Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Bu prosedür zebra balığı embriyolarının evrelendirilmesi ile başlar. Embriyolar ilgi aşamasına geldiğinde, onları corion'dan çıkarın. Daha sonra embriyoları yerleştirmek için pipet ucu olan aros kaplı bir tabakta delikler oluşturulur ve embriyolar kuyrukları aşağı bakacak şekilde nazikçe deliklere yerleştirilir.

Embriyolar monte edildikten sonra, arka beyinden embriyonun ventrikül boşluğuna dikkatlice bir floresan kalıbı enjekte edilir. Ventrikül enjeksiyonundan sonra embriyolar görüntülenir ve veriler Photoshop kullanılarak işlenir. Merhaba, ben Cambridge, Massachusetts'teki MIT'deki Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'ndeki Dr.Hazel Sieve'in laboratuvarından Jennifer Gutman.

Bugün size zebra balığı beyin ventrikülü enjeksiyonu için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü canlı zebra balıklarında beyin ventrikül oluşumunu ve nöro epitel morfogenezini incelemek için kullanıyoruz. Şeffaf zebra balığı embriyolarının doğası gereği, beyin ventrikül şeklini karakterize etmek zor olabilir.

Bu teknik, sıvı dolu boşluğu çevre dokudan ayırt etmek ve beyin ventrikül oluşum kusurları olabilecek mutant embriyoları karakterize etmek için kullanışlı ve basit bir yoldur. Öyleyse başlayalım. Zebra balığı beyin ventrikülünü enjekte etmeye hazırlanmak için enjeksiyon iğnelerini yaparak başlıyoruz.

Kılcal iğneleri çekmek için bir Sutter aletinin iğne poları kullanılır. Kılcal iğne daha sonra Texas kırmızı dekstrini gibi bir floresan boya ile doldurulur. Daha sonra, doldurulmuş iğne mikroenjeksiyon aparatında bir mikro manipülatöre monte edilir.

İğneyi belirli bir açıyla uygun boyutta kesin. Eğimli bir uç oluşturmak için, iğnenin damla boyutunu ölçün ve yağda enjeksiyon başına bir ila iki nanolitre arasında olup olmadığını kontrol edin. Bu işlem aşamasına başlamak için, Kimmel'e göre embriyolar, ilgilenilen aşamadan 30 dakika önce enjekte edilmelidir.

Örneğin, döllenmeden 24 saat sonra ventrikülleri incelemek için, embriyoları döllenmeden 23 buçuk saat sonra enjekte edin. İlgilenilen aşamadaki embriyo stereo mikroskop altına yerleştirilir ve korion forseps kullanılarak embriyodan dikkatlice çıkarılır. Daha sonra, embriyolar için bir aros kabı, plastik bir ila 200 mikrolitre pipet ucu ile aros'ta% 1 aros dürtme delikleri ile kaplanmış plastik bir tabak kullanılarak yapılır.

Aros tapalarını forseps kullanarak deliklerden dikkatlice çıkarın. Embriyo ve embriyo ortamını delikli aros kabına aktarın. Embriyoyu uyuşturmak ve hareketi önlemek için ortama trica ekleyin.

Deney sırasında, embriyo kuyruğunu yavaşça deliğe yerleştirin ve enjeksiyon aparatı embriyonun arka tarafında olacak şekilde yönlendirin. Artık embriyo ortaya çıkan çanağa doğru bir şekilde yerleştirilip yönlendirildiğine göre, beyin ventrikülü enjeksiyonu için hazırız. İlk olarak, mikro manipülasyon kurulumunu, iğne ucu yüksek güçte embriyo ile aynı görüş alanında olacak şekilde düzenleyin.

İğneyi, aşağıdaki beyin dokusuna çarpmadan R zero R'nin bir menteşe noktasının hemen arkasındaki arka beynin ince çatı plakasından dikkatlice geçirin, ventrikülleri tamamen dolduracak kadar boya enjekte edin. Embriyonun evresine bağlı olarak ventrikül boşluğunu doldurmak için birkaç enjeksiyon gerekebilir. Embriyo enjekte edildiğinde ve görüntüleme için hazır olduğunda, embriyo için yeni bir aros kabı hazırlanır.

Temiz, %1 aros kaplı bir tabak kullanarak tabağa delikler açın ve tapaları çıkarın. Embriyoyu tabağa aktarın ve embriyoyu uyuşturmak ve hareketi önlemek için trica ekleyin. Ventrikül enjekte edilen embriyonun kuyruğunu dorsal bir görüntü için deliğe yerleştirin.

Embriyo artık görüntüleme için hazırdır. İletilen ışığı kullanarak bir görüntü çekin. Embriyoyu veya mikroskobu hareket ettirmemek çok önemlidir.

Ardından, mikroskoptaki ayarları değiştirin ve floresan ışıklı bir görüntü çekin. Hem iletilen ışık hem de floresan ışıkla yanal görüntüler almak için embriyoyu yeniden konumlandırın. Photoshop'un görüntü işlemesi için tüm görüntüleri dosyalara kaydedin.

Görüntüleri Photoshop'ta işlemek için, aynı pozisyonda çekilen aynı embriyonun iletilen ışık ve flüoresan ışığı görüntülerini açın. Tüm ayarların aynı olduğundan emin olun Her görüntü için, floresan görüntünüzü iletilen ışık görüntüsünün üzerine sürükleyin ve bunları seçilen floresan görüntüyle tam olarak hizalayın. Görüntü ayarlamaları'nı seçin ve ardından rengi değiştirin ve siyah arka planı beyaz olarak değiştirin.

Renk değiştir penceresinde, floresan görüntü aynı renkte görünene kadar bulanıklık faktörünü sağa ayarlayın. Katmanlar penceresinde çarp'ı seçin. Bindirme görüntülerini görüntülemek için, ventrikül boşluğu görüntünüz iletilen ışık görüntüsüyle eşleşmelidir. Tam.

Bu dosyayı kaydedin ve diğer görüntüler için tekrarlayın. Ventrikül enjeksiyonu doğru bir şekilde yapılırsa, görüntüler 25 saatlik bu görüntülerde gösterildiği gibi dağınık olmayan boyada keskin kenarlara sahip olmalıdır. Döllenme sonrası tip embriyolar panel A parlak alan görüntüsünü, panel B floresan görüntüsünü ve panel C kaplama görüntüsünü gösterir.

Öte yandan, ventrikül enjeksiyonu sırasında iğne çok uzağa sokulursa, ventrikül boşluğunun altındaki beyin dokusuna girer ve yanlış bir enjeksiyona yol açar. Bu, ventrikül boşluğunun dışında ve burada gösterildiği gibi yumurta sarısında görülebilen boya ile sonuçlanır. Panel E, parlak alan görüntüsünü gösterir.

Panel F floresan görüntüyü, panel G ise üst üste binen görüntüyü gösterir. Oklar, boyanın beyin ventrikül boşluğunun ötesine geçtiği bölgeleri gösterir. Bu videoda, gelişmekte olan zebra balığı beyin ventriküllerine floresan boyanın nasıl enjekte edileceğini gösterdik.

Bu yöntem, çevredeki nöro epitelin aksine beyin ventrikül boşluğunu görselleştirmek için kullanılır ve ventrikül boşluğunun şeklini ve çevredeki beyin dokusunun şeklini belirlemek için son derece yararlıdır. Bu teknik, canlı embriyoda zaman içinde beyin ventrikül oluşumu ve beyin morfogenezi sürecini daha iyi anlamamızı sağlar. Beyin ventrikül oluşum kusurlarını incelemek ve beyin morfogenezi mutantlarının ilk karakterizasyonu için mükemmel bir araçtır.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.