्वचालित रूप से / अर्ध-स्वचालित रूप से, 3 डी विभाजन की अनुमति देता है। वहाँ कई ट्यूटोरियल उपलब्ध 41 के साथ इस सॉफ्टवेयर के लिए एक ऑनलाइन "लर्निंग सेंटर" है. नीचे इम्यूनोफ्लोरेसेंस-दाग वाले भ्रूण (चरण 1.2) से भ्रूण ऊतकों को मैन्युअल रूप से विभाजित करने के लिए आवश्यक बुनियादी चरणों का वर्णन किया गया है। भ्रूण को एक मानक ए-पी / डी-वी अक्ष में सही ढंग से तैनात करने के बाद मैन्युअल विभाजन बहुत आसान है ("छवि डेटासेट प्रीप्रोसेसिंग" अनुभाग, चरण 4.3 देखें)।
    1. एक 3D TIFF डेटासेट लोड करें। सही voxel आयाम निर्दिष्ट करने के लिए सुनिश्चित करें, जब पूछा. एक विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल बनाएं और कनेक्ट करें (उदाहरण के लिए, "ऑर्थोस्लाइस" या "वोरेन") और 3 डी में डेटासेट का निरीक्षण करें।
    2. लेबल फ़ील्ड कनेक्ट करें (या अमीरा के नए संस्करणों में नया लेबल फ़ील्ड संपादित करें). इस सॉफ़्टवेयर में, मैन्युअल विभाजन के परिणाम "सामग्री" में संग्रहीत किए जाते हैं, इसलिए ब्याज के प्रत्येक ऊतक के लिए एक सामग्री बनाएं। मैन्युअल विभाजन के लिए "लासो" उपकरण का उपयोग करें। वहाँ कई ट्यूटोरियल उपलब्ध हैं कि यह कैसे प्रदर्शन करने के लिए समझा ("अमीरा विभाजन संपादक ट्यूटोरियल" के लिए ऑनलाइन खोज).
    3. जब ब्याज के सभी ऊतकों के विभाजन के साथ समाप्त हो जाता है, तो प्रोजेक्ट मोड पर वापस स्विच करके विभाजन संपादक से बाहर निकलें। डेटासेट का एक नया संस्करण बनाने के बाद ("लेबल फ़ील्ड", जो अब मूल डेटासेट मॉड्यूल से जुड़ा हुआ है) जिसमें प्रत्येक सामग्री से संबंधित पिक्सेल का समान मूल्य होता है।
    4. "लेबल" डेटासेट से 3 डी सतह मॉडल उत्पन्न करके इन "सामग्रियों" को 3 डी ऑब्जेक्ट्स में कनवर्ट करें। यह एक "जनरेट सतह" मॉड्यूल संलग्न करके किया जा सकता है, आवश्यक के रूप में पैरामीटर को समायोजित करता है ("कॉम्पैक्टिफाई", "बॉर्डर", "समायोजित coords" और "अप्रतिबंधित चिकनाई" विकल्पों को सक्रिय करता है)। लागू करें क्लिक करें और एक नया मॉड्यूल *.surf जनरेट किया गया है।
    5. सतह वस्तुओं visualizing, निकालने और * obj फ़ाइलों के रूप में व्यक्तिगत रूप से निर्यात. कोई प्रदर्शन | अनुलग्न करें * .surf मॉड्यूल के लिए SurfaceView मॉड्यूल, और मुख्य दर्शक में निरीक्षण। "SurfaceView" मॉड्यूल के "गुण" पैनल में, "सामग्री" गुण में सभी + सभी का चयन करें और निकालें पर क्लिक करें, ताकि दर्शक का बफ़र खाली हो जाए। फिर सामग्री संपत्ति के दूसरे पुल में केवल एक सामग्री का चयन करें और बफर में जोड़ें पर क्लिक करें; केवल वह सामग्री दिखाई देनी चाहिए।
    6. गुण में आरेखित करें शैली में सतह बनाने के | अधिक विकल्पों में क्लिक करें और एक नया *.surf मॉड्यूल बनाया गया है और परियोजना में जोड़ा गया है। ऊतक के नाम पर इसका नाम बदलें (कुंजीपटल पर F2 दबाएँ), और फ़ाइल | डेटा इस रूप में निर्यात करें... और प्रकार के रूप में सहेजें: Wavefront (*.obj). प्रत्येक सामग्री के लिए ऑपरेशन को दोहराएं।
      नोट: इन *.obj फ़ाइलें, प्रत्येक अमीरा में विभाजित ऊतकों में से एक युक्त, अन्य उपकरणों ("3Dviewer" फिजी / ImageJ और SimLab से प्लगइन) द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. एक पोर्टेबल दस्तावेज़ प्रारूप (पीडीएफ) SimLab कंपोज़र का उपयोग कर में के भीतर इंटरैक्टिव 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन
    नोट:: इस 3 डी कंप्यूटर ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर सतह रेंडर छवियों, एनिमेशन और सिमुलेशन के निर्माण की सुविधा प्रदान करता है। उपयोगी ट्यूटोरियल लाइन 42 पर पाया जा सकता है। यहां हम वर्णन करते हैं कि यह सॉफ़्टवेयर 3 डी पीडीएफ इंटरैक्टिव चित्रों के निर्माण को कैसे सक्षम बनाता है, वेवफ्रंट (*.obj) 3 डी सतह फ़ाइलों का उपयोग करके अमीरा (चरण 2.3) के साथ बनाई गई; "3 डी रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण" अनुभाग)।
    1. फ़ाइल | पर जाएँ नया और एक खाली दृश्य बनाएँ. उसके बाद फ़ाइल आयात | और अमीरा से सहेजी गई 1 *.obj फ़ाइल आयात करें। आयात फ़ाइल विंडो के सभी विकल्पों को अनसिक्ड रखें और ठीक क्लिक करें.
    2. यदि कंपोज़र की प्रदर्शन विंडो में कुछ भी दिखाई नहीं देता है, तो Ctrl+F या सभी को फ़िट करने के लिए चिह्न क्लिक करें. अब खंडित वस्तु विंडो के केंद्र में दिखाई देनी चाहिए। किसी अन्य खंडित ऑब्जेक्ट को जोड़ने के लिए प्रक्रिया को दोहराएं और पहले वाले के सापेक्ष इसकी स्थिति की पुष्टि करें (उदाहरण के लिए, 2 आसन्न सोमाइट्स)।
    3. बाएं माउस बटन के साथ क्लिक करके डिस्प्ले विंडो में वस्तुओं में से एक का चयन करें, शारीरिक संरचना या ऊतक के नाम को प्रतिबिंबित करने के लिए इसका नाम बदलें, फिर "3DGeom ~ 1" प्रतिनिधित्व पर स्विच करें, और सामग्री पैनल का उपयोग करके, आर, जी, बी मानों को बदलकर रंग बदलें।
    4. सभी ऑब्जेक्ट्स के लिए दोहराएँ, जब तक कि 3D चित्रण पूरी तरह से इकट्ठा नहीं हो जाता है। ध्यान दें कि कुछ सामग्रियों को "अल्फा" चैनल में हेरफेर करके पारदर्शी भी बनाया जा सकता है, आरजीबी मूल्यों के बगल में, और इस तरह आंतरिक या occluded वस्तुओं के अवलोकन की अनुमति देता है।
    5. इस सॉफ्टवेयर के साथ इकट्ठे भ्रूण चित्रण को "3 डी पीडीएफ" फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है, जिसे प्रकाशनों में शामिल किया जा सकता है। पहले एक ही चित्रण में निर्देशों और तीन अलग-अलग चरणों को शामिल करने में सक्षम होने के लिए "दृश्य राज्यों" को बदलने के लिए पाठ और सक्रिय लिंक के साथ एक "टेम्पलेट" बनाएँ। यह "दृश्य निर्माण" से "शेयरिंग" मोड (कंपोज़र विंडो के बाईं ओर बटन) पर स्विच करके किया जा सकता है, फिर पीडीएफ सेटिंग्स दिखाएं में क्लिक करके, और एक नया पृष्ठ टेम्पलेट बनाकर किया जा सकता है। एक पांडुलिपि में शामिल करने के लिए एक सरल इंटरैक्टिव आंकड़ा बनाने के लिए, एक टेम्पलेट का उपयोग न करें और बस पीडीएफ निर्यात करें।
      नोट: 3 डी पीडीएफ के साथ बातचीत करने के लिए एडोब एक्रोबैट रीडर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (इंटरैक्टिव 3 डी पीडीएफ चित्रण में कार्यों की operability उपलब्ध Acrobat रीडर के संस्करणों के आधार पर भिन्न हो सकती है)। अधिकांश अन्य दर्शक वेब ब्राउज़र सहित 3 डी पीडीएफ प्रारूप के साथ संगत नहीं हैं। इस तरह के 3 डी पीडीएफ इंटरैक्टिव चित्रों को प्रकाशनों में शामिल किया जा सकता है; पहले से ही इस संभावना के बारे में संपादकों से पूछें।
  4. 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और Imaris का उपयोग कर विश्लेषण
    नोट: यह सॉफ़्टवेयर व्यापक इमेजिंग विज़ुअलाइज़ेशन, विश्लेषण और सहज ज्ञान युक्त इंटरफ़ेस और वर्कफ़्लो के साथ 2D-4D माइक्रोस्कोपी डेटासेट की व्याख्या की अनुमति देता है। इस सॉफ़्टवेयर के साथ शुरू करने के तरीके पर ऑनलाइन कई उपयोगी ट्यूटोरियल हैं, जो वेबसाइट पर उपलब्ध हैं (https://imaris.oxinst.com/tutorials)। Imaris में बड़े डेटासेट के साथ अधिक प्रभावी ढंग से लोड और बातचीत करने के लिए (आमतौर पर, GPU मेमोरी से बड़े) यह सलाह दी जाती है कि डेटासेट को पहले "*.ims" में परिवर्तित किया जाए, "ImarisFileConverter.exe" प्रोग्राम का उपयोग करके Imaris स्थापना फ़ोल्डर में स्थापित किया गया है। ImarisFileConverter कई माइक्रोस्कोपी छवि स्वरूपों को पढ़ सकते हैं, जिसमें ओएमई और "एच 5" फ़ाइलें शामिल हैं जैसा कि फिजी के BigDataViewer द्वारा सहेजा गया है।
    1. 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन
      1. यह सॉफ़्टवेयर "3 डी व्यू" मोड का उपयोग करके डेटासेट का 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन रेंडर कर सकता है और उपयोगकर्ता डेटासेट को प्रदर्शित करने के तरीके के लिए कई समायोजन करने में सक्षम है [उदाहरण के लिए, एमआईपी (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) या मिश्रण मोड (गहराई संकेतों और छाया के साथ बेहतर प्रतिपादन) के बीच चुनें]।
      2. ओर्थोगोनल विचार "मोड - उचित भ्रूण स्थिति के साथ (चरण 4.3; "छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण" अनुभाग) एक "अनुभाग" टैब का उपयोग कर सकते हैं और पूरे भ्रूण के माध्यम से नेविगेट कर सकते हैं और सामान्य विमानों (अनुप्रस्थ, कोरोनल और सैगिटल) से ऑप्टिकल वर्गों को देख सकते हैं। यदि भ्रूण को ठीक से पुनर्स्थापित नहीं किया जाता है, तो ऑर्थोगोनल विमानों के साथ उनकी शारीरिक रचना की व्याख्या करना बेहद मुश्किल है ( पूरक चित्र3 देखें)। हालांकि 3 डी भ्रूण का विश्लेषण करते समय इस समस्या के आसपास काम करने के लिए Imaris के पास "संदर्भ फ्रेम" के रूप में जाना जाने वाला एक फ़ंक्शन है, लेकिन डेटासेट को एक प्राथमिकता को फिर से स्थापित करना बेहतर है।
    2. 3D विश्लेषण
      नोट: इस सॉफ्टवेयर में आकृति विज्ञान और प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए कई उपकरण भी हैं। एक उदाहरण के रूप में, यहां हम Imaris "स्पॉट" उपकरण का उपयोग करके समय के साथ ऊतक प्रतिदीप्ति तीव्रता विविधताओं का विश्लेषण करने के लिए एक सरल वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं, जहां उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से 3 डी में भ्रूण में ब्याज के गोलाकार क्षेत्रों (आरओआई) को रखता है, और इमारिस तब इन गोलाकार आरओआई के अंदर ऊतक प्रतिदीप्ति को माप सकता है।
      1. Imaris में एक 3D या 4D डेटासेट लोड करें और 3D दृश्य मोड में नया स्थान जोड़ें. फिर, कोई भी भ्रूण के विशिष्ट बिंदुओं का चयन कर सकता है (कई समय बिंदुओं के दौरान भी यदि कोई 4 डी डेटासेट का उपयोग करता है) और उन धब्बों के अंदर मात्रा निर्धारित करता है, उदाहरण के लिए, तीव्रता का मतलब है।
        नोट: यह सॉफ़्टवेयर भी समय के साथ तीव्रता प्लॉटिंग की अनुमति देता है। यह उपयोगकर्ता को आसानी से सवालों के जवाब देने की अनुमति देता है जैसे: "समय के साथ एक सोमाइट के अंदर प्रतिदीप्ति कैसे बदलती है?
      2. नया स्पॉट जोड़ें बटन पर क्लिक करके या 3 डी दृश्य का चयन करके स्पॉट मॉड्यूल जोड़ें | Imaris मेनू में धब्बे. स्वत: प्रतिक्रिया छोड़ें, मैन्युअल रूप से संपादित करें चुनें. नेविगेट करने के लिए का चयन करने के लिए Imaris सूचक मोड स्विच करें (यह भी कुंजीपटल पर ESC कुंजी को मारकर किया जा सकता है).
      3. स्पॉट गुण विंडो पर, उस विशिष्ट चैनल का चयन करें जिसमें स्पॉट संलग्न किया जाएगा (उदाहरण के लिए, "चैनल 1"), और चयनित स्थान पर ऑटो-कनेक्ट करने के लिए मैन्युअल ट्रैकिंग में सक्रिय करें और ऑटो-एडवांसिंग विकल्पों से पहले देरी सक्षम करें।
      4. माउस कर्सर को विज़ुअलाइज़ेशन विंडो पर ले जाएँ और कर्सर को एक खोखले पीले तार क्षेत्र में बदलना चाहिए। समय-बिंदु 1 पर जाएं और ब्याज के ऊतक में क्लिक करके एक स्थान (= क्षेत्र) जोड़ें। क्षेत्र ("स्पॉट") केवल तभी जोड़ा जाता है जब शिफ्ट कुंजी को पकड़ते समय क्लिक किया जाता है। सभी वांछित समय बिंदुओं के लिए दोहराएं जो समय के साथ ऊतक के एक ही हिस्से को ट्रैक करना सुनिश्चित करते हैं।
      5. स्पॉट गुण विंडो में, आँकड़े टैब पर जाएँ, और आँकड़े स्विच के अंदर समग्र से विस्तृत आँकड़े करने के लिए। पहले pulldown से विशिष्ट मूल्यों का चयन करें, और दूसरे pulldown से चुनें "तीव्रता का मतलब Ch = *...", जहां Ch * चैनल है जिसमें माप किया जाएगा। "समय-प्लॉट पैनल खोलने के लिए क्लिक करें" के दाईं ओर एक बटन स्पॉट गुण विंडो के नीचे बाईं ओर पाया जाएगा। इस बटन पर क्लिक करने से "स्पॉट" के अंदर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ एक प्लॉट खुलता है, जो समय के साथ प्लॉट किया गया है। इन मानों को आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट में भी निर्यात किया जा सकता है।

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Representative Results

लाइव और इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग दोनों के लिए इस पेपर में दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम, दो-फोटॉन सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, जिसमें 20 × 1.0 एनए पानी के उद्देश्य, उत्तेजना लेजर को 960 एनएम तक ट्यून किया गया था, और GaAsP फोटोडिटेक्टर्स (जैसा कि डायस एट अल में वर्णित है( 2020)43)। ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी एक कस्टम निर्मित OPenT स्कैनर का उपयोग करके किया गया था (जैसा कि Gualda et al. (2013) 28 में वर्णित है।

लाइव इमेजिंग (4 डी विश्लेषण)
अक्षीय विस्तार के दौरान माउस भ्रूण में LuVeLu रिपोर्टर गतिविधि का एक प्रतिनिधि विश्लेषण, "लाइव इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" (चरण 1.1) के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किया गया; "3 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग), "लाइव इमेजिंग डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण" (चरण 3; "छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण" अनुभाग) और "3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण Imaris का उपयोग कर" (चरण 4.4; "3 डी रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण") को चित्र 1 और वीडियो 1 में देखा जा सकता है।

3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण
संभावित एनएमपी और मेसोडर्म भेदभाव के प्रमुख नियामकों का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस एसेस के उपयोग के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम, "इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी" ("3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग, चरण 1.2), "डिकंवोल्यूशन" और "इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग डेटासेट प्री-प्रोसेसिंग" ("छवि डेटासेट प्रीप्रोसेसिंग" अनुभाग, चरण 3.2 और 3.4 क्रमशः), और "3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण का उपयोग करके Imaris" ("3D रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण", चरण 4.4) चित्र 2 में देखा जा सकता है।

3 डी immunofluorescence धुंधला का रेंडराइजेशन
वीडियो 2 एक immunofluorescence परख के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है संभावित NMPs के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त करने के लिए "immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी" (चरण 1.2; "3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग), "डिकंवोल्यूशन" और "इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण" (क्रमशः चरण 3.2 और 3.4); "छवि डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण" अनुभाग), और "3 डी रेंडरिंग और दृष्टि का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन" (चरण 4.1; "3 डी रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण" अनुभाग)।

3 डी पुनर्निर्माण
वीडियो 3 "immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी" (चरण 1.2) के लिए वर्णित विधियों के बाद उत्पन्न किया गया था; "3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग), "इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण" (चरण 3.4; "छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण" अनुभाग), और "3 डी पुनर्निर्माण और अमीरा का उपयोग करके ऊतकों का मैनुअल विभाजन" (चरण 4.2; "3 डी रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण")। यह एक 3 डी पुनर्निर्माण से पता चलता है, immunofluorescence धुंधला, एक E9.5 जंगली प्रकार (WT) माउस भ्रूण के पुच्छल ऊतकों के आधार पर.

इंटरैक्टिव 3 डी चित्र
चित्रा 3 में हम एक पोर्टेबल दस्तावेज़ प्रारूप (3 डी पीडीएफ) में माउस भ्रूण के पुच्छल ऊतकों के पुनर्निर्माण का एक इंटरैक्टिव 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन प्रस्तुत करते हैं, जिसे "इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी" (चरण 1.2) के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया है; "3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग), "इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण" (चरण 3.4; "छवि डेटासेट preprocessing" अनुभाग), "3 डी पुनर्निर्माण और अमीरा का उपयोग कर ऊतकों के मैनुअल विभाजन", और "इंटरैक्टिव 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन एक पोर्टेबल दस्तावेज़ प्रारूप (पीडीएफ) में SimLab का उपयोग कर" ("3 डी रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण", चरण 4.2 और 4.3 क्रमशः)। इस प्रकार के प्रारूप का उपयोग आसानी से वैज्ञानिक सामग्री को अधिक सामान्य दर्शकों तक पहुंचाने की सुविधा के लिए किया जा सकता है, विशेष रूप से शिक्षण वातावरण में। इंटरैक्टिव विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एडोब एक्रोबैट रीडर के उपयोग की आवश्यकता होती है (3 डी प्लगइन की अनुमति दें)।

OPT डेटासेट विज़ुअलाइज़ेशन
वीडियो 4 एक OPT पुनर्निर्मित डेटासेट का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है, एक E18.5 माउस भ्रूण इमेजिंग के बाद। नमूना के रूप में "ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी के लिए नमूना तैयारी" ("3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था; चरण 1.3) "OPT डेटासेट पूर्व-प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण" (चरण 3.5) और "3 D रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण" (चरण 4) के विभिन्न मॉड्यूल। फिजी / इमेजजे, अमीरा या इमारिस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इस डेटासेट में एक विस्तृत शारीरिक विश्लेषण (उदाहरण के लिए, माप) भी किया जा सकता है। फिल्म में चार वीडियो खंड शामिल हैं: पहला फिजी / इमेजजे के साथ उत्पादित काले और सफेद सैगिटल स्लाइस का एक अनुक्रम दिखाता है; दूसरा, इमारिस के साथ उत्पादित ऑर्थोगोनल दृश्य इंटरैक्टिव 3 डी स्लाइसिंग और ऑर्थोगोनल ऊतक भागों के प्रतिपादन को दिखाते हैं; तीसरा रंग sagittal स्लाइस से भ्रूण "असेंबलिंग" से पता चलता है, जैसा कि अमीरा में तैयार किया गया है; अंतिम वीडियो खंड विभिन्न विचारों से 3 डी में भ्रूण का एक एनीमेशन प्रदर्शित करता है, जो दृष्टि के साथ तैयार किया गया है।

वीडियो 1 -Snai1-cKO में LuVeLu रिपोर्टर अभिव्यक्ति के दो फोटॉन लाइव इमेजिंग और नियंत्रण E8.5 भ्रूण (संदर्भ 43 से अनुकूलित). पहले खंड समय पर रिपोर्टर गतिविधि दिखाते हैं = 0 (5 μm चरण-आकार का z-स्टैक) और दूसरे भागों में पूर्ण लाइव इमेजिंग (10 μm z-stacks हर 8.5 मिनट) शामिल है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2 - टी (Brachyury) और एक E10.5 जंगली प्रकार tailbud के Sox2 के लिए एक पूरे माउंट immunofluorescence धुंधला के 3 डी renderization. टी अभिव्यक्ति को मैजेंटा में दिखाया गया है, सोक्स 2 पीले रंग में और डीएपीआई को ग्रे में दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 3 - एक देर से E9.5 जंगली प्रकार माउस भ्रूण के पुच्छल भाग के 3 डी पुनर्निर्माण, mesoderm सहित विभिन्न पुच्छल ऊतकों के contouring पर ध्यान देने के साथ. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

वीडियो 4 - ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी के साथ इमेज के रूप में E18.5 जंगली प्रकार के भ्रूण, 3 डी डेटासेट को विज़ुअलाइज़ करने और प्रस्तुत करने के लिए टोटो इमेजिंग और कई तकनीकों को उजागर करते हैं। पहला खंड फिजी / इमेजजे में तैयार किए गए सैगिटल स्लाइस का एक अनुक्रम दिखाता है, दूसरा "लाइव" ऑर्थोगोनल दृश्य जैसा कि इमारिस में प्रस्तुत किया गया है, तीसरा अमीरा में तैयार किए गए रंगीन सैगिटल स्लाइस से एक अनुक्रमिक प्रतिपादन, और चौथा दृष्टि में तैयार एक एनिमेटेड रेंडरिंग। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्रा 1: E8.5 Snai1-cKO और नियंत्रण भ्रूण (संदर्भ 43 से अनुकूलित) में LuVeLu रिपोर्टर अभिव्यक्ति का 4 डी विश्लेषण। (ए) समय-बिंदु पर स्नैपशॉट = 0 LuVeLu रिपोर्टर, Snai1-cKO (Meox2-Cre +/0::Snai1flox/-) (Aa) और नियंत्रण (Ab) भ्रूण में। Presomitic mesoderm में सामान्य LuVeLu संकेत के अलावा, Snai1-cKO भ्रूण भी अस्थानिक उभार में LuVeLu अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं जो आदिम लकीर (सफेद तीर) से उत्पन्न होता है। (बी) Snai1-cKO:: LuVeLu + / 0 अस्थायी तीव्रता का मतलब लाल धब्बे (बीए) द्वारा हाइलाइट किए गए क्षेत्र में मात्रात्मक विश्लेषण का मतलब दो-चोटियों के अस्तित्व को इंगित करता है (टी = 1.3 एच और टी = 3.6 घंटे पर समय-अंतराल) और उनके बीच पर्याप्त कमी, इसलिए सशर्त उत्परिवर्ती भ्रूण के उभार में साइकिल चालन गतिविधि का सुझाव देता है। आदिम लकीर (हरे रंग का स्थान) के पास LuVeLu साइकिल चालन गतिविधि के कोई संकेत नहीं देखे गए थे; Bb) LuVeLu + / 0 नियंत्रण भ्रूण में। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: E9.5 Snai1-cKO और WT भ्रूण (संदर्भ 43 से अनुकूलित) में पूरे-माउंट इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री(A) T (हरे) और Sox2 (लाल) के लिए Immunostainings। (बी) Tbx6 (हरा) और Lam1 (लाल) के लिए immunostainings. DAPI नीले रंग में दिखाया गया है। विभिन्न भ्रूणों (एए, एबी, बा, और बीबी) के पुच्छल भाग का 3 डी रेंडरिंग (मिश्रण मोड)। Transversal (Aa1, Ab1, Ba1, Ba2, Bb1 और Bb2) और sagittal (Aa2, Ab2, Ba3 और Bb3) आवर्धन (Mag.) के साथ ऑप्टिकल वर्गों को भी विभिन्न भ्रूणों के लिए दिखाया गया है। आवर्धन DAPI के बिना दिखाए जाते हैं। सफेद तीर उत्परिवर्ती भ्रूण में कुछ एनएमपी (टी और सॉक्स 2 डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं) के स्थान में अंतर को उजागर करते हैं। पीले तीर और एरोहेड्स क्रमशः अस्थानिक / असामान्य Tbx6 और Lam1 अभिव्यक्ति को इंगित करते हैं, Snai1-cKO भ्रूण में। स्केल बार 50 μm के अनुरूप हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 - 3 डी पीडीएफ - 3 डी पीडीएफ प्रारूप में इंटरैक्टिव 3 डी चित्रण अक्षीय विस्तार (E8.5, E9.5 और E10.5) के दौरान वाइल्डटाइप माउस भ्रूण के खंडित पुच्छल ऊतकों के 3 डी पुनर्निर्माण दिखा रहा है। विभाजन को अमीरा में मैन्युअल रूप से किया गया था, और 3 डी पीडीएफ को सिमलैब कंपोजर में इकट्ठा और निर्यात किया गया था। इंटरैक्टिव विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एडोब एक्रोबैट रीडर की आवश्यकता होती है (3 डी प्लगइन की अनुमति दें)। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1 - एक ब्लीच किए गए भ्रूण का प्रतिनिधि परिणाम (चरण 3.2 के बाद; "3 डी और 4 डी इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी" अनुभाग)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2 - जेड-गहराई संकेत क्षीणन का प्रतिनिधि परिणाम (चरण 4.1; "छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण" अनुभाग)। ए - जेड-गहराई संकेत क्षीणन से पहले; बी - अच्छा जेड गहराई संकेत क्षीणन; सी - गलत जेड गहराई संकेत क्षीणन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3 - एक पूरे माउंट immunofluorescence धुंधला दिखा रहा है और E7.5 माउस भ्रूण है कि repositioned किया गया है के प्रतिनिधि परिणाम (ए) के बाद "फिजी / ImageJ का उपयोग कर एक शारीरिक रूप से मानक स्थिति के लिए भ्रूण की repositioning" (चरण 3.4.3; "छवि डेटासेट पूर्व प्रसंस्करण" अनुभाग) बनाम एक ही भ्रूण repositioned (बी) के बिना। विज़ुअलाइज़ेशन Imaris का उपयोग करके प्राप्त किया गया था (चरण 4.1.2 देखें; "3 डी रेंडरिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण" अनुभाग)। पीले रंग में टी, मैजेंटा में सॉक्स 2 और नीले रंग में डीएपीआई। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

अक्षीय बढ़ाव और विभाजन कशेरुक भ्रूण विकास के दौरान होने वाली दो सबसे जटिल और गतिशील प्रक्रियाएं हैं। एकल-सेल ट्रैकिंग के साथ 3 डी और 4 डी इमेजिंग का उपयोग कुछ समय के लिए, ज़ेब्राफ़िश और चिकन भ्रूण दोनों में इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, जिसके लिए पहुंच और संस्कृति की स्थिति जटिल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती है 19,44,45,46,47,48,49 . इसके विपरीत, माउस भ्रूण के मध्य और देर से ऑर्गेनोजेनेसिस चरणों का इस तरह के विस्तार से खराब अध्ययन किया जाता है, हालांकि कुछ प्रगति की गई है, उदाहरण के लिए इंट्रावाइटल इमेजिंग50 में। इस पांडुलिपि में हम कई तरीकों के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिनका उपयोग बहुआयामी छवियों के अधिग्रहण और उनके विश्लेषण के लिए किया जा सकता है ताकि गर्दन, ट्रंक और पूंछ गठन के दौरान एनएमपी और उनके मेसोडर्म डेरिवेटिव के अध्ययन को सुविधाजनक बनाया जा सके। यद्यपि इन प्रोटोकॉल को माउस भ्रूण के लिए डिज़ाइन किया गया था, उन्हें आसानी से स्पष्टीकरण प्रणालियों और इन विट्रो मॉडल जैसे 3 डी भ्रूण स्टेम सेल समुच्चय जैसे गैस्ट्रॉलॉइड्स51,52 के लिए काम करने के लिए ट्यून किया जा सकता है। दरअसल, यदि मानव gastruloids53 पर लागू इन विधियों को मानव अक्षीय बढ़ाव और विभाजन के टोटो इमेजिंग और डेटा विश्लेषण में एक बेहतर सुविधा होगी, विशेष रूप से दीर्घकालिक 4 डी लाइव इमेजिंग के साथ इन इन विट्रो मॉडल सिस्टम की संगतता को देखते हुए। इन प्रोटोकॉल के अलावा, हम विभिन्न उपलब्ध माइक्रोस्कोपी तकनीकों के बारे में सामान्य जानकारी भी प्रदान करते हैं और विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों को फिट करने के लिए उनका उपयोग कैसे किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि यह जानकारी शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगात्मक डिजाइनों में सुधार करने और उनकी प्रयोगशालाओं और संस्थानों में उपलब्ध माइक्रोस्कोपी उपकरण और छवि विश्लेषण उपकरणों का पूरा लाभ उठाने में मदद करती है।

नमूना तैयारी इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, क्योंकि पूरी प्रक्रिया के दौरान भ्रूण के उचित संरक्षण और प्रसंस्करण, विच्छेदन से लेकर माइक्रोस्कोप में बढ़ते तक, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। निर्जलीकरण (और पुनर्जलीकरण), ब्लीचिंग और समाशोधन प्रक्रियाएं नमूना तैयारी के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं, जो इमेजिंग के अंतिम परिणाम को दृढ़ता से प्रभावित करती हैं। इसलिए, हमने अपने प्रोटोकॉल में इन चरणों को विस्तृत किया है और सुझाव प्रदान किए हैं जो शोधकर्ताओं को अपने नमूनों की बेदाग तैयारी प्राप्त करने में मदद करेंगे। विशेष रूप से, हमने पोस्ट-इम्प्लांटेशन माउस भ्रूण (E11.5 तक) को साफ़ करने के लिए तीन अलग-अलग समाधानों के उपयोग का विस्तार से वर्णन किया है। यद्यपि मिथाइल सैलिसिलेट और बीएबीबी का उपयोग कई वर्षों से किया गया है और कुशल समाशोधन अभिकर्मक हैं, कुछ ऊतकों में पूर्ण लेजर प्रवेश, विशेष रूप से मेसोडर्म, कभी-कभी प्राप्त करना मुश्किल होता है। इसके विपरीत, RapiClear इन विकास ता्मक चरणों में माउस भ्रूण को साफ करने में बहुत प्रभावी पाया गया था। हमारे हाथों में, यह विभिन्न भ्रूण ऊतकों में पूर्ण लेजर पेनेट्रेंस को सक्षम करने के लिए साबित हुआ और, चूंकि यह विषाक्त नहीं है और भ्रूण निर्जलीकरण की आवश्यकता नहीं है, यह माइक्रोस्कोपी स्लाइड में भ्रूण को माउंट करने के महत्वपूर्ण चरण को बहुत सरल बनाता है। इसके अलावा, स्लाइड में भ्रूण में हेरफेर करने की आवश्यकता को दूर करने के लिए (एक बार पारदर्शी होने के बाद स्पष्ट भ्रूण बहुत नाजुक और हेरफेर करना मुश्किल हो जाता है) या वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर (जैसे, अमीरा या इमारिस) का सहारा लेने की आवश्यकता होती है, हमने फिजी / इमेजजे (मुफ्त ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर) का उपयोग करके एक सरल लेकिन कुशल पाइपलाइन प्रदान की है, जो डेटा गुणवत्ता को खोए बिना छवि पूर्व-प्रसंस्करण के दौरान एक शारीरिक रूप से मानक / विशिष्ट स्थिति में भ्रूण को पुनर्स्थापित करने की अनुमति देता है। इसलिए, हम उन तरीकों और विवरणों की उम्मीद करते हैं जो हम इस पांडुलिपि में प्रदान करते हैं ताकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस एसेस के दौरान नमूना तैयारी के प्रमुख चरण को बेहतर बनाने और योगदान करने के लिए योगदान किया जा सके।

छवि अधिग्रहण के दौरान, सिस्टम के कॉन्फ़िगरेशन पर विचार करना महत्वपूर्ण है, जो प्रभावित करता है कि नमूनों को लाइव इमेजिंग के लिए कैसे बनाए रखने की आवश्यकता है या 3 डी में इष्टतम अवलोकन के लिए माउंट किया गया है। उदाहरण के लिए, माउस भ्रूण को एक हीटिंग स्रोत, ओ2 के उच्च स्तर और तरल पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया (ठोस नहीं) की आवश्यकता होती है, जिससे एक ईमानदार, या पारंपरिक प्रकाश-शीट कॉन्फ़िगरेशन के साथ माइक्रोस्कोप में लाइव रखना अधिक कठिन हो जाता है। भ्रूण के सही 3 डी इमेजिंग के लिए, स्थिरीकरण भी महत्वपूर्ण है। उपलब्ध प्रकाशिकी भी विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है; उचित 3 डी इमेजिंग के लिए, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों को प्राथमिकता दी जानी चाहिए, हालांकि वे हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं, खासकर जब बड़ी काम करने वाली दूरी की आवश्यकता होती है (कुछ सौ माइक्रोमीटर से अधिक)। शारीरिक (यानी, "डुबकी") लेंस लाइव इमेजिंग के लिए बहुत आम हैं, हालांकि ये ग्लास-बॉटम डिश के माध्यम से इमेजिंग के लिए या बीएबीबी या मिथाइल सैलिसिलेट पर लगाए गए साफ नमूनों के लिए आदर्श नहीं हैं। यद्यपि साफ किए गए ऊतकों के लिए अनुकूलित उद्देश्य अधिक सामान्य होते जा रहे हैं, फिर भी वे अधिकांश प्रयोगशालाओं में खोजने के लिए अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं। पारंपरिक उद्देश्यों के साथ साफ किए गए ऊतकों की छवि बनाना भी संभव है, लेकिन उपयोगकर्ताओं को डेटासेट की व्याख्या और विश्लेषण करने से पहले सीमाओं और आवश्यक देखभाल के बारे में पता होना चाहिए, जैसा कि हम ऊपर दिए गए अनुभागों में बताते हैं। इसके अलावा, इमेजिंग परिणामों का सटीक पता लगाने और व्याख्या करने के लिए हमेशा न केवल उपकरण के सावधानीपूर्वक विकल्प की आवश्यकता होती है, बल्कि ऑपरेटिंग स्थितियों और मापदंडों की सेटिंग की भी आवश्यकता होती है। उपयोगकर्ताओं को उचित डिजिटल इमेजिंग और बायोइमेज की व्याख्या के सिद्धांतों को पूरी तरह से समझने के लिए निम्नलिखित समीक्षाओं को पढ़ने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है 54,55,56,57।

(2 डी) हिस्टोलॉजिकल वर्गों पर लागू इम्युनोफ्लोरेसेंस भ्रूण के अंदर ऊतक और कोशिका संगठन को समझने की मांग करने वाले अध्ययनों की पहचान रही है। पूरे-माउंट इम्युनोलेबलिंग विधियों और गैर-विनाशकारी 3 डी इमेजिंग तकनीकों (जैसा कि यहां वर्णित है) के उद्भव ने विकासात्मक जीवविज्ञानियों को बरकरार भ्रूण में ऊतक और सेल स्थानिक संगठन की जांच करने के साधनों के साथ प्रदान किया है, जहां जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति को समझना आसान और अधिक सटीक है और मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं के साथ उनके संबंध। टोटो इमेजिंग के साथ, अब आभासी हिस्टोलॉजी (मनमाने ढंग से स्लाइस में आभासी सेक्शनिंग) करना संभव है; पूरक चित्रा 3), और 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण उपकरणका उपयोग सेल और ऊतक वास्तुकला और संचार के बारे में विभिन्न परिकल्पनाओं का आसानी से पता लगाने के लिए किया जा सकता है ( चित्रा 2, वीडियो 2 और वीडियो 4 देखें)। यह देखते हुए कि कई पत्रिकाएं (जैसे, eLife और विकास) अब पेपर के ऑनलाइन संस्करण में वीडियो को शामिल करने का अवसर दे रही हैं, हम शोधकर्ताओं से इस अवसर का लाभ उठाने और न केवल 3 डी और 4 डी इमेजिंग प्रयोगों और विश्लेषण करने का आग्रह करते हैं, बल्कि उनके परिणामों को उजागर करने वाले 3 डी वीडियो बनाने के लिए भी। जिस तरह से डेटा प्रस्तुत और प्रकाशित किया जाता है, उसमें यह महत्वपूर्ण परिवर्तन, शोधकर्ताओं और उनके साथियों द्वारा परिणामों की बेहतर समझ को सक्षम करेगा। आखिरकार, इन तरीकों में कशेरुक विभाजन की हमारी समझ में सुधार करने की क्षमता है, विशेष रूप से एनएमपी की भूमिका के बारे में (Attardi et al. (2018)45 और Dias et al. (2020)43 दो अच्छे उदाहरण हैं)।

इस काम में हमने इस बात पर प्रकाश डाला है कि कैसे कुछ सॉफ़्टवेयर उपकरणों (उदाहरण के लिए, अमीरा और इमारिस, लेकिन फिजी / इमेजजे और दृष्टि जैसे मुफ्त ओपन-सोर्स टूल) का उपयोग कशेरुक अक्षीय विस्तार और सोमिटोजेनेसिस के संदर्भ में 3 डी डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण की अनुमति देता है और बढ़ाता है। ज्यादातर मामलों में, जैसे कई जैव सूचना विज्ञान उपकरणों के लिए, यहां वर्णित सॉफ़्टवेयर को संभावित रूप से दूसरे द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है (यानी, कई सॉफ़्टवेयर समाधान और अनावश्यकताएं हैं)। हालांकि, हम पाते हैं कि Imaris में "3 डी व्यू" फ़ंक्शन "3 डी व्यूअर" फिजी / इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके प्राप्त एक की तुलना में बहुत बेहतर गुणवत्ता के साथ एक 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए एमआईपी या मिश्रण मोड के बीच चयन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, हम Imaris में "ओर्थोगोनल व्यूज़" फ़ंक्शन पाते हैं और 3 डी विश्लेषण और परिमाणीकरण (जैसे, "स्पॉट" मॉड्यूल) उपयोगकर्ता मित्रता के लिए इसकी पाइपलाइन। इस मामले में, हालांकि व्यावहारिक रूप से सभी सॉफ़्टवेयर टूल 3 डी रेंडरिंग के कुछ रूपों की अनुमति देते हैं, हम अपने अद्वितीय प्रकाश मॉडल और छायांकन के कारण दृष्टि की सिफारिश करते हैं जो अत्यधिक यथार्थवादी रेंडराइजेशन की पीढ़ी को सक्षम बनाता है ( वीडियो 4 का अंतिम खंड देखें)। छवि डेटासेट (पूर्व-प्रसंस्करण और 3 डी रेंडरिंग) के सभी जैव सूचना प्रसंस्करण के लिए अंगूठे का नियम यह है कि अंतिम परिणाम भ्रूण में जो देखा जाता है उसका एक वफादार प्रतिनिधित्व रहना चाहिए। इसलिए, हमने जेड-अक्ष स्केलिंग विरूपण (अपवर्तक सूचकांक बेमेल के कारण) और गहराई संकेत क्षीणन (गहरे नमूनों में प्रकाश प्रकीर्णन के कारण) द्वारा बनाई गई समस्याओं को कम करने के लिए सरल तरीके प्रदान किए हैं जो छवि डेटासेट की गुणवत्ता और व्याख्या को गंभीर रूप से प्रभावित करते हैं। इन एल्गोरिदम का उपयोग करते हुए, हमने मैन्युअल रूप से सेगमेंट और 3 डी को पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग से मेसोडर्मल ऊतकों का पुनर्निर्माण करने के लिए निर्देश प्रदान किए, मैनुअल कॉन्टूरिंग (अक्सर स्वचालित विभाजन के उपकरणों के साथ संभव नहीं) द्वारा अमीरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके। हम इस सॉफ़्टवेयर को ऊतकों के मैन्युअल काउंटिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी पाते हैं जहां उनके बीच कोई स्पष्ट शारीरिक अलगाव या विपरीत अंतर नहीं है (उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति)। अमीरा के लिए एक गैर-वाणिज्यिक अनुशंसित विकल्प, हालांकि कम शक्तिशाली, LabKIT फिजी / ImageJ प्लगइन (https://imagej.net/Labkit) है।

हमने प्रतिनिधि परिणामों में ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी के साथ चित्रित टोटो ई 18.5 माउस भ्रूण के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन का एक उदाहरण भी शामिल किया है, जो ऑप्टिकल इमेजिंग और 3 डी छवि विश्लेषण की क्षमताओं को पूरे माउस भ्रूणजनन22 तक बढ़ाता है। इन तरीकों का उपयोग समझने और विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, रूपात्मक माप के माध्यम से) कंकाल असामान्यताएं, जैसे कि फ्यूज्ड कशेरुकाएं, स्कोलियोसिस या स्पॉन्डाइलोकोस्टल डिस्ोस्टोसिस, जो बाद में सोमिटोजेनेसिस (जैसे, एलएफएनजी उत्परिवर्तन) के दौरान समस्याओं के कारण हो सकती हैं 13,58,59,60,61,62 . महत्वपूर्ण रूप से, यह इमेजिंग दृष्टिकोण एक वैश्विक संदर्भ में कंकाल विकृतियों के अवलोकन की अनुमति देता है, जिसमें अन्य ऊतक (जैसे, मांसपेशियां) शामिल हैं जो कशेरुक स्तंभ63 को प्रभावित करने वाले फेनोटाइप में भी योगदान कर सकते हैं।

अंत में, और eMouse एटलस प्रोजेक्ट64 से इमेजिंग डेटासेट के साथ किए गए वॉल्यूमेट्रिक मॉडल को उजागर करने वाले हाल के काम के साथ समझौते में, हमने एक विस्तृत चरण-दर-चरण विधि का वर्णन किया है जिसका उपयोग 3 डी मॉडल (जैसे, 3 डी पीडीएफ) की शक्ति को अधिक सामान्य दर्शकों को चित्रित करने और कशेरुक अक्षीय बढ़ाव और विभाजन के अध्ययन और शिक्षण में मदद करने के लिए किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत जानकारी शोधकर्ताओं के डिजाइन, विश्लेषण और उनके प्रयोगों को प्रस्तुत करने के तरीके को बदलने और कशेरुकी शरीर अक्ष गठन के हमारे ज्ञान में सुधार करने में योगदान देती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम LuVeLu रिपोर्टर तनाव के लिए Olivier Pourquié और अलेक्जेंडर Aulehla धन्यवाद करना चाहते हैं, RapiClear परीक्षण नमूने के लिए SunJin प्रयोगशाला, BigStitcher का उपयोग करने में मदद के लिए ह्यूगो परेरा, Nuno Granjeiro लाइव इमेजिंग उपकरण स्थापित करने में मदद करने के लिए, IGC पशु सुविधा और इस काम के दौरान उपयोगी टिप्पणियों और समर्थन के लिए Mallo प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों।

हम आईजीसी की उन्नत इमेजिंग सुविधा के तकनीकी समर्थन को धन्यवाद देते हैं, जो पुर्तगाली फंडिंग रेफरी # पीपीबीआई-पीओसीआई-01-0145-फेडर-022122 और रेफरी # पीटीडीसी / बीआईआई-बीटीआई / 32375/2017 द्वारा सह-वित्त पोषित है, लिस्बोआ क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम (लिस्बोआ 2020) द्वारा सह-वित्त पोषित, पुर्तगाल 2020 साझेदारी समझौते के तहत, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (फेडर) के माध्यम से। इस पांडुलिपि में वर्णित कार्य को अनुदान LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, पुर्तगाल) और SCML-MC-60-2014 (सांता कासा दा मिसेरिकोर्डिया, पुर्तगाल) द्वारा M.M 128426.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher - Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0 (any) - 100um thick
Coverglass 20x20 mm #1 (any) - 170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5 (any) - To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) - Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) - Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging - Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments - Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500 -
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft - Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm (any) - To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 168 3 डी पुनर्निर्माण लाइव इमेजिंग कशेरुक माउस भ्रूण विकास somitogenesis mesoderm अक्षीय विस्तार NMPs immunofluorescence समाशोधन तकनीक इमेजिंग विश्लेषण शिक्षण.
कशेरुक अक्षीय बढ़ाव और विभाजन का अध्ययन करने के लिए तीन और चार आयामी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण दृष्टिकोण
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Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., … More

Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

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