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Neuroscience

生体内 ラットの脳深部刺激による活動パターンを明らかにする陽電子放出断層撮影法

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63478
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1,2,3,4, 2,4,5
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

Summary

in vivo FDG-PETによる急性脳深部刺激療法により誘導される代謝性神経調節を評価するための前臨床実験法について述べる。この原稿には、定位固定装置手術から刺激治療の適用、PET画像の取得、処理、分析まで、すべての実験ステップが含まれています。

Abstract

脳深部刺激療法(DBS)は、患者の病態生理に関与する脳構造への電気パルスの適用に基づく侵襲的な脳神経外科技術です。DBSの長い歴史にもかかわらず、その作用機序と適切なプロトコルは依然として不明であり、これらの謎を解くことを目的とした研究の必要性が浮き彫りになっています。この意味で、機能イメージング技術を使用してDBSの in vivo 効果を評価することは、脳のダイナミクスに対する刺激の影響を決定するための強力な戦略を表しています。ここでは、前臨床モデル(Wistarラット)の実験プロトコルを、縦断的研究[18F]−フルオロデオキシクルコース陽電子放出断層撮影法(FDG-PET)と組み合わせて、脳代謝に対するDBSの急性結果を評価することが記載されている。まず、動物は前頭前野への電極の両側移植のための定位手術を受けた。電極の配置を確認するために、各動物の術後のコンピューター断層撮影(CT)スキャンを取得しました。回復の1週間後、刺激なしで操作された各動物の第1の静的FDG−PETを獲得し(D1)、そして2日後(D2)、動物が刺激されている間に第2のFDG−PETを獲得した。そのために、電極を、FDGを動物に投与した後に単離された刺激装置に接続した。したがって、FDG取り込み期間(45分)の間に動物を刺激し、脳代謝に対するDBSの急性効果を記録した。この研究の探索的性質を考慮して、FDG-PET画像は、D1研究とD2研究の間の対応のあるT検定に基づくボクセル単位のアプローチによって分析されました。全体として、DBSとイメージング研究の組み合わせにより、ニューラルネットワークに対する神経調節の結果を記述することができ、最終的にはDBSを取り巻く難問を解明するのに役立ちます。

Introduction

神経刺激という用語は、治療目的1で神経系を刺激することを目的とした多くの異なる技術を包含する。その中で、脳深部刺激療法(DBS)は、臨床診療で最も普及している神経刺激戦略の1つとして際立っています。DBSは、定位手術によって調節される脳標的に配置された電極を介して、神経刺激装置によって送達される電気パルスによる脳深部核の刺激で構成され、患者の体内に直接埋め込まれます。さまざまな神経疾患および精神疾患におけるDBSの適用可能性を評価する論文の数は継続的に増加していますが2、食品医薬品協会(FDA)によって承認された論文はそのうちのいくつかのみです(すなわち、本態性振戦、パーキンソン病、ジストニア、強迫性障害、および医学的に難治性てんかん)3.さらに、公式に承認されたよりもはるかに多くの病状のDBS治療のために、多数の脳標的と刺激プロトコルが研究されていますが、それらのどれも決定的とは見なされていません。DBSの研究と臨床手順におけるこれらの不一致は、その作用機序の完全な理解の欠如に一部起因している可能性があります4。したがって、脳のダイナミクスに対するDBSの in vivo 効果を解読するために多大な努力が払われており、進歩するたびに、たとえ小さくても、より大きな治療の成功のためにDBSプロトコルを改良するのに役立ちます。

これに関連して、分子イメージング技術は、DBSの in vivo 神経調節効果を観察するための直接的な窓を開きます。これらのアプローチは、DBSの適用中にDBSの影響を判断するだけでなく、その結果の性質を解明し、望ましくない副作用や臨床的改善を防ぎ、さらには刺激パラメータを患者のニーズに適応させる機会を提供します5。これらの方法の中で、2−デオキシ−2−[18F]フルオロ−D−グルコース(FDG)を用いた陽電子放出断層撮影(PET)は、異なる脳領域の活性化状態に関する特異的かつリアルタイムの情報を提供するため、特に興味深い6。具体的には、FDG-PETイメージングは、ニューロンとグリア細胞との間の代謝結合の生理学的原理に基づく神経活性化の間接的な評価を提供する6。この意味で、いくつかの臨床研究では、FDG-PETを使用したDBS変調脳活動パターンが報告されています(レビューについては3 を参照)。それにもかかわらず、臨床研究は、異質性や募集の難しさなど、患者に焦点を当てるといくつかの欠点を簡単に被り、研究の可能性を強く制限します6。この文脈により、研究者は人間の状態の動物モデルを使用して、臨床翻訳の前に生物医学的アプローチを評価したり、臨床診療にすでに適用されている場合は、治療上の利点または副作用の生理学的起源を説明したりします。したがって、人間の病理と実験動物のモデル化された状態との間に大きな距離があるにもかかわらず、これらの前臨床アプローチは、臨床診療への安全で効果的な移行に不可欠です。

この原稿では、脳代謝に対するDBSの急性の影響を評価するために、マウスモデルの実験的DBSプロトコルと縦断的なFDG-PET研究を組み合わせて説明しています。このプロトコルで得られた結果は、DBSによって脳活動に誘発される複雑な調節パターンを解明するのに役立つ可能性があります。したがって、刺激の結果を調べるための適切な実験戦略が提供され、臨床医は特定の状況下での治療効果を予測し、刺激パラメータを患者のニーズに適応させることができます。

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Protocol

実験動物の手順は、欧州共同体理事会指令2010/63 / EUに従って実施され、グレゴリオマラニョン病院の動物実験倫理委員会によって承認されました。実験プロトコルのグラフ要約を 図1Aに示す。

1. in vivoニューロイメージングによる脳標的局在

  1. 動物の準備
    注:~300 gの雄のWistarラットを使用しました。.
    1. 動物を麻酔誘導ボックスに入れ、上部を密封します。
    2. セボフルラン気化器の電源を入れます(100%O2の誘導には5%)。ラットが麻酔をかけられたら、ガスの流れをノーズコーンに切り替えます。ラットの足をつまんで麻酔の状態を確認します。
    3. 動物をCTベッドに仰臥位で置き、セボフルラン麻酔を維持する(100%O2での維持のために3%)。
  2. CTイメージング
    注意: アンペア数、電圧、投影数、ショット数、およびボクセル解像度の選択は、CTスキャナーによって異なります。ここでは、以下のパラメータ:340mA、40KV、360投影、8ショット、および200μm分解能を使用した7、8、9。
    1. フェイスマスクまたはノーズコーンをラットに固定します。
    2. ラットの体をシルクテープで頭、肩、腰、尾で固定し、損傷することなく十分な拘束を提供します。
    3. ラットを継続的に監視します。
    4. CTスキャナーの視野の中央にヘッドを配置します。
    5. スキャナーの仕様に応じた取得パラメータを使用してCT画像の取得に進みます。
    6. 10分後、 in vivo CTスキャンが完了したら、セボフルランの流れを停止し、ラットをMRIスキャナーに入れます。
  3. MRイメージング
    注:スキャン取得の仕様は、さまざまなソフトウェアシステムや、さらに重要なことに、特定の研究課題など、スキャナーによって異なります。ここでは、7テスラスキャナーを使用しました。TE = 33 ms、TR = 3732 ms、スライス厚さ0.8 mm(34スライス)、マトリックスサイズ256 x 256ピクセル、FOV3.5 x 3.5 cm2のT2強調スピンエコーシーケンス7,8,9を使用しました。
    1. 動物をMRIベッドに仰臥位で置き、セボフルラン麻酔を維持する(100%O2での維持のために3%)。
    2. MRI取得中の頭の動きを避けるために、スキャナーベッドに配置された定位フレームに頭を固定します。また、ラットの体の残りの部分をシルクテープで固定します。
    3. MRIスキャナーの視野の中央にヘッドを配置します。
    4. 位置が正しいら、MRI画像の取得に進みます。
    5. in vivoMRIスキャンが完了したら、セボフルランの流れを停止し、ラットをケージに入れます。
    6. ラットは通常、スキャン中に体温を下げるため、ケージの近くに加熱ランプを配置します。
    7. 麻酔から回復するまでラットを監視します。
  4. アトラスの共局在化とターゲット座標の計算
    1. CTおよびMRI画像を取得してスキャナーの推奨に従って再構築したら、CTおよびMRI画像を共同登録します。
    2. 画像処理ソフトウェアを用いて、相互情報に基づく自動剛体登録アルゴリズムを用いてCTとMRIを空間的に正規化する10。
    3. PaxinosとWatsonラットの脳アトラス11によると、共同登録された画像のブレグマ線を局在化し、ブレグマからターゲット(つまり、内側前頭前野、mPFC)までの前/後(AP:+3.5 mm)、正中線/外側(ML:+0.6 mm)、および背腹側(DV:-3.4 mm)軸の距離を測定します。
      注:体重、サイズ、性別、および品種が異なる場合、ブレグマからターゲットまでの座標はラット間で異なる場合があります。

2.定位固定手術

注意: 使用前にすべての手術材料、インプラント、および定位固定装置をオートクレーブし、動物の福祉に影響を与える可能性のある感染症や合併症を避けるために手術領域を消毒してください。滅菌手術用手袋を使用し、汚染を防ぐために粘着性のあるドレープで動物を覆います。

  1. 動物の準備と麻酔
    1. 動物は手術の前日に腹腔内に0.1 mg / kgのブプレノルフィンを投与されました。動物を麻酔誘導ボックスチャンバーに入れ、上部を密封します。
    2. セボフルラン気化器の電源を入れます(100%O2の誘導には5%)。
    3. ラットが横臥したら、セボフルラン気化器をオフにし、ラットをボックスチャンバーから取り出します。
    4. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物を腹腔内投与して動物を麻酔します。.
    5. 動物が完全に麻酔されるまで待ちます。指間領域をつまんで麻酔のレベルを確認します。
    6. 耳と目の間の領域を剃ります。
  2. 定位フレームへの配置と開頭術
    1. 動物を定位フレームの腹臥位に置き、ラット用のヘッド保持アダプターを使用して、手術中に動物を正しい位置に維持します。
    2. ラットのイヤーバーを使用して頭が動かないようにします。挿入が深すぎると鼓膜が損傷する可能性があるため、イヤーバーの挿入には注意してください。
    3. 眼科用潤滑ジェルを目に塗り、手術中の乾燥を防ぎ、滅菌ガーゼで覆います。
    4. 汚染を防ぐために粘着性のあるドレープを使用して動物を覆います。
    5. ヨードポビドン溶液を剃毛部分に塗り、滅菌ガーゼできれいにします。
    6. 剃毛した部分にゲルのメピバカインを塗布して、局所的な部分を麻酔します。
    7. 耳の間の頭蓋骨を覆う皮膚を縦切開し、ラムダからブレグマまで(すなわち、頭蓋頂点から目に向かって)1.5〜2 cm延長します。
    8. 2つまたは3つのクランプの助けを借りて頭蓋骨を露出させます。綿棒で骨膜を取り除き、生理食塩水で血液をきれいにして、ブレグマと矢状縫合糸を露出させます。余分な食塩水をガーゼで取り除きます。
    9. 頭蓋骨の表面をメスで引っ掻いて、歯科用セメントの接着を改善します。過酸化水素に浸した綿棒でその領域をきれいにします。
  3. 電極の配置と頭蓋骨への固定
    1. プラスチック製のピンセットで電極をまっすぐにして、手術中に正しく配置されるようにします。
      注:このプロトコルでは、アース付きの同心バイポーラ白金-イリジウム電極が使用されます。
    2. 定位フレームの右腕のホルダーに1つの電極を配置します。
      メモ: ホルダーを電極に合わせるには、電極をより適切に固定する必要がある場合があります( 図1Bを参照)。電極がホルダーの軸と平行であることを確認してください。
    3. 電極を保持している右腕を脳定位固定装置フレームに通し、電極の先端をブレグマの上に正確に置きます。電極の変形を避けるために、電極の先端を頭蓋骨にできるだけ近づけるようにしてくださいが、触れず、脳定位固定装置フレームによって提供されるBregmaの結果の座標に注意してください。外科用ペンで電極の初期位置を示すマークを頭蓋骨に付けます。
    4. 手順1.4.3で取得したAP座標とML座標にホルダーを移動し、電極ターゲットの位置を示す外科用ペンで頭蓋骨にマークを付けます。
    5. 電極を保持している定位フレームの右腕を取り外します。電極に触れないように注意してください。
    6. 小さな電動ドリルを使用して、硬膜が見えるまで、ターゲット位置の頭蓋骨(直径約1〜1.5 mm)に穴を開けます。綿棒を使用して出血を止めます。
    7. 頭蓋骨に沿って4つの穴を開けて4本のネジ(できれば長さ2〜3 mmのステンレス鋼ネジ)を配置し、歯科用セメントの表面積を増やし、地面を見つけます。4本のネジを取り付けます。
    8. 右電極で定位フレームの右腕を見つけます。アームを計算された位置に移動し、穴と一致するはずです。次に、硬膜に触れるまで電極を下げます。この位置は、DV方向の0レベルとして機能します。
    9. 手順1.4.3のDV位置を使用して、電極の先端をDV方向に挿入します。綿棒で電極の領域の周りの血液と脳脊髄液をきれいにします。
    10. 電極に最も近いネジの1つにアースを取り付けます。
    11. 動物を傷つける可能性のある鋭いエッジを避けて歯科用セメントを形作るように注意しながら、電極とネジの周りに歯科用セメントを塗布します。歯科用セメントは、組織/頭蓋骨への過熱/熱損傷を防ぐために層状に塗布されます。厚い層は、追加の層が追加される前に硬化するのにより多くの時間を必要とします。ホルダーから電極を取り外す前に、歯科用セメントが完全に硬化していることを確認してください。
      注意: 歯科用セメントの調製は、混合物から有毒な蒸気を放出し、セメントの固化で終了します。したがって、この時点から手術が終了するまで、化学ガスに対して有効な保護マスクを着用してください。
    12. 脳の他の半球に対して、手順2.3.2〜2.3.11から同じ手順を繰り返します。
    13. 電極を覆わずにキャップを形成するために、より多くの歯科用セメントを塗布します。固まるまで待ちます。
    14. 三角針で編組天然シルク非吸収性縫合糸1/0を使用して、キャップの前後に縫合します。必要に応じて、非吸収性縫合糸が配置されている身体領域に応じて、特定の時間に非吸収性縫合糸を取り外します。ヨードポビドン溶液を使用して手術領域を消毒します。
    15. 定位フレームからラットを取り外します。
  4. 電極配置確認のためのCT撮影
    1. 手順 1.2.4-1.2.5 を実行し、 図 1C を参照してください。
    2. in vivo CTスキャンが完了したら、ラットをケージに入れます。
    3. 手順 1.3.6 に従います。および1.3.7。
  5. 術後ケア
    1. 術後ケアとして、抗生物質(セフトリアキソン、100 mg / kg、皮下)を5日間、鎮痛薬(ブプレノルフィン、0.1 mg / kg、腹腔内)を3日間投与します。この抗生物質レジメンは、キャップの周りに感染の兆候(発赤、腫れ、滲出液)が観察された場合、5日間延長できます。.
    2. 各動物の目視検査を毎日行い、痛みや苦痛の兆候を探し、ヨードポビドン溶液でキャップを清掃します。
    3. 手術後最大1週間集中治療を提供します。

3. PET / CTイメージング取得

注:各動物は、電気刺激によって誘発される急性の影響を評価するために、吸入麻酔下で2つのPET / CT研究(すなわち、不在下およびDBS投与中)を受けます。両方のスキャンセッションは同じ画像取得プロトコルに従い、手術の1週間後(D1、刺激なし)と2日後(D2、DBS中)に実行されます。

  1. 動物の準備と麻酔
    1. 各PETスキャンの前にラットを8〜12時間絶食させて、FDGのより高い脳の取り込みを可能にし、信号対雑音比を改善します12。
    2. 動物を麻酔誘導ボックスに入れ、上部を密封します。
    3. セボフルラン気化器の電源を入れます(100%O2の誘導には5%)。
    4. ラットに麻酔をかけたら、ガスフラックスをノーズコーンに切り替えます。
  2. FDG注入および摂取期間
    注意:FDGは放射性トレーサーであるため、放射能被ばくを避けるために放射線防護対策を検討してください。機関が放射性化合物を扱うためのすべての許可を持っていることを確認してください。
    1. 望ましくない放射能曝露を避けるために、使用するまでFDGバイアルを鉛で裏打ちされたキャビネット内に保管してください。
    2. 小型ゲージシリンジ(~27G)に、活性計で測定したできるだけ少ない量の~37 MBqのFDG溶液を充填します。
    3. 動物の尾の下に加熱パッドを置くか、赤外線を使用して尾静脈を拡張します。
    4. 尾のピークに側静脈が明らかになったら、衛生用アルコール(96%)でその領域をきれいにします。
    5. FDG溶液を外側尾静脈の1つから注入し、その軌道に平行な注射器で、針の斜角を上に向けて静脈に近づきます。
    6. 麻酔をオフにし、動物をケージに戻し、加熱ランプの下で完全に回復します。
    7. 画像取得セッションを開始する前に、45分間の放射性トレーサーの取り込みを許可します。この間、動物を目覚めさせ、鉛で保護されたチャンバー内に保管してください。
    8. D2試験の場合、FDG摂取期間中にセクション4(電気刺激投与)で後述するようにDBSを送達する。
  3. PET取得と画像再構成
    注意: PET画像取得の仕様は、スキャナーとスキャン時間によって異なります。このプロトコルでは、400〜700 keV 7,8,9のエネルギーウィンドウを使用して、小動物PET / CTスキャナーで静的PET画像を45分間取得しました。取得プロトコルを設計する前に、PET/CT機器の仕様を確認してください。
    1. FDG注射の45分後、動物を麻酔誘導ボックスに入れ、上部を密封します。
    2. セボフルラン気化器の電源を入れます(100%O2の誘導には5%)。
    3. 動物をPET / CTベッドに移し、仰臥位に置き、鼻を麻酔鼻コーンに固定し、セボフルラン麻酔を維持します(100%O2での維持のために3%)。ラットの足をつまんで麻酔の状態を確認します。
    4. 手順 1.2.2 と 1.2.3 を繰り返します。
    5. PETスキャナーの視野の中央にヘッドを配置します。
    6. スキャナーの仕様に従って取得パラメータを使用して静的PET画像を取得します。
    7. 2D-OSEM(順序サブセット期待値最大化アルゴリズム)を使用して画像を再構築し、減衰とデッドタイムの補正7,8,9を適用します。
    8. in vivo PETスキャンが完了したら、ラットへのセボフルランの流れを維持し、その後、スキャナーベッド上の動物の頭の位置を移動させることなくCT取得に進みます。
  4. CT取得
    1. 前回のPET取得に対する動物の位置を変更せずに、CT画像の取得に進む。
    2. 手順 1.2.3-1.2.5 を繰り返します。
    3. in vivo CTスキャンが完了したら、セボフルランの流れを停止し、ラットをそれぞれのケージに入れて回復させます。
    4. 手順 1.3.6 に従います。および1.3.7。
    5. 放射能が完全に崩壊するまで、動物を鉛シールドチャンバーに維持します。

4.電気刺激投与

注意: 電気刺激は、D2イメージングセッションのFDG取り込み期間中に配信されます。このプロトコルでは、刺激は、定電流モード、150μA、および100μsのパルス幅での高周波(130Hz)電気刺激を備えた絶縁刺激器で配信されました7,13,14。

  1. DBSスティミュレータの構成
    1. 隔離された刺激装置と必要なワイヤーを、動物のケージに十分なスペースを確保し、潜在的に邪魔な刺激の影響を最小限に抑えた、広くて静かな部屋で準備します。
    2. 刺激ワイヤーをスイベルに接続して、動物がケージ内や刺激装置内を自由に移動できるようにします。
    3. 研究のニーズに応じて刺激パラメータを設定します。
    4. オシロスコープを使用して、電流モード、周波数、パルス幅を確認します。二相性波形を矩形パルス形状で確認します(図1D)。
  2. DBS 配信
    1. D1イメージングセッションの後、D2取得まで、動物を毎日の慣れプロトコル(45分/日)にさらして、刺激システムとオペレーターの取り扱いに慣れさせ、D2の望ましくないストレス反応を回避します。刺激システムを各動物に接続しますが、刺激をオンにしないでください。
    2. 刺激装置を設置し、動物にFDGを注射したら、スイベルを電極に接続し、刺激装置をオンにします。
    3. 45分後、刺激装置の電源を切り、動物をスイベルから外し、すぐに麻酔導入室に移してステップ3.3を開始します。

Figure 1
図1:実験計画 。 (A)このプロトコルで従った実験ステップの要約。(B)電極のより良い固定のためのホルダーの適応の代表的な写真、電極あり(左)と電極なし(右)。(C)手術を受けた動物のCTとMRIの融合画像で、内側前頭前野(mPFC)における正しい電極配置を示す。(D)二相性刺激波形を示すオシロスコープ画面のスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. PET画像処理と解析

注: D1 と D2 の画像に対して同じ画像処理に従って、後続のボクセル単位の統計分析のために比較可能なデータを取得します。

  1. PET画像の空間登録
    1. 専用の画像処理ソフトウェアを使用してください。登録ワークフロー全体を 図 2 に示します。
    2. 各PETおよびCT画像を視野に合わせて中央に配置してトリミングします。相互情報量15に基づく自動剛体レジストレーションアルゴリズムを用いてPET画像をそのCTに登録する。
      注:厳格な登録方法は、動物間で体重やサイズに有意差がない場合にのみ適切です。それ以外の場合は、エラスティックメソッドの使用を検討してください。
    3. ステップ5.1・2と同様にパキシノス・アンド・ワトソン・ラット脳アトラス11 に空間的に登録された基準CTに各CT画像を登録する。結果の変換パラメーターを保存します。
    4. 手順 5.1.3 で取得した変換パラメーターを適用します。登録された各PET画像に、基準CT画像に登録されているPET画像を取得する。
    5. すべての最終的なPET画像をNifti形式で保存します。
  2. PET画像の強度正規化と平滑化
    注: 強度の正規化と平滑化は、公開されているリソースに基づいて、さまざまな社内スクリプトを使用して実行されます。
    1. 2mmの全幅半値(FWHM)の等方性ガウスカーネルでPET画像を滑らかにし、起こりうるレジストレーションエラーを修正します。
      注:スムージングフィルターのサイズはPET取得の解像度によって異なりますが、FWHMのボクセルサイズの2〜3倍のフィルターを使用することをお勧めします。
    2. 適切な参照クラスター正規化法16を使用してPETボクセル値の強度を正規化する。
    3. 参照CT画像に登録されている参照MRIから脳マスクをセグメント化します。
    4. 各PET画像にブレインマスクを適用して、ボクセルごとの分析から脳外のボクセルを除外します。
  3. ボクセル単位の分析
    注:PET画像データのボクセル単位の分析からなる統計分析は、専用の画像分析ソフトウェア17を使用して実行されました。
    1. 対応のあるT検定を使用してD1とD2のPET画像を比較し、適切な統計的有意閾値を設定します。
    2. 解析の決定的な結果として、タイプ I エラーを減らすために、隣接するボクセルが 50 を超えるクラスターのみを検討してください。
    3. 結果をT2 MRIに重ね合わせたTマップで表し、DBSによって誘発されるグルコース脳代謝の変化を示します(FDG減少のための寒色とFDG増加のための暖色)。

Figure 2
図2:マイクロPET / CTイメージング登録ワークフロー。 統計的パラメトリックマッピング(SPM)ソフトウェアを使用した後続のボクセル単位の分析のためのPET画像空間正規化処理の詳細な手順。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Representative Results

動物は、研究の終了時または動物の福祉が損なわれたときにCO2を使用して犠牲にされた。手術動物からの完全なPET / CT研究の例を 図3に示します。これにより、ラット脳に挿入された電極は、 図3Aに示すCT画像で明瞭に観察することができる。このイメージングモダリティは、機能モダリティが構造画像よりもぼやける傾向があることを考えると、優れた解剖学的情報を提供し、FDG-PET画像の登録を容易にします(図3A、B)。また、同じ動物のFDG-PET画像とCT画像の合成画像を 図3Cに示す。

Figure 3
図3:mPFCにDBS電極を埋め込んだラット脳のマイクロPET / CTイメージング。 (A)CT画像の矢状切片。(B)Aと同じ動物のFDG-PET画像の矢状断面(C)AとBの画像を同じ定位装置空間に空間的に登録して得られた融合PET/CT画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

SPM12ソフトウェアで実行され、例としてここで提供されるボクセル単位の分析は、D1(DBSの不在)とD2(FDG取り込み中のDBS)研究の間の対応のあるT検定で構成されていました。したがって、 図4 は、参照CT画像(CTref)に登録されているMRIから連続した厚さ1mmの脳スライスに重ね合わせたTマップとして、両方のPETセッション間の脳代謝の違いを示しています。これらの差はFDG取り込みの増減であり、それぞれ暖色と寒色として示された。また、分析から得られた統計結果の詳細な要約を 表1に示す。ここでは、変調された脳領域、変調が観察される脳半球、T統計量、ボクセル数(k)のクラスターのサイズ、変調の方向(すなわち、代謝過剰または低代謝変化)、およびピークレベルとクラスターレベルで得られたp値を示します。このタイプのテーブルは、スライスオーバーレイ図で観察された変調変化の詳細な説明として機能します。

Figure 4
図4: 対応のあるT検定の結果。 同じCTrefに登録されたT2 MRIにオーバーレイされたボクセル単位の分析から得られたTマップは、急性DBSプロトコルによって誘発される代謝変化を示しています(D2対D1)。画像の下部にあるカラーバーは、FDG取り込みの局所的な増加(暖色)と減少(寒色)に対応するT値を表しています(p < 0.005; k > 50ボクセル)。略称:AHiPM / AL - 扁桃体海馬領域後方/前外側部分、Au-聴覚皮質、Bstm-脳幹、CPU - 尾状被殻、HTh - 視床下部、L - 左半球、PMCo - 後皮質扁桃体核、R - 右半球、S1 - 一次体性感覚皮質。この図は、Casquero-Veiga et al.8の許可を得て修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

D1対D2:刺激効果
投資 収益 率 横 T k ↓/↑ P UNC.ピークレベル ティッカー ティッカー
ピークレベル クラスター レベル
ティッカー R&L 18.39 1549 ↓ <0.001 0.432 <0.001
AHiPM/AL-PMCo - HTh L 10.39 ↓ <0.001 0.949
ティッカー L 37.56 738 ↑ <0.001 0.025 <0.001
S1-AU 10.53 ↑ <0.001 0.947
CPu-Pir R 17.74 695 ↑ <0.001 0.497 <0.001
S1-AU 10.45 ↑ <0.001 0.948

表1:mPFCにおける急性DBS後の脳代謝の変化。 D1対D2:刺激効果。構造:AHiPM/AL:扁桃体海馬領域後方/前外側部分、Au:聴覚皮質、Bstm:脳幹、CPu:尾状被殻、HTh:視床下部、Pir:梨状皮質、PMCo:後方皮質扁桃体核、S1:一次体性感覚皮質。ROI: 関心領域。側面:右(R)と左(L)。T: t 値、k: クラスター サイズ。グルコース代謝:増加(↑)と減少(↓)。p:p値、unc:未補正、FWE:ファミリーワイズエラー訂正。この表は、Casquero-Veiga et al.8の許可を得て変更されています。

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Discussion

精神神経疾患の病態生理に関わる脳機能や神経回路網の理解が進むにつれ、神経学的に幅広い病態におけるDBSの可能性を認識する研究が増えています2。しかし、この治療法の作用機序は不明のままです。いくつかの理論は、特定の病理学的および刺激的状況で得られた効果を説明しようとしましたが、提案された研究の異質性により、決定的な結論に達することは非常に困難です4。したがって、多大な努力にもかかわらず、本当のコンセンサスはありませんが、DBS介入を受けている患者の数は18増え続けています。次に、in vivoでの脳内のDBSの結果を理解することで、どの刺激パラメータと刺激のプロトコルが各患者のニーズにより適しているかを解明できるため、より良い成功率を得ることができます。これに関連して、FDG-PETなどの非侵襲的な機能的神経画像モダリティは、脳内の電気刺激の直接的な影響下で実際に何が起こっているのかを明らかにするために不可欠です。例えば、ここで説明する縦断プロトコルでは、DBSはD2 PET画像の放射性トレーサー取り込み期間中に送達される。したがって、D2(DBS-ON)およびD1(DBS-OFF)PET研究の比較は、FDGの「代謝トラップ」特性が刺激中に直接起こる累積変化を記録することを可能にするので、インビボでの電気刺激によって調節されている脳領域の視覚化を可能にする13,19。

全体として、このプロトコルは、in vivoの脳におけるDBSの急性の結果を評価するための実行可能な戦略を記述しているが、利用可能なDBSパラメータの組み合わせおよびプロトコルの多様性は計り知れない(例えば、連続治療対断続的治療20、高周波刺激対低周波刺激21)、およびDBSの効果でさえ、刺激の影響下での脳ネットワークの直接的な変化を推測するため、治療とともに異なる可能性がある22.さらに、DBSが推奨される病状の数が増えることを考えると、可能性の数はさらに多くなります23。したがって、DBS治療に対する潜在的な応答を予測することを可能にする神経活性化パターンを明らかにすることを目的とした縦断的神経画像研究は、特に臨床的関連性がある24,25。これに関して、FDG-PETによる異なるDBSプロトコルの治療効果を評価した多数の臨床および前臨床試験がある(レビューについては3を参照)。したがって、研究されたDBSプロトコルが治療中の病状に関連する脳代謝パターンを打ち消し、患者の症状の改善を誘発し、DBS-PETアプローチの臨床的有用性を証明するいくつかの例があります。この一例は、治療抵抗性うつ病の患者に対する脳梁帯状疱疹下領域(SCC)の刺激に見られる。SCCは、うつ病の非薬物患者では代謝的に活動亢進しており26、この過活性化は、薬理学的、精神療法的、またはDBS治療によるうつ病の寛解後に正常化されます27、28、29。重要なのは、SCC代謝は、刺激を開始する前にDBSに反応した患者では、非応答者と比較して高かった。この研究は、SCC-DBS29に対する反応の予測において80%の精度を示し、DBSの潜在的な患者を選択する際のイメージングバイオマーカーの重要性を強調しています。したがって、説明されたコンテキストは、うつ病の脳代謝パターンをSCC-DBSで得られた治療結果とマッピングすることを目的としたFDG-PET研究の臨床的成功の歴史を反映しており、これは、他の神経精神障害およびDBSプロトコルに焦点を当てた同様のアプローチの基礎を設定するはずです。

この意味で、FDG-PETを用いてDBSの生理学的効果を観察するためには、スキャンされるDBSプロトコルの特定のタイミングを慎重に検討することが特に重要である。したがって、同じDBSパラメータおよび同じプロトコルを適用しているにもかかわらず、画像取得のタイミングは、観測された変調の起源を明確に決定し、これは、得られる最終応答に関与するすべての要因を考慮しないことによって潜在的な誤解を招く可能性がある8。したがって、手術の計画はその後の治療の基礎を築く上で決定要因ですが、研究中の刺激の結果に適した画像取得プロトコルの設計は、適用される刺激治療の根底にある分子メカニズムを完全に理解するために不可欠です。これらの方針に沿って、いくつかの要因が特定のDBSプロトコルに対する応答を大幅に変更する可能性があります(たとえば、刺激パラメータ、電極挿入、標的とする脳構造、治療中の病理、DBSセッションの期間、頻度など)。7,8,30。FDG-PET研究で収集されたデータに反映される現象は、画像が取得される治療過程の特定の時間に依存する。次に、これらすべてのポイントは、DBS誘発調節を調査し、この治療法の根底にあるメカニズムの説明に貢献するためのさまざまな研究機会を開きます。

したがって、げっ歯類と人間の脳を分離する大きな違いにもかかわらず、翻訳プロトコルを開発することを目的として、すべてのレベルで適切な実践を実施する必要があります。この意味で、DBSは、電極が脳深部構造にアクセスできるように開頭術に基づく高侵襲手術を必要とすることを無視してはなりません31。この時点で、感染および炎症反応の2つの重要な原因がある:一方では、手術中の脳組織の直接暴露、他方では、2つの外因性要素を内臓に挿入し、刺激標的32に向かうそれらの軌跡によって挿入瘢痕を作り出す。したがって、手術器具の滅菌、清潔な手術領域の維持、および抗生物質および鎮痛治療に基づく適切な術後ケア33 は、対象が介入から最も健康な状態で最大の利益を得ることを確実にするために不可欠である。さらに、炎症性および感染性のプロセスが代謝亢進シグナルとして明確に見られることを考えると、術後合併症の発生は放射性トレーサーの取り込みのパターンを変更する可能性があるため、これはFDG-PETイメージング研究において特に関連性があり34、治療に対する応答の変化またはDBSによって生じる調節の過大評価につながる可能性がある。

ただし、この実験方法論にはいくつかの制限があります:まず、DBSプロトコルは通常、長期、継続的、および慢性的な治療です。ここでは、DBSの急性効果をリアルタイムで評価するためのニューロイメージングプロトコルが示されている。したがって、神経画像研究で提案されたタイミングは、DBS誘発長期変調に関する情報をほぼリアルタイムで得るには不十分です。それにもかかわらず、DBSから得られた応答を理解するための基本的な知識として役立つさまざまな縦断的アプローチを開発するための基礎を築く可能性があります。第二に、健康な動物がこの方法を説明するために使用されているので、説明された技術を異なる病理学的状態に適用するには、より良い結果と最適な福祉条件を確実にするためにそれらの適応が必要になるかもしれません。最後に、ボクセル単位の分析では、複数の統計的比較の問題を常に受けるため、信頼性の高い結果を得るには、大きなサンプルサイズや強力な補正係数が必要です。それにもかかわらず、ボクセルワイズアプローチによるFDG-PETを使用した脳代謝に対するDBSの結果の評価は、この方法の本質的な探索的性質のために大きな利点であり、事前の仮定を必要とせずに広範な全脳分析を可能にします。

DBSとFDG-PETを組み合わせることの欠点は説明されていますが、これらのアプローチは大きな機会を提供します。したがって、脳代謝情報を非侵襲的に取得することは、刺激中およびDBS治療と共に多くの異なる機会に対象から神経生理学的データを収集することができるという意味で大きな利点である。さらに、FDG-PETは臨床現場でのニューロイメージング技術であり、この方法を動機付けるトランスレーショナルアプローチを強化します。同様に、FDG−PETの使用は、他の画像化モダリティとは異なり、得られる信号が、画質およびシステム性能の両方を損なう可能性のある神経刺激系に由来する電界または磁界の二次歪みの影響を受けないため、特に適切な代替手段である24。一方、DBSの調節的結果を評価することへの研究の関心は、治療上の利益に限定されない。実際、DBSは焦点性、調節性および非永久的な神経刺激療法であるので、分子画像化技術によって評価され、システム35によって提供される電気刺激に応答して評価される神経機能活動経路を解明するのにも役立ち得る。この情報は、健康および病理学的状態における未解決の神経生理学的謎を解読するのに特に価値がある可能性があります。最後に、この原稿で説明されている方法論は、DBS誘発性神経調節の効果を in vivoで観察する能力を提供し、その適用中の刺激の影響を決定するための強力な戦略です。要するに、DBSの in vivo 効果を理解することは、この治療の望ましい効果と望ましくない効果を理解し、臨床的改善を予測し、最終的に刺激プロトコルを各患者のニーズに適応させるのに役立ちます。

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Disclosures

著者は、この記事に関連して利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgments

クリスティン・ウィンター教授、ジュリア・クライン教授、アレクサンドラ・デ・フランシスコ教授、ヨランダ・シエラ教授には、ここで説明する方法論の最適化における貴重な支援に感謝します。MLSは、欧州地域開発基金(ERDF)が共同出資したサルドカルロス3世研究所(プロジェクト番号PI17/01766および助成金番号BA21/0030)の支援を受けました。シベルサム(プロジェクト番号CB07 / 09/0031);Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (プロジェクト番号 2017/085);Fundación Mapfre;とファンダシオンアリシアコプロウィッツ。 MCVは、この機関の奨学金保有者としてタチアナ・ペレス・デ・グスマン・エル・ブエノ財団と、EU共同プログラム-神経変性疾患研究(JPND)の支援を受けました。DRMは、欧州社会基金「あなたの未来への投資」(助成金番号PEJD-2018-PRE/BMD-7899)が共同出資した、マドリード市教育委員会の支援を受けました。NLRは、Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019"の支援を受けました。MDの作業は、Ministerio de Ciencia e Innovación(MCIN)およびInstituto de Salud Carlos III(ISCIII)(PT20/00044)によってサポートされました。CNICは、Instituto de Salud Carlos III(ISCIII)、Ministerio de Ciencia e Innovación(MCIN)、およびPro CNIC財団によってサポートされており、Severo Ochoa Center of Excellence(SEV-2015-0505)です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Tesla Biospec 70/20 scanner Bruker, Germany SN0021 MRI scanner for small animal imaging
Betadine Meda Pharma S.L., Spain 644625.6 Iodine solution (iodopovidone)
Beurer IL 11 Beurer SN87318 Infra-red light
Bipolar cable 50 cm w/50 cm mesh covering up to 100 cm Plastics One, USA 305-305 (CM)
Bipolar cable TT2  50 cm up to 100 cm Plastics One, USA 305-340/2 Bipolar cable TT2  50 cm up to 100 cm
Buprex Schering-Plough, S.A 961425 Buprenorphine (analgesic)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IM Laboratorio Reig Jofré S.A., Spain 624239.1 Ceftriaxone (antibiotic)
Commutator Plastics One, USA SL2+2C 4 Channel Commutator for DBS
Concentric bipolar platinum-iridium electrodes Plastics One, USA MS303/8-AIU/Spc Electrodes for DBS
Driller Bosh T58704 Driller
FDG Curium Pharma Spain S.A., Spain ----- 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET radiotracer)
Heating pad DAGA, Spain 23115 Heating pad
Ketolar Pfizer S.L., Spain 776211.9 Ketamine (anesthetic drug)
Lipolasic 2 mg/g Bausch & Lomb S.A, Spain 65277 Ophthalmic lubricating gel
MatLab R2021a The MathWorks, Inc Support software for SPM12
MRIcro McCausland Center for Brain Imaging,  University of South Carolina, USA v2.1.58-0 Software for imaging preprocessing and analysis
Multimodality Workstation (MMWKS) BiiG, Spain Software for imaging processing and analysis
Omicrom VISION VET RGB Medical Devices, Spain 731100 ReV B Cardiorrespiratory monitor for small imaging
Prevex Cotton buds Prevex, Finland ----- Cotton buds
Sevorane AbbVie Spain, S.L.U, Spain 673186.4 Sevoflurane (inhalatory anesthesia)
Small screws Max Witte GmbH 1,2 x 2 DIN 84 A2 Small screws
Standard U-Frame Stereotaxic Instrument for Rat, 18° Ear Bar Harvard Apparatus, USA 75-1801 Two-arms Stereotactic frame for rat
Statistical Parametric Mapping (SPM12) The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK SPM12 Software for voxel-wise imaging analysis
STG1004 Multi Channel Systems GmbH, Germany STG1004 Isolated stimulator
SuperArgus PET/CT scanner Sedecal, Spain S0026403 NanoPET/CT scanner for small animal imaging
Suture thread with needle, 1/º Lorca Marín S.A., Spain 55325 Braided natural silk non-absorbable suture 1/0, with triangle needle
Technovit 4004 (powder and liquid) Kulzer Technique, Germany 64708471; 64708474 Acrylic dental cement for craniotomy tap
Wistar rats (Rattus norvergicus) Charles River, Spain animal facility Animal model used
Xylagesic Laboratorios Karizoo, A.A, Spain 572599-4 Xylazine (anesthetic drug)
Normon S.A., Spain 602910 Mepivacaine in gel for topical use

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References

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神経科学、第181号、脳定位固定手術、脳深部刺激療法、陽電子放出断層撮影、フルオロデオキシグルコース、[18F]-フルオロデオキシグルコース、神経刺激、動物モデル
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