Summary
我们描述了一种临床前实验方法，以评估由 体内 FDG-PET急性深部脑刺激诱导的代谢神经调节。这份手稿包括所有实验步骤，从立体定位手术到刺激治疗的应用以及 PET 图像的采集、处理和分析。
Abstract
深部脑刺激（DBS）是一种侵入性神经外科技术，基于将电脉冲应用于涉及患者病理生理学的大脑结构。尽管DBS的历史悠久，但其作用机制和适当的协议仍不清楚，这突出了旨在解决这些谜团的研究的必要性。从这个意义上说，使用功能成像技术评估DBS的 体内 效应代表了确定刺激对大脑动力学影响的有力策略。在这里，描述了临床前模型（Wistar大鼠）的实验方案，结合纵向研究[18F]-氟脱氧正电子发射断层扫描（FDG-PET），以评估DBS对脑代谢的急性后果。首先，动物接受立体定向手术，将电极植入前额叶皮层。获取每只动物的术后计算机断层扫描（CT）以验证电极位置。恢复一周后，在没有刺激的情况下获得了每只手术动物的第一个静态FDG-PET（D1），两天后（D2），在刺激动物的同时获得了第二个FDG-PET。为此，在向动物施用FDG后，将电极连接到隔离的刺激器。因此，在FDG摄取期（45分钟）刺激动物，记录DBS对大脑代谢的急性影响。鉴于本研究的探索性，FDG-PET图像基于D1和D2研究之间的配对T检验，通过体素方法进行分析。总体而言，DBS和成像研究的结合可以描述神经网络的神经调节后果，最终有助于解开围绕DBS的难题。
Introduction
术语神经刺激包括许多不同的技术，旨在刺激神经系统，其治疗目标为1。其中，深部脑刺激（DBS）是临床实践中最普遍的神经刺激策略之一。DBS包括用神经刺激器传递的电脉冲刺激深部脑核，通过放置在大脑靶标中的电极直接植入患者体内，通过立体定向手术进行调节。评估DBS在不同神经和精神疾病中的可行性的文章数量不断增加2，尽管其中只有一些获得了食品和药物协会（FDA）的批准（即特发性震颤，帕金森病，肌张力障碍，强迫症和医学难治性癫痫）3.此外，大量的大脑靶标和刺激方案正在研究中，用于DBS治疗比官方批准的更多的病理，但没有一个被认为是确定的。DBS研究和临床程序中的这些不一致可能部分是由于缺乏对其作用机制的充分理解4。因此，人们正在付出巨大的努力来破译DBS对大脑动力学的 体内 影响，因为每一次进步，无论多么小，都将有助于完善DBS方案以获得更大的治疗成功。
在这种情况下，分子成像技术为观察DBS的 体内 神经调节作用打开了直接窗口。这些方法不仅提供了确定DBS应用时的影响的机会，而且还提供了揭示其后果的性质，防止不良副作用和临床改善的机会，甚至使刺激参数适应患者的需求5。在这些方法中，使用2-脱氧-2-[18F]氟-D-葡萄糖（FDG）的正电子发射断层扫描（PET）特别令人感兴趣，因为它提供了有关不同大脑区域激活状态的特定和实时信息6。具体而言，FDG-PET成像基于神经元和神经胶质细胞之间代谢耦合的生理原理提供了神经激活的间接评估6。从这个意义上说，一些临床研究已经报道了使用FDG-PET调节DBS的大脑活动模式（见3 ）。然而，临床研究在关注患者时容易出现一些缺点，例如异质性或招募困难，这极大地限制了他们的研究潜力6。这种背景导致研究人员使用人类状况的动物模型在临床转化之前评估生物医学方法，或者，如果已经在临床实践中应用，则解释治疗益处或副作用的生理起源。因此，尽管人类病理学与实验动物的模拟状况之间存在很大距离，但这些临床前方法对于安全有效地过渡到临床实践至关重要。
这份手稿描述了小鼠模型的实验性DBS方案，并结合纵向FDG-PET研究，以评估DBS对大脑代谢的急性后果。通过该协议获得的结果可能有助于解开DBS诱导的大脑活动的复杂性调节模式。因此，提供了一种合适的实验策略来检查 体内 刺激的后果，使临床医生能够预测特定情况下的治疗效果，然后根据患者的需求调整刺激参数。
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Protocol
实验动物程序根据欧洲共同体理事会指令2010/63 / EU进行，并得到格雷戈里奥·马拉尼翁医院动物实验伦理委员会的批准。实验方案的图形摘要如图 1A所示。
1. 通过体内神经成像定位脑靶标
- 动物制备
注意：使用~300g的雄性Wistar大鼠。- 将动物放入麻醉诱导盒中并密封顶部。
- 打开七氟醚蒸发器（5%用于100%O2中的诱导）。当大鼠被麻醉时，将气流切换到鼻锥。通过捏住鼠爪确认麻醉状态。
- 将动物仰卧在CT床上，维持七氟烷麻醉（3%维持100%O2）。
- 电脑断层扫描成像
注意：安培数、电压、投影次数、拍摄次数和体素分辨率的选择取决于 CT 扫描仪。这里，使用以下参数：340 mA、40 KV、360 次投影、8 次拍摄和 200 μm 分辨率为7，8，9。- 将面罩或鼻锥固定在大鼠身上。
- 用丝带固定鼠体的头部、肩部、臀部和尾巴，以提供足够的约束而不会损坏。
- 连续监测大鼠。
- 将头部定位在 CT 扫描仪视野的中心。
- 根据扫描仪的规格，使用采集参数继续采集CT图像。
- 10分钟后，当 体内 CT扫描完成后，停止七氟醚流动并将大鼠放入MRI扫描仪中。
- 磁共振成像
注意：扫描采集规格因扫描仪而异，包括不同的软件系统，更重要的是，具体的研究问题。在这里，使用了7特斯拉扫描仪。使用 T2 加权自旋回波序列 7，8，9，TE = 33 ms，TR = 3732 ms，切片厚度为 0.8 mm（34 个切片），矩阵大小为 256 x 256 像素，FOV 为 3.5 x 3.5 cm2。- 将动物仰卧在MRI床上，维持七氟烷麻醉（3%用于维持100%O2）。
- 将头部固定在扫描仪床上的立体定向框架上，以避免在 MRI 采集过程中头部移动。此外，用丝胶带固定老鼠身体的其余部分。
- 将头部定位在 MRI 扫描仪视野的中心。
- 一旦位置正确，继续获取MRI图像。
- 体内MRI扫描完成后，停止七氟醚流动并将大鼠放入笼中。
- 在笼子附近放置加热灯，因为老鼠通常会在扫描过程中降低体温。
- 监测大鼠直到从麻醉中恢复。
- 图集共定位和目标坐标计算
- 按照扫描仪的建议采集和重建 CT 和 MRI 图像后，共同配准 CT 和 MRI 图像。
- 使用成像处理软件使用基于互信息的自动刚性配准算法对CT和MRI进行空间归一化10.
- 定位共配准图像中的前/后（AP： +3.5 mm）、中线/外侧 （ML： +0.6 mm） 和背腹轴 （DV： -3.4 mm） 到目标（即内侧前额叶皮层，mPFC），根据 Paxinos 和 Watson 大鼠脑图谱11。
注意：当体重、大小、性别和品种不同时，大鼠之间从布雷格玛到目标的坐标可能会有所不同。
2. 立体定位手术
注意：使用前高压灭菌所有手术材料、植入物和立体定位单元，并对手术区域进行消毒，以避免可能影响动物福利的感染和并发症。使用无菌手术手套并用粘性窗帘覆盖动物以防止污染。
- 动物制备和麻醉
- 在手术前一天腹膜内给予动物0.1mg / kg丁丙诺啡。将动物放入麻醉诱导箱室并密封顶部。
- 打开七氟醚蒸发器（5%用于100%O2中的诱导）。
- 当大鼠卧卧时，关闭七氟烷蒸发器并将大鼠从箱室中取出。
- 腹膜内施用氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物以麻醉动物。
- 等到动物完全麻醉。通过捏住叉指区域来检查麻醉水平。
- 剃掉耳朵和眼睛之间的区域。
- 放置在立体定向框架和开颅术中
- 将动物置于立体定向框架上的俯卧位，并使用大鼠的头部适配器在手术过程中将动物保持在正确的位置。
- 通过使用大鼠耳条确保头部不动。插入耳杆时要小心，因为插入太深可能会损坏鼓膜。
- 将眼科润滑凝胶涂抹在眼睛上以防止手术过程中干燥，并用无菌纱布覆盖它们。
- 使用粘性窗帘覆盖动物以防止污染。
- 将碘聚维酮溶液涂抹在剃须区域，并用无菌纱布清洁。
- 在剃光区域将甲哌卡因在凝胶中涂抹以麻醉局部区域。
- 在耳朵之间的颅骨上方的皮肤上做一个纵向切口，从λ延伸到Bregma（即从颅顶点到眼睛）延伸1.5-2厘米。
- 在 2 或 3 个夹子的帮助下暴露头骨。用棉签取出骨膜，用盐水溶液清洁血液，露出前列格玛和矢状面缝合线。用纱布除去多余的盐水溶液。
- 用手术刀划伤颅骨表面，以提高牙科水泥的附着力。用浸泡在过氧化氢中的棉签清洁该区域。
- 电极放置和固定在颅骨上
- 用塑料镊子拉直电极，以确保在手术过程中正确放置。
注意：本协议中使用带接地的同心双极铂铱电极。 - 在立体定向框架右臂的支架上找到一个电极。
注意：可能需要使支架适应电极以更好地固定电极（见 图1B）。确保电极与支架的轴平行。 - 将握住电极的右臂穿过立体定位框架，并将电极的尖端精确地放在 Bregma 上。尝试将电极尖端尽可能靠近颅骨，但不要接触它以避免电极变形，并注意立体定位框架提供的 Bregma 结果坐标。用手术笔在头骨上做一个标记，指示电极的初始位置。
- 将支架移动到步骤1.4.3中获得的AP和ML坐标，并用手术笔在颅骨上做标记，指示电极目标的位置。
- 取下固定电极的立体定向框架的右臂。小心不要用电极接触任何东西。
- 使用小型电钻在目标位置的头骨（直径约1-1.5毫米）上打一个孔，直到可以看到硬脑膜。使用棉签止血。
- 沿着颅骨钻4个孔，以定位4个螺钉（最好是2-3毫米长的不锈钢螺钉），以增加牙科水泥的表面积并定位地面。连接 4 个螺钉。
- 用右电极定位立体定向框架的右臂。将手臂移动到计算的位置，该位置应与孔重合。然后，降低电极，直到它接触硬脑膜。该位置将在 DV 方向上用作 0 级别。
- 使用步骤1.4.3中的DV位置将电极尖端插入DV方向。用棉签清洁电极区域周围的血液和脑脊液。
- 将接地连接到最靠近电极的螺钉之一。
- 在电极周围涂抹牙科水泥和螺钉，注意使牙科水泥成型，避免锋利的边缘，这可能会伤害动物。牙科水泥涂在一层中，以防止对组织/颅骨的过热/热损伤。在添加其他层之前，厚层需要更多时间来固化。在从支架上取下电极之前，请确保牙科水泥完全硬化。
注意：牙科水泥的制备会产生混合物中散发出有毒蒸气，最终水泥凝固。因此，从这一点开始，直到手术结束，请戴上对化学气体有效的防护面罩。 - 对大脑的另一个半球重复步骤2.3.2-2.3.11中的相同过程。
- 涂抹更多的牙科水泥以形成盖子而不覆盖电极。等到它变硬。
- 使用编织的天然蚕丝不可吸收缝合线1/0，用三角针缝合帽前后。如果需要，根据不可吸收的缝合线所在的身体区域在特定时间拆下。使用碘聚维酮溶液对手术区域进行消毒。
- 从立体定向框架中取出大鼠。
- 用塑料镊子拉直电极，以确保在手术过程中正确放置。
- 用于电极放置确认的 CT 成像
- 执行步骤1.2.4-1.2.5，请参见 图1C。
- 体内CT扫描完成后，将大鼠放入笼子中。
- 按照步骤 1.3.6 操作。和 1.3.7.
- 术后护理
- 给予抗生素（头孢曲松，100 mg/kg，皮下注射）5 天，镇痛药（丁丙诺啡，0.1 mg/kg，腹膜内）3 天作为术后护理。如果在瓶盖周围观察到任何感染迹象（发红、肿胀和渗出物），这种抗生素治疗方案可以延长 5 天。
- 每天对每只动物进行目视检查，寻找疼痛或痛苦的迹象，并用碘聚维酮溶液清洁盖子。
- 提供手术后长达 1 周的重症监护。
3. PET/CT成像采集
注意：每只动物在吸入麻醉下进行两次PET / CT研究（即，在没有DBS给药期间和期间），以评估电刺激引起的急性效应。两次扫描都遵循相同的成像采集方案，在手术后 1 周（D1，无刺激）和 2 天后（D2，DBS 期间）进行。
- 动物制备和麻醉
- 在每次PET扫描之前将大鼠快速8-12小时，以允许更高的FDG脑摄取，提高信噪比12。
- 将动物放入麻醉诱导盒中并密封顶部。
- 打开七氟醚蒸发器（5%用于100%O2中的诱导）。
- 当大鼠被麻醉时，将气体通量切换到鼻锥。
- 五龙注射及摄取期
注意：FDG是一种放射性示踪剂，因此请考虑辐射防护措施以避免放射性暴露。确认该机构拥有处理放射性化合物的所有许可。- 将FDG小瓶放在衬有铅的柜子内，直到使用以避免不良的放射性暴露。
- 用~37 MBq的FDG溶液填充小规格注射器（~27G），体积较小，如活动计中测量的那样。
- 在动物的尾巴下放置加热垫或使用红外线扩张尾静脉。
- 一旦尾巴顶部的侧静脉明显，请用卫生酒精（96%）清洁该区域。
- 通过侧尾静脉之一注入FDG溶液，用与其轨迹平行的注射器接近静脉，针头的斜面朝上。
- 关闭麻醉并将动物放回笼子中，以便在加热灯下完全恢复。
- 在开始图像采集会话之前，允许45分钟的放射性示踪剂摄取。在此期间，保持动物清醒并在铅屏蔽室内。
- 就D2研究而言，在FDG摄取期间，按照下文第4节（电刺激管理）的说明提供DBS。
- PET采集和影像重建
注意：PET图像采集规格取决于扫描仪和扫描时间。对于该协议，使用小动物PET / CT扫描仪获取静态PET图像45分钟，使用400-700 keV7，8，9的能量窗口。在设计采集协议之前，请查看PET / CT设备的规格。- FDG注射后45分钟，将动物放入麻醉诱导盒中并密封顶部。
- 打开七氟醚蒸发器（5%用于100%O2中的诱导）。
- 将动物转移到PET / CT床上并将其置于仰卧位，将鼻子固定在麻醉鼻锥上并保持七氟烷麻醉（3%用于维持100%O2）。通过捏住鼠爪确认麻醉状态。
- 重复步骤 1.2.2 和 1.2.3。
- 将头部定位在 PET 扫描仪视野的中心。
- 根据扫描仪的规格，使用采集参数采集静态PET图像。
- 继续使用 2D-OSEM（有序子集期望最大化算法）重建图像，并应用衰减和死区时间校正7，8，9。
- 当体内PET扫描完成后，保持七氟醚流向大鼠，以便随后进行CT采集，而不会使动物的头部位置在扫描仪床上移位。
- CT 采集
- 在不改变动物相对于先前PET采集的位置的情况下，继续采集CT图像。
- 重复步骤 1.2.3-1.2.5。
- 体内CT扫描完成后，停止七氟醚流动并将大鼠放入其各自的笼子中进行恢复。
- 按照步骤 1.3.6 操作。和 1.3.7.
- 将动物保持在铅屏蔽室中，直到放射性完全衰变。
4. 电刺激给药
注意：电刺激是在D2成像会话的FDG摄取期间进行的。对于该协议，刺激是用隔离刺激器传递的，在恒流模式下具有高频（130 Hz）电刺激，150μA，脉冲宽度为100μs7，13，14。
- DBS刺激器配置
- 在一个宽阔而安静的房间里准备隔离的刺激器和所需的电线，为动物笼子留出足够的空间，并且潜在干扰刺激的影响最小。
- 将刺激线连接到旋转接头，以允许动物在笼子内自由移动并连接到刺激器。
- 根据研究需要设置刺激参数。
- 使用示波器检查电流模式、频率和脉冲宽度。用矩形脉冲形状确认双相波形（图1D）。
- 星展银行交付
- 在D1成像会议之后，直到D2采集，使动物接受每日习惯化方案（45分钟/天），以使它们适应刺激系统和操作员的处理，避免D2中不良的应激反应。将刺激系统连接到每只动物，但不打开刺激。
- 一旦刺激器设置好，并且动物被注射了FDG，将旋转接头连接到电极并打开刺激器。
- 45分钟后，关闭刺激器，断开动物与旋转的连接，并将其快速转移到麻醉诱导室以开始步骤3.3。
图1：实验设计 。 （A）本协议中遵循的实验步骤摘要。（B）支架适应的代表性图片，以更好地固定电极，有（左）和不带（右）电极。（C）MRI与手术动物CT的融合图像，显示内侧前额叶皮层（mPFC）中的正确电极位置。（D） 显示双相刺激波形的示波器屏幕屏幕截图。 请点击此处查看此图的大图。
5. PET图像处理与分析
注意：对来自 D1 和 D2 的图像执行相同的图像处理，以获得可比较数据，以便进行后续的体素统计分析。
- PET图像的空间配准
- 使用专门的成像处理软件。整个注册工作流程如图 2 所示。
- 将每个PET和CT图像居中并裁剪到视野中。使用基于互信息的自动刚性配准算法将PET图像注册到其CT15。
注意：严格的登记方法仅适用于动物之间体重或大小没有显着差异的情况。否则，请考虑使用弹性方法。 - 如步骤5.1.2所示，将每个CT图像注册到空间上注册到Paxinos和Watson大鼠脑图谱11 的参考CT。保存生成的转换参数。
- 应用在步骤 5.1.3 中获得的转换参数。到每个注册的PET图像获得注册到参考CT图像的PET图像。
- 将所有最终的PET图像保存为Nifti格式。
- PET图像的强度归一化和平滑
注意：强度归一化和平滑是根据公开可用的资源使用不同的内部脚本执行的。- 使用全宽半最大值 （FWHM） 为 2 mm 的各向同性高斯核平滑 PET 图像，以纠正可能的配准错误。
注意：平滑过滤器的大小将取决于PET采集的分辨率，但建议使用FWHM体素大小的2-3倍的过滤器。 - 使用适当的参考簇归一化方法16对PET体素值的强度进行归一化。
- 从注册到参考 CT 图像的参考 MRI 中分割脑面罩。
- 将脑掩模应用于每个 PET 图像，以从体素分析中排除大脑外的体素。
- 使用全宽半最大值 （FWHM） 为 2 mm 的各向同性高斯核平滑 PET 图像，以纠正可能的配准错误。
- 体素分析
注意：统计分析包括PET图像数据的体素分析，使用专门的成像分析软件17进行。- 使用配对 T 检验比较 D1 和 D2 PET 图像，设置足够的统计显着阈值。
- 仅将大于 50 个相邻体素的聚类视为分析的最终结果，以减少类型 I 错误。
- 以叠加在T2 MRI上的T图表示结果，显示DBS诱导的葡萄糖脑代谢的变化（FDG减少的冷色和FDG增量的暖色）。
图 2：微型 PET/CT 成像配准工作流程。 PET图像空间归一化处理的详细步骤，用于使用统计参数映射（SPM）软件进行后续体素分析。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
在研究结束时或当动物的福利受到损害时，使用CO2处死动物。 图3显示了来自手术动物的完整PET / CT研究示例。因此，插入大鼠大脑的电极可以在 图3A所示的CT图像中清楚地观察到。这种成像模式提供了良好的解剖学信息，并有助于配准FDG-PET图像，因为功能模式往往比结构图像更模糊（图3A，B）。此外，同一动物的FDG-PET和CT图像的合并图像如图 3C所示。
图3：大鼠大脑的微PET / CT成像，DBS电极植入mPFC。 （A）CT图像的矢状面。（B）与A中相同动物的FDG-PET图像的矢状面部分.（C）融合的PET / CT图像由叠加A和B图像在空间上注册到同一立体定位空间而产生。 请点击此处查看此图的大图。
使用SPM12软件进行并在此处作为示例提供的体素分析包括D1（没有DBS）和D2（FDG摄取期间的DBS）研究之间的配对T检验，这实际上属于先前发表的研究8。因此， 图4 显示了两个PET会话之间的大脑代谢差异，因为T图叠加在来自注册到参考CT图像（CTref）的MRI的连续1毫米厚的脑切片上。这些差异包括FDG摄取量的增加和减少，分别显示为暖色和冷色。此外，从分析中获得的统计结果的详细摘要如 表1所示。在这里，我们表示调制的大脑区域，观察到调制的大脑半球，T统计量，体素数（k）中的簇大小，调制的方向（即高代谢或低代谢变化）以及在峰值和簇水平获得的p值。这种类型的表格用于详细描述在切片叠加图中观察到的调制变化。
图 4：配对 T 检验结果。叠加在注册到同一 CTref 的 T2 MRI 上的体素分析产生的 T 图，显示了急性 DBS 方案（D2 与 D1）诱导的代谢变化。图像底部的颜色条表示对应于FDG摄取的区域增加（暖色）和减少（冷色）的T值（p < 0.005; k>50体素）。缩写：AHiPM/AL - 杏仁核海马区后内侧/前外侧部分，Au - 听觉皮层，Bstm - 脑干，CPU - 尾状壳核，HTh - 下丘脑，L - 左半球，PMCo - 后内侧皮质杏仁核，R - 右半球，S1 - 初级躯体感觉皮层。该图经Casquero-Veiga等人8许可修改。请点击此处查看此图的大图。
| D1 vs D2：刺激效应 | |||||||
| 投资回报率 | 边 | T | k | ↓/↑ | P UNC.峰值电平 | FWE | FWE |
| 峰值电平 | 集群级别 | ||||||
| Bstm | R&L | 18.39 | 1549 | ↓ | <0.001 | 0.432 | <0.001 |
| AHiPM/AL-PMCo - HTh | L | 10.39 | ↓ | <0.001 | 0.949 | ||
| 中央处理器 | L | 37.56 | 738 | ↑ | <0.001 | 0.025 | <0.001 |
| S1-金 | 10.53 | ↑ | <0.001 | 0.947 | |||
| CPu-Pir | R | 17.74 | 695 | ↑ | <0.001 | 0.497 | <0.001 |
| S1-金 | 10.45 | ↑ | <0.001 | 0.948 | |||
表1：mPFC急性DBS后脑代谢的变化。 D1 vs D2：刺激效应。结构：AHiPM/AL：杏仁核海马区后内侧/前外侧部分，Au：听觉皮层，Bstm：脑干，CPu：尾状壳核，HTh：下丘脑，Pir：梨状皮层，PMCo：后内侧皮质杏仁核，S1：初级躯体感觉皮层。投资回报率：感兴趣的区域。侧面：右 （R） 和左 （L）。T：t 值，k：簇大小。葡萄糖代谢：增加（↑）和减少（↓）。p：p 值，UNC.：未校正，FWE：家庭明智的纠错。本表经Casquero-Veiga等人8许可修改。
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Discussion
鉴于对脑功能和神经精神疾病病理生理学所涉及的神经网络的理解取得了进展，越来越多的研究认识到DBS在广泛的基于神经的病理学中的潜力2。然而，这种疗法的作用机制尚不清楚。一些理论试图解释在特定病理和刺激情况下获得的效果，但所提出的研究的异质性使得很难得出明确的结论4。因此，尽管付出了巨大的努力，但没有真正的共识，但接受DBS干预的患者数量继续增长18。然后，了解 体内大脑 中的DBS后果将允许揭示哪些刺激参数和刺激方案更适合每个患者的需求，从而获得更好的成功率。在这种情况下，非侵入性功能性神经成像方式，如FDG-PET，对于揭示在大脑电刺激的直接影响下真正发生的事情至关重要。例如，在这里解释的纵向协议中，DBS在D2 PET图像的放射性示踪剂摄取期间传递。因此，比较D2（DBS-ON）和D1（DBS-OFF）PET研究可以可视化 体内电刺激调节的大脑区域，因为FDG的“代谢捕获”特性允许记录刺激期间直接发生的累积变化13，19。
总之，该协议描述了一种可行的策略来评估体内DBS在大脑中的急性后果，但是可用的DBS参数组合和协议的种类是巨大的（例如，连续与间歇治疗20，高频与低频刺激21），甚至DBS的效果可能随着治疗而不同，因为推断在刺激影响下大脑网络的直接变化22.此外，考虑到推荐DBS的病理数量的增加，可能性的数量变得更加多23.因此，旨在揭示允许预测对DBS治疗的潜在反应的神经激活模式的纵向神经影像学研究具有特别的临床相关性24，25。在这方面，有大量的临床和临床前研究评估了FDG-PET不同DBS方案的治疗效果（见3）。因此，有几个例子表明，所研究的DBS方案抵消了与正在治疗的病理相关的脑代谢模式，诱导患者症状的改善并证明了DBS-PET方法的临床有用性。这方面的一个例子是刺激胼胝下扣带区（SCC）对难治性抑郁症患者的刺激。鳞状细胞癌在未用药的抑郁症患者中代谢亢进26，并且在通过药物、心理治疗或 DBS 治疗缓解抑郁症后，这种过度激活正常化27，28，29。重要的是，与无反应者相比，在开始刺激前对DBS有反应的患者的SCC代谢更高。这项研究显示，对SCC-DBS29反应的预测准确率为80%，突出了成像生物标志物在选择DBS潜在患者方面的重要性。因此，所解释的背景反映了FDG-PET研究的临床成功历史，旨在将抑郁症的大脑代谢模式与SCC-DBS获得的治疗结果相图，这应该为未来专注于其他神经精神疾病和DBS方案的类似方法奠定基础。
从这个意义上说，为了观察使用FDG-PET的DBS的生理效应，仔细考虑要扫描的DBS协议的具体时间尤为重要。因此，尽管应用了相同的DBS参数和相同的协议，图像采集的时序将清楚地确定观察到的调制的来源，如果不考虑最终响应所涉及的所有因素，这可能会导致潜在的误解8。因此，虽然手术计划是奠定后续治疗基础的决定性因素，但设计适合所研究刺激后果的图像采集方案对于充分了解所应用的刺激治疗背后的分子机制至关重要。沿着这些思路，有几个因素可以极大地改变对特定DBS方案的反应（例如，刺激参数，电极插入，靶向的大脑结构，正在治疗的病理，DBS会话的持续时间和频率等）。7，8，30.FDG-PET研究中收集的数据所反映的现象将取决于在治疗过程中获取图像的特定时间。然后，所有这些观点为探索DBS诱导的调节开辟了不同的研究机会，并有助于解释这种疗法背后的机制。
因此，尽管啮齿动物和人类大脑之间存在巨大差异，但应在各个层面实施适当的做法，以制定翻译协议。从这个意义上说，不应忽视DBS需要基于开颅术的高度侵入性手术，以便电极可以进入深部脑结构31。此时，有两个重要的感染和炎症反应来源：一方面，在手术过程中脑组织直接暴露，另一方面，将两个外源性元素插入内部器官，通过其向刺激目标32的轨迹产生插入疤痕。因此，手术设备的灭菌，保持手术区域的清洁以及基于抗生素和镇痛治疗的充分术后护理33 对于确保受试者在最健康的条件下从干预中获得最大益处至关重要。此外，这在FDG-PET成像研究中特别重要，因为手术后并发症的发生可以改变放射性示踪剂摄取的模式，因为炎症和感染过程清楚地被视为高代谢信号34，这可能导致对治疗的反应改变或高估DBS产生的调节。
然而，这种实验方法受到一些限制：首先，DBS方案通常是长期，连续和慢性治疗。这里展示了一种神经影像学方案，可以实时评估DBS的急性影响。因此，建议用于神经影像学研究的时间不足以近乎实时地获得DBS诱导的长期调节的信息。然而，它可能为开发不同的纵向方法奠定基础，作为理解DBS衍生响应的基本知识。其次，由于已经使用健康动物来说明这种方法，因此将所解释的技术应用于不同的病理状况可能需要对其进行调整，以确保更好的结果和最佳的福利条件。最后，体素分析需要大样本量和/或强大的校正因子才能获得可靠的结果，因为它们总是受到多重统计比较问题的影响。然而，使用FDG-PET和体素方法评估DBS对大脑代谢的影响是一个很大的优势，因为这种方法具有内在的探索性，它允许进行广泛的全脑分析，而无需任何先前的假设。
尽管将DBS和FDG-PET结合起来有明显的缺点，但这些方法提供了一个很大的机会之窗。因此，非侵入性地获得大脑代谢信息是一个很大的优势，因为可以在刺激期间和许多不同的场合与DBS治疗一起从受试者那里收集神经生理数据。此外，FDG-PET是临床环境中的一种神经影像技术，它加强了激发该方法的转化方法。同样，使用FDG-PET是一种特别合适的替代方案，因为与其他成像方式不同，获得的信号不受来自神经刺激系统的电场或磁场的二次失真的影响，这可能会损害图像质量和系统性能24。另一方面，评估DBS调节后果的研究兴趣不仅限于治疗益处。事实上，由于DBS是一种局灶性，调节性和非永久性神经刺激疗法，它也可能有助于解开通过分子成像技术评估的神经功能活动途径，并响应于系统35提供的电刺激。这些信息对于破译健康和病理条件下未解决的神经生理学谜团可能特别有价值。最后，本文中解释的方法提供了观察DBS诱导的体内神经调节效果 的能力，是确定刺激在其应用过程中的影响的有力策略。简而言之，了解DBS的 体内 效果将有助于了解这种治疗的预期和不希望的效果，预测临床改善，并最终使刺激方案适应每个患者的需求。
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Disclosures
作者声明，与本文不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Christine Winter教授，Julia Klein，Alexandra de Francisco和Yolanda Sierra在优化本文所述方法方面的宝贵支持。MLS得到了科学和创新部，卡洛斯三世健康研究所（项目编号PI17/01766和赠款号BA21/0030）的支持，由欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助，“创造欧洲的方式”;CIBERSAM（项目编号CB07/09/0031）;德罗加斯国家计划（项目编号2017/085）;马夫雷基金会;和艾丽西亚·科普洛维茨基金会。 MCV得到了塔蒂亚娜·佩雷斯·德·古兹曼·布埃诺基金会的支持，作为该机构的奖学金获得者，以及欧盟联合计划 - 神经退行性疾病研究（JPND）。DRM得到了马德里社区教育与调查委员会的支持，由欧洲社会基金“投资你的未来”（资助号PEJD-2018-PRE/BMD-7899）共同资助。NLR得到了格雷戈里奥·马拉尼翁卫生研究所的支持，“2019年I+D+I壁内计划”。医学博士的工作得到了 科学和创新部（MCIN）和卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）的支持（PT20/00044）。CNIC得到了卡洛斯三世健康研究所（ISCIII），科学与创新部（MCIN）和Pro CNIC基金会的支持，并且是Severo Ochoa卓越中心（SEV-2015-0505）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Tesla Biospec 70/20 scanner | Bruker, Germany | SN0021 | MRI scanner for small animal imaging |
| Betadine | Meda Pharma S.L., Spain | 644625.6 | Iodine solution (iodopovidone) |
| Beurer IL 11 | Beurer | SN87318 | Infra-red light |
| Bipolar cable 50 cm w/50 cm mesh covering up to 100 cm | Plastics One, USA | 305-305 (CM) | |
| Bipolar cable TT2 50 cm up to 100 cm | Plastics One, USA | 305-340/2 | Bipolar cable TT2 50 cm up to 100 cm |
| Buprex | Schering-Plough, S.A | 961425 | Buprenorphine (analgesic) |
| Ceftriaxona Reig Jofré 1g IM | Laboratorio Reig Jofré S.A., Spain | 624239.1 | Ceftriaxone (antibiotic) |
| Commutator | Plastics One, USA | SL2+2C | 4 Channel Commutator for DBS |
| Concentric bipolar platinum-iridium electrodes | Plastics One, USA | MS303/8-AIU/Spc | Electrodes for DBS |
| Driller | Bosh | T58704 | Driller |
| FDG | Curium Pharma Spain S.A., Spain | ----- | 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET radiotracer) |
| Heating pad | DAGA, Spain | 23115 | Heating pad |
| Ketolar | Pfizer S.L., Spain | 776211.9 | Ketamine (anesthetic drug) |
| Lipolasic 2 mg/g | Bausch & Lomb S.A, Spain | 65277 | Ophthalmic lubricating gel |
| MatLab R2021a | The MathWorks, Inc | Support software for SPM12 | |
| MRIcro | McCausland Center for Brain Imaging, University of South Carolina, USA | v2.1.58-0 | Software for imaging preprocessing and analysis |
| Multimodality Workstation (MMWKS) | BiiG, Spain | Software for imaging processing and analysis | |
| Omicrom VISION VET | RGB Medical Devices, Spain | 731100 ReV B | Cardiorrespiratory monitor for small imaging |
| Prevex Cotton buds | Prevex, Finland | ----- | Cotton buds |
| Sevorane | AbbVie Spain, S.L.U, Spain | 673186.4 | Sevoflurane (inhalatory anesthesia) |
| Small screws | Max Witte GmbH | 1,2 x 2 DIN 84 A2 | Small screws |
| Standard U-Frame Stereotaxic Instrument for Rat, 18° Ear Bar | Harvard Apparatus, USA | 75-1801 | Two-arms Stereotactic frame for rat |
| Statistical Parametric Mapping (SPM12) | The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK | SPM12 | Software for voxel-wise imaging analysis |
| STG1004 | Multi Channel Systems GmbH, Germany | STG1004 | Isolated stimulator |
| SuperArgus PET/CT scanner | Sedecal, Spain | S0026403 | NanoPET/CT scanner for small animal imaging |
| Suture thread with needle, 1/º | Lorca Marín S.A., Spain | 55325 | Braided natural silk non-absorbable suture 1/0, with triangle needle |
| Technovit 4004 (powder and liquid) | Kulzer Technique, Germany | 64708471; 64708474 | Acrylic dental cement for craniotomy tap |
| Wistar rats (Rattus norvergicus) | Charles River, Spain | animal facility | Animal model used |
| Xylagesic | Laboratorios Karizoo, A.A, Spain | 572599-4 | Xylazine (anesthetic drug) |
| Normon S.A., Spain | 602910 | Mepivacaine in gel for topical use |
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