Summary
ここでは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄塗抹標本に対する相間蛍光 in situ ハイブリダイゼーション検出の成功を改善するためのプロトコールを提示する。
Abstract
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)検出は、最も一般的な血液悪性腫瘍の1つである多発性骨髄腫(MM)における遺伝的リスク層別化に不可欠な方法である。MMの同定特徴は、骨髄中に悪性形質細胞が蓄積されたことである。MMに関するFISHの報告は、抗CD138磁気ビーズで選別するか、細胞質免疫グロブリン軽鎖κまたはλでマーキングすることによって、すべての有核細胞ではなく、精製または同定されたクローン形質細胞に主に焦点を当てています。骨髄間相核は、通常、新鮮な骨髄細胞から得られる。しかし、形質細胞検体の十分な濃縮には、大量の新鮮なヘパリン抗凝固骨髄が必要であり、これは困難な骨髄抽出や骨髄ドライタップの場合には得られない。本明細書では、染色または未染色の骨髄塗抹標本に対するFISH検出の成功を改善するための新規な方法を確立する。骨髄塗抹標本は、抗凝固骨髄標本よりも入手が容易である。
Introduction
多発性骨髄腫(MM)は、強い生物学的不均一性と臨床的有効性の大きな個人差を有する悪性形質細胞(PC)疾患であり、生存期間は数ヶ月から数十年の範囲である。細胞遺伝学的特徴は、MMの重要な予後指標である。リスク層別化システムや遺伝的特徴に基づく個別化治療は、MM1の臨床研究において大きな関心を集めています。骨髄(BM)の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)パネルで試験されたPCの収差には、del 13q14(RB1)、del 17p13(TP53)、t(4;14)(IGH/FGFR3)、t(11;14)(IGH/MYEOV)、t(14;16)(IGH/MAF)、t(14:20)(IGH/MAFB)、1q21(CKS1B)ゲイン/増幅、および1p(CDKN2C)欠失が含まれる。
標準的な中期細胞遺伝学は、MM患者の初期評価に含めるべきである。従来のGバンド核型解析は全染色体解析の利点を提供しますが、この方法の収率が低いため、多くの偽陰性の結果が得られます2。伝統的に、PCはBリンパ球分化の末期産物であるため、分裂することがほとんどできないと考えられてきました。これにより、分割画像の取得が難しくなります。長期培養(6日間)およびサイトカインによる培養物の刺激によるMMにおける細胞遺伝学的解析の改善は、新たに診断されたMM患者における細胞遺伝学的異常を同定するための有望な方法であり得る3。しかし、培養時間を6日間に延長した場合でも、MM患者の30~50%で細胞遺伝学的異常が正確に報告されました4。さらに、MMは、その予後不均一性を反映する複雑な細胞遺伝学的異常によって特徴付けられる。しかし、従来の染色体バンディング技術の分解能は低く、MMにおける染色体異常の検出を見逃し易くする可能性がある。
間相FISH、好ましくはCD138陽性磁気ビーズベースのPCソーティングまたは細胞質免疫グロブリン軽鎖κ/λによるマーキングの後、MM5,6の分析に不可欠です。CD138陽性の選択されたサンプルは、腫瘍細胞の収量を最適化するために強く推奨される。しかし、細胞遺伝学的異常を正確に定量するには、PCソーティングのために少なくとも4mLの抗凝固BMが必要です。さらに、FISHによるCD138免疫磁気ビーズソーティングまたはFISH検査による細胞質κ/λ軽鎖免疫グロブリン(cIg-FISH)の組み合わせは、多数の実験コストを増加させ、時間がかかります。
通常、PC比は、染色されたBM塗抹標本またはBM生検切片の形態学的検査から最初に評価される7,8。最高品質のBM試料(第1骨髄吸引試料)は形態学的検査に使用されるが、FISHまたは他の検出のために送られたものは、しばしば末梢血との希釈率が高い二次吸引試料である。
早くも1990年代には、BM塗抹標本が間質FISH検査に直接使用できることが複数の研究で示され、信頼性が高く再現性のある方法であることが証明されています9。末梢血のFISHやBM塗抹標本と組み合わせた細胞形態とエステラーゼ細胞化学に基づく優雅な研究は、顆粒球性白血病およびリンパ性白血病患者の染色体異常を解明するための大きな臨床的意義を確認しました10。
本明細書では、MM患者における相間FISH検出の成功を改善するための新規な方法を提供する。
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Protocol
この研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、武漢大学中南病院の倫理委員会(No. 2019065)によって承認された。検体は、武漢大学(中国)中南病院血液科のMM患者から採取した。
1. BM塗抹標本の調製
- 最初の0.2 mLのBM溶液を清潔な使い捨てスライドガラスの上に置きます。
- BMを素早く取り外して、鋭い尾でBM塗抹標本を均一な厚さに広げます。その後、自然に乾燥させます。
- BMフィルムを1mLのライト・ギムザ溶液で室温で約10秒間覆う。
- スライドに1mLのリン酸緩衝液を加える。
メモ:染料溶液が乾燥したり、スライドから流れ落ちたりしないように注意してください。 - 染料溶液を穏やかに混合し、室温で15分間維持する。
- スライドをきれいな水ですすぎ、室温で空気中で乾燥させます。
- 前方光顕微鏡を使用して悪性PCを検出します。PCは十分に分散している必要があります。
2. BM塗抹標本の魚の前処理
- ハイブリダイズした領域を固定液で10分間覆い、PCを変色させて固定します。
- 新鮮な固定液を調製するために、メタノールと氷酢酸を3:1の体積比で混合する。
- スライドを脱イオン水(dH2O)ですすぎ、室温で空気中で乾燥させます。
- 2x SSC緩衝液を含むジャーを水浴中で56°Cに予熱する。使用前にバッファーを 20 倍の SSC に希釈したままにしてください。
- 20x SSCを調製するには、176gの塩化ナトリウムと88gのクエン酸ナトリウムを800mLのdH2Oと十分に混合します。 pHを測定し、pH5.3±0.2に調整します。次に、dH2Oを追加して最終体積を1Lにします。
- 調製したBMスミアを予熱した2x SSC緩衝液で10分間洗浄し、続いて室温の脱イオン水に浸漬した。
- エタノール勾配(70%、85%、および100%エタノール、それぞれ1分間)で塗抹標本を脱水する。塗抹標本を10分間空気乾燥させる。
3. BM塗抹魚と洗濯
注:蛍光消光を防ぐために、すべてのステップは暗い部屋で行われました。
- 17番染色体(CEP17)プローブ混合物の TP53/セントロメアをハイブリダイゼーション領域に加え、カバースリップで覆う。細かいピンセットで軽く押して、下から気泡を取り除きます。
- カバースリップのすべての側面をゴムセメントでシールして、良好な気密性を確保します。
- ゴムセメントを固化させた後、スライドを自動FISHマシンの上に置きます。78°Cで5分間変性を行い、37°Cで一晩ハイブリダイゼーションを行った。
- FISHマシンからスライドを拾います。細いピンセットを使用してゴムセメントを優しく取り除きます。
- スライドを室温で2x SSCに約1〜2分間浸して、カバースリップを洗い流します。
- スライドを68°C予熱した0.4x SSC/0.3% NP-40バッファーでウォーターバスで2分間洗浄します。
- 20 mL の 20x SSC (pH 5.3) と 950 mL の dH2O を十分に混合して、0.4x SSC/0.3% NP-40 溶液を調製します。その後、NP-40を3mL加え、完全に溶解するまで十分に混合する。pHを測定し、NaOHで7.0-7.5に調整する。次に、dH2Oを加えて、全溶液の最終体積を1Lにする。
- スライドを37°Cの水浴中で2x SSCで1分間洗浄します。暗闇の中で直立させて、10分間完全に乾燥させます。
- ハイブリダイズした領域に10μLのDAPIを加え、カバースリップで覆う。
4. 魚類の分析とイメージング
- 蛍光顕微鏡上の適切なフィルターセットを用いてハイブリダイズスライドを見る。
- 単色青色蛍光色素分子光学フィルターを使用して、細胞核の蛍光強度を観察します。DAPIフィルタセットの下で細胞核画像を撮影する。
- 染色体セントロメアプローブを使用して、細胞に含まれる染色体の数を示します。CEP17に緑色の蛍光のラベルを付けます。スペクトル緑色蛍光色素分子光学フィルターを使用して、CEP17の位置を観察します。緑色のフィルタセットの下でCEP17信号画像を撮影します。
- TP53遺伝子をオレンジ色の蛍光で標識する。スペクトルオレンジ色の蛍光色素分子光学フィルターを使用してTP53を観察します。このセットの下でTP53信号画像を撮ります。
- これら3つの画像をマージし、数値的な異常がないか調べます。
注:正常な相間細胞では、2つのオレンジ色と2つの緑色のシグナルが核内で観察され、青色の蛍光が発せられ、1対の正常な染色体17を示します(図1)。
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Representative Results
新たに診断されたMM患者の初期形態学的評価では、BM塗抹標本中のPCの15%が、通常のPCよりも大量の細胞質とともに、より大きくて暗い核を有することが判明した(図2A)。イムノ表現型技術によって検出されたヘパリン抗凝固BMの最初のチューブは、モノクローナル異常PCのわずか2.3%しか明らかにしなかった。ただし、吸引BMは、それがドライタップである場合に制限されています。BM塗抹標本は、相間FISHを試験するために使用された。BMフィルムにおける代表的な二核PCを、蛍光顕微鏡ステージバーニアノギスによって局在させた(図2B)。FISHをBM塗抹標本に塗布し、TP53およびCEP17について 試験した。FISHの結果は、1つの相間PC核に4つのオレンジ色と4つの緑色のシグナルを示し(図2C)、第17染色体の4つのコピーが中期PC核に局在していたことを示唆している。核タイピング結果は、培養時間を3日まで延長し、さらにFISH分析ソフトウェアを用いて分析することによって得られた(図2D)。BM塗抹標本に対する相間FISH結果の精度がさらに検証された。
図1:相間細胞(1000x)用の TP53/CEP17 FISHプローブの正常シグナル 細胞核の蛍光強度は青色、 TP53 はオレンジ色、CEP17は緑色であった。これら3つの正常な間期細胞では、2つのオレンジ色と2つの緑色のシグナルの両方が青色蛍光を発する核の内部に現れ、正常な染色体17の2対を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:多発性骨髄腫(MM)患者における骨髄(BM)の形態および遺伝子画像。 (a)BM塗抹標本(1000×)のライト・ギムザ染色後の矢印(
)で示すクラスター分布を有する骨髄腫細胞。(b)矢印()で示す二核形質細胞様細胞を蛍光顕微鏡(
1000×)上の白黒カメラで撮影したグレースケール画像上に掲載する。(c)TP53/セントロメアの17番染色体(CEP17)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)プローブ試験用BM塗抹標本。FISHは、各核(→)で4つのTP53シグナルと4つのCEP17シグナルを明らかにします(1000×)。(d)異常染色体核像は、1つの核における2対の17番染色体を示す(
)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
MMにおける遺伝的リスク層別化へのFISHの適用は不可欠である。FISHレポートの重要な部分は、すべての有核細胞ではなく、抗CD138磁気ビーズで選別するか、細胞質免疫グロブリン軽鎖κまたはλでマーキングすることによって特異的に精製または同定されたクローンPCです。PCソーティングまたはcIg-FISH後の相間FISHは、BM中のPCの割合が比較的低いため、MMの診断において有意であることが判明した。しかし、これらの方法には、複雑なプロセス、高い試料要求、高い実験コストなど、いくつかの欠点があります。50台のPCは、顕微鏡ステージのバーニアノギスですばやく見つけることができます。BM塗抹標本は、抗凝固BMを得るために核を得るために複雑な手順を必要とするため、抗凝固剤BM検体よりもはるかに入手が容易である。そこで、MM細胞の検出のためのBM塗抹標本FISHの説得力のある方法を確立した。
まず、BM塗抹標本は、経験豊富な形態学的分析者によってなされるべきである。BMを塗抹標本に広げるために、スプレッダーを吸引液の前面に30°〜45°の角度で配置し、流体11と接触させるために引き戻します。そして、スプレッダーは、定常的な動きで均一に前方に移動される。BM塗抹標本の密度は、長さがスライドの約4分の3になるように調整する必要があります12。BMフィルムは、すべてのエッジの細胞を確実に検出できるように、スライドよりも狭くする必要があります13。ハイブリダイゼーション領域の選択とPCの局在化は、我々のプロトコルにおいて重要であり、これには経験豊富な形態学的アナリストが必要である。PCの数が少ないBM塗抹標本の場合、前方蛍光顕微鏡油浸対物レンズと対物レンズステージ上のバーニアノギスを使用してPCを局在化させ、その画像をモノクロショットで撮影することができます。例えば、形態学的検査によってBM膜中の有核細胞全体のわずか3%しかPCが占めていない場合、8mm x 8mmのよく分散したハイブリッド領域には、FISH試験用に50台以上のPCが含まれるべきである。FISHハイブリダイゼーションの後、少なくとも50台のPCにおける蛍光シグナルは、経験豊富なアナリストによってカウントされなければならない14。
しかし、この技術の限界は、新鮮なBM塗抹標本の要件である。BMスミアが2年以上保存されている場合、結果として得られるFISH画像は不明瞭になり、誤解が生じる可能性があります。
まとめると、上記のBM塗抹標本FISHは、有核細胞が少ない低増殖性疾患においても、BM抽出が困難な場合やBMドライタップが発生した場合に、血液学的悪性腫瘍を有する患者に広く使用することができる。血液悪性腫瘍のより多くの患者がこの方法の恩恵を受けることができることを願っています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、WNLO 2018WNLOKF023のイノベーション基金の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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