Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o sucesso da fluorescência interfásico na detecção de hibridização in situ em manchas de medula óssea de múltiplos pacientes com mieloma.
Abstract
A fluorescência na detecção de hibridização situ (FISH) é um método indispensável na estratificação de risco genético em mieloma múltiplo (MM), que é uma das malignidades hematológicas mais comuns. A característica de identificação de MM são células plasmáticas malignas acumuladas na medula óssea. Os relatórios de PEIXEs para MM se concentram principalmente em células plasmáticas clonais purificadas ou identificadas, em vez de todas as células nucleadas, classificando-se com contas magnéticas anti-CD138 ou marcando com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ ou λ. Os núcleos interfasos da medula óssea são geralmente obtidos a partir de células frescas da medula óssea. No entanto, o enriquecimento satisfatório das amostras de células plasmáticas requer grandes quantidades de medula óssea anticoagulada de heparina fresca, que não pode ser obtida no caso de difícil extração de medula óssea ou uma torneira seca de medula óssea. Aqui, estabelecemos um novo método para melhorar o sucesso da detecção de PEIXEs em manchas de medula óssea manchadas ou não manchadas. Manchas de medula óssea são mais fáceis de obter do que espécimes de medula óssea anticoagulados.
Introduction
O mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna de células plasmáticas (PC) com forte heterogeneidade biológica e grandes diferenças individuais na eficácia clínica, com períodos de sobrevivência que variam de meses a décadas. Características citogenéticas são indicadores prognósticos importantes da MM. O sistema de estratificação de risco e os tratamentos individualizados baseados em características genéticas tornaram-se temas de intenso interesse em pesquisas clínicas sobre MM1. As aberrações de PCs testados em fluorescência no painel de hibridização situ (FISH) da medula óssea (BM) incluem del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) de ganho/amplificação e exclusão de 1p (CDKN2C).
A citogenética metafase padrão deve ser incluída na avaliação inicial dos pacientes com MM. Embora o karyotipping convencional de banda G ofereça o benefício de uma análise de cromossomo inteiro, o baixo rendimento deste método leva a muitos resultados falsos negativos2. Tradicionalmente, os PCs têm sido vistos como em grande parte incapazes de se dividir porque são os produtos em estágio final da diferenciação de linfócitos B. Isso dificulta a obtenção de imagens divididas. A análise citogenética aprimorada em MM com culturas de longo prazo (6 dias) e estimulação de culturas por citocinas pode ser um método promissor para identificar anormalidades citogenéticas em pacientes recém-diagnosticados em MM3. Mesmo quando o tempo de cultura foi prolongado para 6 dias, no entanto, anormalidades citogenéticas foram relatadas com precisão em 30%-50% dos pacientes com MM4. Além disso, a MM é caracterizada por complexas aberrações citogenéticas que refletem sua heterogeneidade prognóstica. No entanto, a resolução da tecnologia tradicional de banda cromossomo é baixa, o que pode facilmente levar à detecção perdida de anormalidades cromossômicas em MM.
O PEIXE interfásico, preferencialmente após a classificação ou marcação de PC baseado em contas magnéticas cd138 positivos com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ/λ, é indispensável na análise de MM5,6. Uma amostra selecionada com CD138 positivo é fortemente recomendada para o rendimento otimizado das células tumorais. No entanto, a quantitação precisa de aberrações citogenéticas requer pelo menos 4 mL de BM anticoagulado para classificação de PC. Além disso, as combinações de classificação de contas imunomagnéticas CD138 com mímulas citoplasmáticas de cadeia luminosa com teste de PEIXE (cIg-FISH) aumentam inúmeros custos experimentais e são demoradas.
Normalmente, a razão do PC é primeiramente avaliada a partir do exame morfológico de manchas manchadas de BM ou seções de biópsia BM7,8. Amostras de BM da mais alta qualidade (primeiras amostras de aspiração de medula) são utilizadas para testes morfológicos, enquanto aquelas enviadas para FISH ou outra detecção são muitas vezes as amostras secundárias aspiradas com altas proporções de diluição com sangue periférico.
Já na década de 1990, vários estudos mostraram que as manchas de MMC podem ser usadas diretamente para exames intersticiais de PEIXEs, o que provou ser um método confiável e repetível9. Um estudo elegante baseado na morfologia celular e citoquímica esterase combinado com peixes de sangue periférico e manchas de BM confirmou sua grande significância clínica para elucidar anormalidades cromossômicas em pacientes com leucemia granulócítica e linfocítica10.
Aqui, fornecemos um novo método para melhorar o sucesso da detecção de peixes interfasos em pacientes mm.
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Protocol
Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan (No. 2019065). Os espécimes foram coletados de um paciente mm no Departamento de Hematologia do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan (China).
1. Preparação das manchas de BM
- Coloque os primeiros 0,2 mL de solução BM em um slide de vidro descartável limpo.
- Espalhe as manchas de BM para espessura uniforme com caudas afiadas, removendo rapidamente o BM. Então, seque naturalmente.
- Cubra os filmes de BM com 1 mL de solução Wright-Giemsa para aproximadamente 10 s em temperatura ambiente.
- Adicione 1 mL de tampão fosfato aos slides.
NOTA: Tome cuidado para evitar que a solução de corante seque ou flua dos slides. - Misture a solução de corante suavemente e mantenha-a por 15 minutos à temperatura ambiente.
- Enxágüe os slides com água limpa e seque-os no ar à temperatura ambiente.
- Use microscopia de luz dianteira para detectar PCs malignos. Os PCs devem estar bem dispersos.
2. Pré-processamento de peixes das manchas de BM
- Cubra a área hibridizada com solução fixativa por 10 minutos para descolorir e fixar os PCs.
- Para preparar uma solução fixativa fresca, misture metanol com ácido acético glacial em uma proporção de volume de 3:1.
- Enxágüe o escorregador com água desionizada (dH2O) e seque-a no ar à temperatura ambiente.
- Pré-aqueça um frasco contendo tampão SSC de 2x a 56 °C em banho-maria. Diluir o buffer para 20x SSC antes de usar.
- Para preparar 20x SSC, misture completamente 176 g de cloreto de sódio e 88 g de citrato de sódio com 800 mL de dH2O. Meça o pH e ajuste para pH 5,3 ± 0,2. Em seguida, adicione dH2O para trazer o volume final para 1 L.
- Lave a mancha de BM preparada no tampão SSC 2x pré-aquecido por 10 minutos, seguido de mergulhar em água deionizada à temperatura ambiente.
- Desidratar a mancha em um gradiente de etanol (70%, 85% e 100% etanol, cada um por 1 min). Seque a mancha por 10 minutos.
3. MM manchar PEIXEs e lavar
NOTA: Todas as etapas foram realizadas em uma sala escura para evitar a saciamento da fluorescência.
- Adicione a mistura de sonda TP53/centromere do cromossomo 17 (CEP17) à área de hibridização e cubra-a com um deslizamento de tampa. Pressione suavemente com pinças finas para remover bolhas de ar por baixo.
- Sele todos os lados da tampa com cimento de borracha para garantir um bom aperto.
- Após a solidificação do cimento de borracha, coloque o slide em uma máquina de PEIXE automática. Realize a denaturação a 78 °C por 5 min, seguido de hibridização a 37 °C durante a noite.
- Pegue o slide da máquina FISH. Use pinças finas para remover o cimento de borracha suavemente.
- Mergulhe o slide em 2x SSC à temperatura ambiente por aproximadamente 1 ou 2 minutos para lavar a tampa.
- Lave o slide em 68 °C pré-aquecido 0,4x SSC/0,3% NP-40 tampão em um banho de água por 2 min.
- Prepare a solução 0,4x SSC/0,3% NP-40 misturando completamente 20 mL de 20x SSC (pH 5.3) com 950 mL de dH2O. Em seguida, adicione 3 mL de NP-40 e misture bem até dissolver completamente. Meça o pH e ajuste para 7.0-7.5 com NaOH. Em seguida, adicione dH2O para trazer o volume final da solução total para 1 L.
- Lave os slides com 2x SSC em um banho de água de 37 °C por 1 min. Coloque ereto no escuro para secar completamente por 10 minutos.
- Adicione 10 μL de DAPI à área hibridizada e cubra com um deslizamento de tampa.
4. Análise e imagem de peixes
- Veja o slide hibridizado usando um conjunto de filtro adequado em um microscópio de fluorescência.
- Use um filtro óptico monocromático azul fluoróforo para observar a intensidade da fluorescência do núcleo celular. Tire imagens do núcleo celular sob um conjunto de filtro DAPI.
- Use uma sonda de centromerômoso cromossomo para mostrar quantos cromossomos uma célula contém. Rótulo CEP17 com fluorescência verde. Use um filtro óptico fluoróforo verde de espectro para observar a localização do CEP17. Pegue uma imagem de sinais CEP17 sob o conjunto de filtros verdes.
- Rotule o gene TP53 com fluorescência de laranja. Use um filtro óptico de fluoróforo laranja de espectro para observar TP53. Pegue uma imagem de sinais TP53 sob este conjunto.
- Mescle essas três imagens e examine-as para anormalidades numéricas.
NOTA: Em uma célula interfárica normal, dois sinais laranja e dois verdes são observados dentro de um núcleo com fluorescência azul, indicando um par de cromossomo normal 17 (Figura 1).
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Representative Results
Na avaliação morfológica inicial de um paciente mm recém-diagnosticado, 15% dos PCs em uma mancha de BM foram encontrados com núcleos maiores e mais escuros, juntamente com quantidades maiores de citoplasma do que os PCs normais (Figura 2A). O primeiro tubo de BM anticoagulado de heparina detectado pela técnica do imunofenótipo revelou apenas 2,3% dos PCs aberrantes monoclonais. Cd138 de hidromassagem de contas imunomagnéticas em combinação com FISH ou a técnica cIg-FISH é essencial para obter um resultado de PEIXE preciso. No entanto, o BM aspirado é limitado no caso de ser uma torneira seca. Manchas de BM foram utilizadas para testar peixes interfase. Um PC binucleado representativo em filme BM foi localizado por um microscópio de fluorescência fase Vernier caliper (Figura 2B). Fish foi aplicado nas manchas de BM para teste de TP53 e CEP17. Os resultados do FISH mostraram quatro sinais laranja e quatro verdes em um núcleo de PC interfásico (Figura 2C), sugerindo que quatro cópias do cromossomo 17 foram localizadas nos núcleos de PC metafásico. Os resultados do karyotyping foram obtidos estendendo o tempo de cultura por até 3 dias e posteriormente analisados utilizando software analítico FISH (Figura 2D). Verificou-se ainda a precisão dos resultados do PEIXE interfásico nas manchas de BM.
Figura 1: Sinais normais da sonda TP53/CEP17 FISH para células interfásicas (1000x). A intensidade da fluorescência do núcleo celular era azul, o TP53 era laranja, e o CEP17 era verde. Nessas 3 células interfásicos normais, dois sinais laranja e dois verdes apareceram dentro do núcleo azul-fluorescente, indicando dois pares do cromossomo normal 17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia e imagens genéticas da medula óssea (MMO) em pacientes com mieloma múltiplo (MM). (A) Células de mieloma com distribuição agrupada indicadas pelas setas (
) após a coloração de Wright-Giemsa da mancha BM (1000×). (B) Células plasmacitóides binucleadas indicadas por setas (
) em uma imagem em escala de cinza tirada por uma câmera em preto e branco em um microscópio de fluorescência (1000×). (C) TP53/ centromere de fluorescência cromossomo 17 (CEP17) no teste de hibridização situ (FISH) para a mancha de BM. O FISH revela quatro sinais de TP53 e quatro CEP17 em cada núcleo (→) (1000×). (D) O karyograma de cromossomo anormal mostra dois pares de cromossomo 17 em um núcleo (
). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A aplicação de PEIXEs à estratificação de risco genético em MM é essencial. A parte crítica dos relatórios fish não são todas as células nucleadas, mas os PCs clonais especificamente purificados ou identificados por classificação com contas magnéticas anti-CD138 ou marcação com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ ou λ. Peixes interfásicos após a classificação do PC ou cIg-FISH foram considerados significativos no diagnóstico de MM devido à proporção relativamente menor de PCs no BM. No entanto, esses métodos têm algumas deficiências, incluindo processos complexos, altas demandas de espécimes e altos custos experimentais. Cinquenta PCs podem ser rapidamente localizados por uma pinça Vernier de estágio microscópio. As manchas de BM são muito mais fáceis de obter do que as amostras de MM anticoagulantes porque a obtenção de BM antiagulado requer procedimentos complexos para obter o núcleo. Assim, estabelecemos um método convincente para peixes de difamação de MM para a detecção de células MM.
Em primeiro lugar, as manchas de BM devem ser feitas por um experiente analista morfológico. Para espalhar o BM em manchas, o espalhador é colocado na frente do aspirador em um ângulo de 30°-45° e puxado para trás para fazer contato com o fluido11. Em seguida, o espalhador é movido para a frente uniformemente em um movimento constante. A densidade da mancha BM deve ser adaptada para que o comprimento seja aproximadamente três quartos do slide12. O filme BM deve ser mais estreito que o slide para garantir que as células em todas as bordas possam ser detectadas13. A seleção da área de hibridização e a localização dos PCs foi fundamental em nosso protocolo, e isso requer um analista morfológico experiente. Para as manchas de BM que contenham menos PCs, os PCs devem ser localizados usando um objetivo de imersão de óleo de microscópio de fluorescência para a frente e pinças Vernier no estágio objetivo, e suas imagens podem ser tiradas por fotos monocromáticas. Por exemplo, se os PCs representaram apenas 3% do total de células nucleadas em um filme de BM por exame morfológico, uma região híbrida bem dispersa de 8 mm x 8 mm deve conter nada menos que 50 PCs para um teste de PEIXE. Após a hibridização do PEIXE, os sinais de fluorescência em pelo menos 50 PCs devem ser contados por um analista experiente14.
No entanto, uma limitação dessa técnica é a exigência de manchas frescas de BM. Se as manchas de BM forem armazenadas por mais de 2 anos, as imagens de FISH resultantes podem ser obscuras, resultando em má interpretação.
Em conjunto, o peixe de mancha de BM acima mencionado pode ser amplamente utilizado para pacientes com malignidades hematológicas quando a extração de BM é difícil ou ocorre torneira seca de BM, mesmo em doenças hipo-proliferativas com menos células nucleadas. Esperamos que mais pacientes com malignidades hematológicas possam se beneficiar desse método.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto foi apoiado pelo Fundo de Inovação da WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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