Summary
Burada, multipl miyelom hastalarından alınan kemik iliği yaymalarında interfaz floresan in situ hibridizasyon tespitinin başarısını artırmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Floresan in situ hibridizasyon (FISH) tespiti, en sık görülen hematolojik malignitelerden biri olan multipl miyelomda (MM) genetik risk sınıflamasında vazgeçilmez bir yöntemdir. MM'nin tanımlayıcı özelliği, kemik iliğinde biriken malign plazma hücreleridir. MM için FISH raporları, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralayarak veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ veya λ ile işaretleyerek tüm çekirdekli hücrelerden ziyade saflaştırılmış veya tanımlanmış klonal plazma hücrelerine odaklanır. Kemik iliği interfaz çekirdekleri genellikle taze kemik iliği hücrelerinden elde edilir. Bununla birlikte, plazma hücresi örneklerinin tatmin edici bir şekilde zenginleştirilmesi, zor kemik iliği ekstraksiyonu veya kemik iliği kuru musluğu durumunda elde edilemeyen büyük miktarda taze heparin anti-pıhtılaşmış kemik iliği gerektirir. Bu yazıda, lekeli veya lekesiz kemik iliği yaymalarında FISH tespitinin başarısını artırmak için yeni bir yöntem oluşturduk. Kemik iliği yaymalarının elde edilmesi, antikoagüle kemik iliği örneklerinden daha kolaydır.
Introduction
Multipl miyelom (MM), güçlü biyolojik heterojeniteye ve klinik etkinliğinde büyük bireysel farklılıklara sahip, sağkalım süreleri aylardan on yıllara kadar değişen malign bir plazma hücresi (PC) hastalığıdır. Sitogenetik özellikler MM'nin önemli prognostik göstergeleridir. Risk sınıflandırma sistemi ve genetik özelliklere dayalı bireyselleştirilmiş tedaviler, MM1 ile ilgili klinik araştırmalarda yoğun ilgi gören konular haline gelmiştir. Kemik iliğinin (BM) floresan in situ hibridizasyon (FISH) panelinde test edilen PC'lerin anormallikleri arasında del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14; 16) (IGH / MAF), t (14: 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) kazanç / amplifikasyon ve 1p (CDKN2C) delesyonu bulunur.
MM hastalarının ilk değerlendirmesine standart metafaz sitogenetiği dahil edilmelidir. Geleneksel G bantlı karyotipleme, tüm kromozom analizinin faydasını sunsa da, bu yöntemin düşük verimi birçok yanlış negatif sonuca yol açar2. Geleneksel olarak, PC'ler B lenfosit farklılaşmasının son aşama ürünleri oldukları için büyük ölçüde bölünemez olarak görülmüştür. Bu, bölünmüş görüntüler elde etmeyi zorlaştırır. Uzun süreli kültürlerle (6 gün) MM'de geliştirilmiş sitogenetik analiz ve kültürlerin sitokinlerle uyarılması, yeni tanı konmuş MM hastalarında sitogenetik anormallikleri tanımlamak için umut verici bir yöntem olabilir3. Bununla birlikte, kültür süresi 6 güne uzatıldığında bile, MM hastalarının %30-%50'sinde sitogenetik anormallikler doğru bir şekilde bildirilmiştir4. Ayrıca, MM, prognostik heterojenliğini yansıtan karmaşık sitogenetik anormalliklerle karakterizedir. Bununla birlikte, geleneksel kromozom bantlama teknolojisinin çözünürlüğü düşüktür, bu da MM'de kromozomal anormalliklerin kolayca tespit edilmesine yol açabilir.
İnterfaz FISH, tercihen CD138-pozitif manyetik boncuk bazlı PC sıralama veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ / λ ile işaretlemeden sonra, MM5,6 analizinde vazgeçilmezdir. CD138 pozitif seçilmiş bir örnek, tümör hücrelerinin optimize edilmiş verimi için şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, sitogenetik anormalliklerin doğru kantitasyonu, PC sıralaması için en az 4 mL antikoagüle BM gerektirir. Ek olarak, CD138 immünomanyetik boncuk ayıklama ile FISH veya FISH testi (cIg-FISH) ile sitoplazmik κ / λ hafif zincirli immünoglobulin kombinasyonları çok sayıda deneysel maliyeti arttırır ve zaman alıcıdır.
Genellikle PK oranı ilk olarak boyalı BM yaymalarının veya BM biyopsi kesitlerinin morfolojik incelemesinden değerlendirilir7,8. Morfolojik testler için en yüksek kalitede BM örnekleri (ilk kemik iliği aspirat örnekleri) kullanılırken, FISH veya başka bir tespit için gönderilenler genellikle periferik kanla yüksek oranda seyreltme oranına sahip ikincil aspirat örnekleridir.
1990'lı yılların başlarında, birçok çalışma, BM yaymalarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğu kanıtlanmış olan interstisyel FISH muayeneleri için doğrudan kullanılabileceğini göstermiştir9. Periferik kan ve BM yaymalarının FISH ile kombine edilmiş hücre morfolojisi ve esteraz sitokimyasına dayanan zarif bir çalışma, granülositik ve lenfositik lösemili hastalarda kromozomal anormallikleri aydınlatmak için büyük klinik önemini doğrulamıştır10.
Burada, MM hastalarında interfaz FISH tespitinin başarısını artırmak için yeni bir yöntem sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine göre yürütülmüş ve Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Etik Komitesi (No. 2019065) tarafından onaylanmıştır. Örnekler, Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi (Çin) Hematoloji Bölümü'ndeki bir MM hastasından toplandı.
1. BM yaymalarının hazırlanması
- İlk 0,2 mL BM çözeltisini temiz bir tek kullanımlık cam kızağa yerleştirin.
- BM'yi hızla çıkararak BM yaymalarını keskin kuyruklarla eşit kalınlığa yayın. Daha sonra doğal olarak kurulayın.
- BM filmlerini oda sıcaklığında yaklaşık 10 s boyunca 1 mL Wright-Giemsa çözeltisi ile örtün.
- Slaytlara 1 mL fosfat tamponu ekleyin.
NOT: Boya çözeltisinin kurumasını veya slaytlardan akmasını önlemeye özen gösterin. - Boya çözeltisini nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca saklayın.
- Slaytları temiz suyla durulayın ve oda sıcaklığında havada kurulayın.
- Kötü huylu bilgisayarları tespit etmek için ileri ışık mikroskobu kullanın. PC'ler iyi dağılmış olmalıdır.
2. BM yaymalarının FISH ön işlemesi
- PC'lerin rengini değiştirmek ve sabitlemek için hibridize edilmiş alanı 10 dakika boyunca fiksatif çözelti ile örtün.
- Taze fiksatif çözelti hazırlamak için, metanolü buzul asetik asit ile 3: 1 hacim oranında karıştırın.
- Slaytı deiyonize suyla (dH2O) durulayın ve oda sıcaklığında havada kurutun.
- 2x SSC tamponu içeren bir kavanozu su banyosunda 56 °C'ye önceden ısıtın. Kullanmadan önce tamponu 20x SSC'ye kadar taze olarak seyreltin.
- 20x SSC hazırlamak için, 176 g sodyum klorür ve 88 g sodyum sitratı 800 mL dH2O ile iyice karıştırın. pH'ı ölçün ve pH 5.3 ± 0.2'ye ayarlayın. Ardından, son hacmi 1 L'ye getirmek için dH2O ekleyin.
- Hazırlanan BM smearını önceden ısıtılmış 2x SSC tamponunda 10 dakika yıkayın, ardından oda sıcaklığında deiyonize suya batırın.
- Yaymayı bir etanol gradyanında (% 70,% 85 ve% 100 etanol, her biri 1 dakika boyunca) kurutun. Lekeyi 10 dakika boyunca hava ile kurulayın.
3. BM smear BALIK ve yıkama
NOT: Tüm adımlar, floresan söndürmeyi önlemek için karanlık bir odada gerçekleştirilmiştir.
- Kromozom 17 (CEP17) prob karışımının TP53 / sentromerini hibridizasyon alanına ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün. Hava kabarcıklarını alttan çıkarmak için ince sivri cımbızla hafifçe bastırın.
- İyi bir sızdırmazlık sağlamak için kapak kaymasının her tarafını kauçuk çimento ile kapatın.
- Kauçuk çimentonun katılaşmasından sonra, sürgüyü otomatik bir FISH makinesine yerleştirin. 5 dakika boyunca 78 °C'de denatürasyon, ardından gece boyunca 37 °C'de hibridizasyon gerçekleştirin.
- Slaytı FISH makinesinden alın. Kauçuk çimentoyu nazikçe çıkarmak için ince sivri cımbız kullanın.
- Kapak kapağını yıkamak için kızağı oda sıcaklığında 2x SSC'ye yaklaşık 1 veya 2 dakika batırın.
- Kızağı 68 °C önceden ısıtılmış 0,4x SSC/%0,3 NP-40 tamponunda bir su banyosunda 2 dakika boyunca yıkayın.
- 20 mL 20x SSC (pH 5.3) ile 950 mL dH2O karıştırarak 0,4x SSC / %0,3 NP-40 çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, 3 mL NP-40 ekleyin ve tamamen çözünene kadar iyice karıştırın. OH'yi ölçün ve NaOH ile 7.0-7.5'e ayarlayın. Ardından, toplam çözeltinin son hacmini 1 L'ye getirmek için dH2O ekleyin.
- Kızakları 2x SSC ile 37 °C su banyosunda 1 dakika boyunca yıkayın. 10 dakika boyunca iyice kuruması için karanlıkta dik ayarlayın.
- Hibridize alana 10 μL DAPI ekleyin ve bir kapak kayışı ile örtün.
4. FISH analizi ve görüntüleme
- Floresan mikroskopta uygun bir filtre seti kullanarak hibridize slaytı görüntüleyin.
- Hücre çekirdeğinin floresan yoğunluğunu gözlemlemek için tek renkli mavi florofor optik filtre kullanın. Hücre çekirdeği görüntülerini bir DAPI filtre kümesi altında alın.
- Bir hücrenin kaç kromozom içerdiğini göstermek için bir kromozom sentromer probu kullanın. CEP17'yi yeşil floresan ile etiketleyin. CEP17'nin yerini gözlemlemek için spektrum yeşili florofor optik filtre kullanın. Yeşil filtre setinin altında bir CEP17 sinyal görüntüsü alın.
- TP53 genini turuncu floresan ile etiketleyin. TP53'ü gözlemlemek için spektrumlu turuncu florofor optik filtre kullanın. Bu setin altında bir TP53 sinyal görüntüsü alın.
- Bu üç görüntüyü birleştirin ve sayısal anormallikler için inceleyin.
NOT: Normal bir fazlar arası hücrede, mavi floresanlı bir çekirdeğin içinde iki turuncu ve iki yeşil sinyal gözlenir ve bu da bir çift normal kromozom 17'yi gösterir (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yeni tanı konmuş bir MM hastasının ilk morfolojik değerlendirmesinde, BM yaymasındaki PC'lerin% 15'inin normal PC'lerden daha büyük miktarlarda sitoplazma ile birlikte daha büyük ve daha koyu çekirdeklere sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 2A). İmmünofenotip tekniği ile tespit edilen ilk heparin anti-pıhtılaşmış BM tüpü, monoklonal anormal PC'lerin sadece% 2.3'ünü ortaya çıkardı. CD138 immünomanyetik boncuk sıralama, FISH veya cIg-FISH tekniği ile kombinasyon halinde doğru bir FISH sonucu elde etmek için gereklidir. Bununla birlikte, aspire edilmiş BM, kuru bir musluk olması durumunda sınırlıdır. İnterfaz FISH'i test etmek için BM yaymaları kullanıldı. BM filmindeki temsili bir binüklee PC, floresan mikroskop aşaması Vernier kumpası ile lokalize edildi (Şekil 2B). FISH, TP53 ve CEP17'yi test etmek için BM yaymalarına uygulandı. FISH sonuçları, bir interfaz PC çekirdeğinde dört turuncu ve dört yeşil sinyal gösterdi (Şekil 2C), kromozom 17'nin dört kopyasının metafaz PC çekirdeğinde lokalize olduğunu düşündürmektedir. Karyotipleme sonuçları, kültür süresinin 3 güne kadar uzatılmasıyla elde edilmiş ve FISH analitik yazılımı kullanılarak daha fazla analiz edilmiştir (Şekil 2D). BM yaymalarındaki interfaz FISH sonuçlarının doğruluğu daha da doğrulandı.
Şekil 1: TP53/CEP17 FISH probunun fazlar arası hücreler için normal sinyalleri (1000x). Hücre çekirdeğinin floresan yoğunluğu mavi, TP53 turuncu ve CEP17 yeşildi. Bu 3 normal fazlar arası hücrede, mavi floresan çekirdeğin içinde hem iki turuncu hem de iki yeşil sinyal belirdi ve normal kromozom 17'nin iki çiftini gösterdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Multipl miyelom (MM) hastalarında kemik iliğinin (BM) morfolojisi ve genetik görüntüleri. (A) BM yaymasının Wright-Giemsa boyamasından sonra oklarla () gösterilen kümelenmiş dağılıma sahip miyelom hücreleri (
1000×). (B) Oklarla gösterilen plazmasitoid hücreleri () floresan mikroskop üzerinde siyah beyaz bir kamera tarafından çekilen gri tonlamalı bir görüntüde (
1000×). (C) BM yayması için TP53 / kromozom 17 (CEP17) floresan in situ hibridizasyon (FISH) probu testinin sentromerleri. FISH, her çekirdekte dört TP53 ve dört CEP17 sinyali ortaya çıkarır (→) (× 1000). (D) Anormal kromozom karyogramı, bir çekirdekte iki çift kromozom 17 gösterir (
). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MM'de genetik risk sınıflamasına FISH'in uygulanması esastır. FISH raporlarının kritik kısmı tüm çekirdekli hücreler değil, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralanarak veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ veya λ ile işaretlenerek özel olarak saflaştırılan veya tanımlanan klonal PC'lerdir. PC sıralama veya cIg-FISH sonrası interfaze FISH, BM'deki PC'lerin nispeten daha düşük oranı nedeniyle MM tanısında anlamlı bulunmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin karmaşık süreçler, yüksek numune talepleri ve yüksek deneysel maliyetler dahil olmak üzere bazı eksiklikleri vardır. Elli PC, mikroskop aşamalı bir Vernier kumpası ile hızlı bir şekilde bulunabilir. BM yaymalarının elde edilmesi antikoagülan BM örneklerinden çok daha kolaydır, çünkü anti-pıhtılaşmış BM elde etmek çekirdeği elde etmek için karmaşık prosedürler gerektirir. Bu doğrultuda MM hücrelerinin tespiti için BM smear FISH için ikna edici bir yöntem oluşturduk.
İlk olarak, BM yaymaları deneyimli bir morfolojik analist tarafından yapılmalıdır. BM'yi yaymalara yaymak için, yayıcı aspiratın önüne 30°-45° açıyla yerleştirilir ve sıvıyla temas etmek için geri çekilir11. Daha sonra, yayıcı sabit bir hareketle düzgün bir şekilde ileri doğru hareket ettirilir. BM yaymasının yoğunluğu, uzunluk slaytın yaklaşık dörtte üçü olacak şekilde uyarlanmalıdır12. BM filmi, tüm kenarlardaki hücrelerin algılanabilmesini sağlamak için slayttan daha dar olmalıdır13. Hibridizasyon alanının seçimi ve PC'lerin lokalizasyonu protokolümüzde kritik öneme sahipti ve bu da deneyimli bir morfolojik analist gerektiriyordu. Daha az PC içeren BM yaymalar için, PC'ler ileri floresan mikroskop yağ daldırma hedefi ve objektif aşamada Vernier kaliperleri kullanılarak lokalize edilmeli ve görüntüleri tek renkli çekimlerle çekilebilir. Örneğin, PC'ler morfolojik inceleme ile bir BM filmindeki toplam çekirdekli hücrelerin sadece% 3'ünü oluşturuyorsa, 8 mm x 8 mm'lik iyi dağılmış bir hibrit bölge, bir FISH testi için en az 50 PC içermelidir. FISH hibridizasyonundan sonra, en az 50 PC'deki floresan sinyalleri deneyimli bir analist tarafından sayılmalıdır14.
Bununla birlikte, bu tekniğin bir sınırlaması, taze BM yaymaları için gerekliliktir. BM yaymaları 2 yıldan fazla saklanırsa, ortaya çıkan FISH görüntüleri belirsiz olabilir ve yanlış yorumlamaya neden olabilir.
Birlikte ele alındığında, yukarıda belirtilen BM smear FISH, BM ekstraksiyonu zor olduğunda veya BM kuru musluğu meydana geldiğinde, daha az çekirdekli hücreye sahip hipo-proliferatif hastalıklarda bile, hematolojik maligniteleri olan hastalar için yaygın olarak kullanılabilir. Hematolojik maligniteleri olan daha fazla hastanın bu yöntemden fayda görebileceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu proje WNLO 2018WNLOKF023 İnovasyon Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
