Modelo murino de CD40-ativação de células B

Olá, meu nome é Tanya Wig e sou estudante de doutorado e trabalho no laboratório de imunologia tumoral e imunologia de transplante no Hospital Universitário de Colônia. Meus estudos se concentram principalmente em células B ativadas por CD 40 marinho e sua capacidade de induzir respostas imunes in vivo. Originalmente, as células B CD 40 humanas foram geradas como células apresentadoras de antígenos alternativos às células dendríticas.

Essas células destinam-se a ser usadas para fins imunoterapêuticos Em ambientes clínicos, as células B CD 40 são geradas sob sinalização e estimulação CD 40 com IL quatro. De acordo com esse sistema, eles podem ser expandidos ao longo de várias semanas. Depois de otimizar a geração de células B CD 40 humanas a partir de PBMC em nosso laboratório, transferimos esse princípio com sucesso para camundongos e é isso que quero mostrar hoje.

A partir do baço, geramos células B marinhas ativadas por CD 40 dentro de 14 dias após a cultura celular. As principais etapas são a preparação de células alimentadoras, portanto, usamos a linha celular heer transfectada com ligante CD 40 marinho, que é aderente e é irradiada com 78 cinza e plaqueada em placas de seis poços. Em segundo lugar, iniciamos a cultura marinha de CD 40 DB usando citos SPOC recém-purificados de camundongos pretos seis, que são tratados com interleucina marinha quatro beta macab para etanol e ciclosporina A. Essas células são então transferidas em células feta irradiadas em seis placas de poços.

Este procedimento é repetido a cada três ou quatro dias até o dia 14 da cultura celular. Para acabar com células B ativadas por CD 40 marinhas altamente puras, começamos a geração de células B ativadas por CD 40 marinhas usando camundongos LXi de citos SP recém-purificados. Primeiro, lavamos os citos SP por Resus, suspendendo as células em 50 mililitros de meio de lavagem marinho CD 40 B.

Em seguida, gire as células por sete minutos a 1300 RPM correspondentes a 260 5G para determinação da contagem de células. Ressuspenda completamente os citos em 10 mililitros de meio de lavagem marinho CD 40 B e, finalmente, misture as células por vórtice. Em seguida, determine a contagem de células.

Gire a quantidade necessária de citos por sete minutos a 1300 RPM correspondentes a 260 5G usando uma placa de seis poços. Você precisa de cinco vezes 10 elevado a seis células por poço, portanto, 30 vezes 10 elevado a seis células por recurso de placa. Gaste a quantidade necessária em um ponto 25 vezes 10 das seis células por mililitro em meios de cultura marinhos CD 40 B.

Em seguida, suplemente a suspensão celular com IL marinho quatro em uma concentração de uma unidade por mililitro para estimulação ciclosporina A em uma concentração de oh 0,63 micrograma por mililitro para inibir o crescimento de células T e etanol Beamer CAPTA 100 micromolar. Agora a suspensão celular está pronta para estimulação com células feer. Estamos usando células curandeiras transfectadas com ligante CD 40 marinho para estimular a sobrevivência, diferenciação e proliferação celular, pois a linhagem celular heer pode sobreviver em cultura por vários meses.

A perda da expressão da perna do CD 40 marinho deve ser excluída pela raposa regularmente. O curandeiro transfectado com ligante CD 40 é uma linhagem celular de aderência cultivada a 37 graus com 5% de CO2 em meio de seleção suplementado com gelo B na concentração de O 0,2 miligrama por mililitro. Para seleção, esta linhagem de células epiteliais aderentes nunca deve se tornar completamente confluente e deve ser dividida duas vezes por semana para dividir as células aderentes.

Aspire a lavagem média uma vez com 10 mililitros de PBS. Gire suavemente e adicione quatro mililitros de tripsina EDTA em uma mancha de 75 centímetros quadrados. Incubar o balão durante cinco a 10 minutos a 37 graus na incubadora.

Retirar novamente o balão. Use batidas suaves para separar as células do plástico. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de biótipo, gire suavemente e transfira as células para um tubo de 50 mililitros.

Gire as células alimentadoras por sete minutos a 1300 RPM correspondentes a 260 5G. Ressuspenda cuidadosamente as células peletizadas em 10 mililitros de meio selvagem para determinar a contagem de células para uma subcultura RESO gastou 2,5 vezes 10 para as seis células em meio de seleção de 10 mililitros e transferi-las para um frasco de 75 centímetros quadrados e incubar as células alimentadoras a 37 graus em 5% de CO2 para estimulação de CD 40. Pegue o resto das células heer e, letalmente, irradie-as com grau 78 para impedi-las de proliferar.

Diluir as células alimentadoras em meio selvagem com uma densidade celular de Ø 0,2 vezes 10 elevado a seis células por litro e colocar dois mililitros por alvéolo em uma placa de seis poços. Deixe as células aderirem novamente antes de usá-las como células estimuladoras, incubando-as por 24 horas em 37 graus e 5% de CO2 para estimulação de citos com ligante próximo ao CD 40. Verifique ao microscópio se as células alimentadoras plaqueadas um dia antes estão aderentes.

Se as células alimentadoras estiverem aderentes, remova cuidadosamente o SUP natin de cada poço e, em seguida, transfira suavemente quatro mililitros da suspensão lateral do SPOC, que foi ajustada para um ponto 25 vezes 10 para as seis células por mililitro pouco antes de cada poço para estimulação e incube a placa a 37 graus e 5% de CO2 no dia quatro subcultura de células marinhas CD 40 B novamente para a primeira subcultura de células marinhas CD 40, células B ativadas no quarto dia e subculturas seguintes a cada três a quatro dias. Colha suavemente as células agrupadas da placa de seis poços gastando com um tubo de 10 mililitros. Agrupe as células marinhas CD 40 B em um tubo de 50 mililitros e gire as células por sete minutos a 1300 RPM correspondentes a 260 5G completamente trocadas pelo meio de lavagem marinho CD 40 B.

E para determinar a contagem de células das células marinhas CD 40 B, suspendemos as células marinhas CD 40 B em uma densidade celular de oh ponto 75 vezes 10 elevado a seis células por mililitro em meio de cultura marinho CD 40 B. Então, novamente, suplemente a suspensão celular com IL quatro marinho fresco em uma concentração de uma unidade por mililitro, ciclosporina A em uma concentração de oh ponto 63 microgramas por mililitro e 100 feixe micromolar até etanol. Obviamente, as células alimentadoras irradiadas devem ser verificadas novamente quanto à aderência ao microscópio diretamente antes do uso.

Se as células alimentadoras estiverem aderentes, remova cuidadosamente o SUP natin de cada uma. Bem, então transfira a suspensão marinha de CD 40 B preparada pouco antes para cada poço para estimulação. A subcultura é repetida de forma idêntica após três a quatro dias, duas vezes por semana, para terminar com células B ativadas por CD 40 marinhas altamente puras no dia 14 da cultura.

Neste momento, as células B Marine CD 40 expressam moléculas co-estimulatórias, como moléculas CD 80, CD 86 e MHC, mais uma e duas, que podem ser verificadas por Fox durante a geração. As células que geramos agora podem ser usadas para fazer pesquisas sobre ativação, diferenciação e função de células B, por exemplo, para investigar seu uso potencial para fins imunoterapêuticos.