Name: Modelo murino de CD40-ativação de células B (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a ativar e expandir células B murinas de esplenócitos de camundongos C57BL/6 usando sinalização de CD40 e IL-4. Este método permite gerar células apresentadoras de antígenos para estudos de imunologia e imunoterapia.

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Pedimos gentilmente agradecer ao Dr. Clemens Wendtner para fornecer tmuCD40-Ligand-linha celular HeLa.

O protocolo para a geração de células CD40 de murino ativado B (mCD40B) de esplenócitos é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação do ligante CD40 de murino (CD40L) expressando células HeLa (tmuCD40L HeLa), que será utilizado como placa obrigado células alimentadoras. Parte B descreve a real cultura CD40-B murinos. A. Preparação de células alimentadoras (tmuCD40L HeLa) O HeLa tmuCD40L é uma linha de células epiteliais humanas aderente, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado. <ol><li> Remova o meio de idade a partir da cultura primária com uma pipeta estéril e lavar as células com 10 mL de PBS 1x. Aspirar o PBS após a lavagem. </li><li> Adicionar 4 mL de 1x Tripsina / EDTA em um frasco de 75 cm 2 por 10-15 minutos a 37 ° C. Use tocando suave para retirar as células. </li><li> Adicionar 10 mL de meio de tipo selvagem e giratória suavemente para parar a digestão com tripsina. </li><li> Transferir a suspensão de células em um tubo de 50 mL com uma pipeta estéril e girar a células para baixo a 265 xg por 7 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de tipo selvagem. Conte o número de células de uma alíquota da suspensão de células e preparar três tubos de 50 mL com o número adequado de células: <ol><li> 2,5 x 10 6 células para subcultura </li><li> 0,4 x 10 6 células / poço de irradiação utilizadas para a cultura de células murinas CD40-B </li><li> restante para congelar (se necessário). </li></ol></li><li> Spin the células para baixo a 265 xg por 7 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante. <ol><li> Para subcultura: ressuspender 2,5 x 10 6 células em 10 mL de médio seleção em um frasco de 75 centímetros de cultura de células 2 (densidade celular de 2,5 x 10 5 células / mL) e incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2. Dividir as células duas vezes por semana. </li><li> Para a cultura de células murinas CD40-B: Você precisa de 2,4 x 10 6 células para uma placa de 6 poços. Ressuspender as células HeLa em meio tmuCD40L tipo selvagem, a uma densidade de 0,2 x 10 6 células / mL e irradiar-los em 78 Gy. Placa de 2 mL da suspensão de células em cada poço e incube-os a 37 ° C com 5% de CO 2. Utilize este placas preparado para a estimulação de células B, quando as células HeLa são tmuCD40L aderente (pelo menos 4 horas: verificar a aderência do uso do microscópio, não espere mais de 24 h para iniciar a estimulação de células B). (Continue com B.) </li></ol></li></ol> B. murino CD40-cultura de células B I. Elaboração de esplenócitos para CD40-estimulação (dia 0): Por favor note: antes de continuar determinar que as células de alimentação são aderentes. Sempre adicionar novas soluções de murino imediatamente interleucina-4, β-mercaptoetanol e ciclosporina A para o meio de crescimento antes do uso. <ol><li> Dissecar baço de camundongos C57BL / 6 (haplótipo H-2b) e lavá-la duas vezes em 10-20 mL DMEM suplementado com Gentamicina [15μg/mL], transferindo-o com uma ponta de pipeta 10 ml de um tubo para outro. Evitar a transferência de contaminantes (por exemplo, o cabelo) do mouse. Mince baço por passagem através de um filtro de células (100μm) e enxaguar com outra peneira de 10 mL de meio. Spin down esplenócitos a 265 xg por 7 min em temperatura ambiente, ressuspender-los em 7ml muCD40-B médio de células, e os linfócitos separado por centrifugação Ficoll densidade. Para fazê-lo células da camada em 5 mL Mouse-Pancoll (pré-aquecido em temperatura ambiente) em um tubo de 15 ml e centrifugar a 450 xg por 30 min sem freio à temperatura ambiente. </li><li> Empate fora de a maioria da camada superior, deixando intacta a camada de linfócitos na interface. Transferência de camada de linfócitos a um tubo de 50 mL frescos, lave uma vez com 30mL DMEM com Gentamicina [15μg/mL] para baixo, girando a 265 xg por 7 min para remover outras células. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de mCD40-B médio de lavar roupa. Determinar o número de células em uma alíquota da suspensão de células. Determine o número de células por contagem uma alíquota da suspensão de células. </li><li> Spin para baixo a quantidade necessária de células em 265 xg por 7 minutos. Para uma placa de 6 poços 5 x 10 6 células / poço são necessários, portanto, 30 x 10 6 células por placa. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender os linfócitos em 1,25 x 10 6 células / mL em mCD40-B meio de cultura fresco suplementado com 1 U / mL de IL-4 como fator de crescimento, 100 mM β-mercaptoetanol e 0,63 mcg / mL A ciclosporina para prevenir conseqüência de células-T (concentrações indicados referem-se a um meio de cultura mL!). </li><li> Retire o sobrenadante da placa de 6 poços de pré-incubados com células HeLa tmuCD40L. </li><li> Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de linfócitos (1,25 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2. </li> No dia 3 reculture as células (Continue com II.1.). </ol> II. Subcultura de células mCD40B (dia 3 e, em seguida, duas vezes por semana): <ol><li> Colheita aglomerado de células mCD40B por vigorosamente pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL e piscina-los em um tubo de 50 mL. </li><li> Girar em 265 xg por 7 minutos e substituir completamente o sobrenadante com mCD40-B médio de lavar roupa. Contando a quantidade de células de uma alíquota, gire a células para baixo a 265 xg por 7 minutos. Ressuspender as células em mCD40B mCD40-B meio de cultura a uma concentração de 0,75 x 10 6 células / mL. </li><li> Adicionar novas soluções de murino interleucina-4 em uma concentração de 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol β-M e 0,63 mcg / mL ciclosporina A ao meio. </li><li> Remover o sobrenadante de uma placa de 6 poços de pré-incubados com células irradiadas tmuCD40L HeLa. </li><li> Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de células mCD40B (0,75 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Novamente subcultura as células a cada 3-4 dias para acabar com alta pureza murino células CD40-B ativadas após um total de 14 dias. </li></ol> C. Resolução de problemas: O que se CD40-B células não crescem? <ol><li> Você tem verificado para CD40 ligante expressão de células de alimentação? </li><li> São a placa-bound células alimentadoras usado para a estimulação com mais de 24 horas? </li><li> Existe uma contaminação com micoplasma? </li><li> Foi a solução interleucina-4 utilizada para a suplementação recém descongeladas e que teve a atividade biológico adequado? </li><li> Foi β-mercaptoetanol e ciclosporina A adicionado na concentração correta? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Figura 1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1-A"> Figura 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Figura 1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 b"> Figura 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Figura 1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 d"> Figura 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes nacionais e europeus de manter laboratório animal. Referindo-se a lei alemã de bem-estar dos animais, os animais foram controlados regularmente pelas autoridades competentes.

Modificações deste protocolo são possíveis, especialmente quanto à origem do estímulo-CD40 e do tipo de estirpe do rato utilizado, rendendo também na geração eficiente de células CD40 de murino B ativadas. Ahmadi et al. têm mostrado resultados semelhantes para fibroblastos de rato transfectadas com murino CD40 ligante. Nesta apresentação contexto de xeno-antígeno pode ser excluída com certeza, mas estudos intensivos em matéria de segurança e toxicidade in vivo não deu sinais de inflamação ou auto-imunidade reaç...

A. Preparação de Media: <table border="1"><tbody><tr><td> Alimentador celular médio do tipo selvagem </td><td> Alimentador meio de seleção de célula </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentração </td><td> Reagente </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 300 mcg / mL </td><td> L-Glutamina </td><td> 300 mcg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mcg / mL </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mcg / mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Higromicina B </td><td> 0,2 mg / mL </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B médio de lavar </td><td> mCD40-B meio de cultura </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentração </td><td> Reagente </td><td> Concentração </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 580 mcg / mL </td><td> L-Glutamina </td><td> 580 mcg / mL </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 4,5 mg / mL </td><td> Glicose </td><td> 4,5 mg / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mcg / mL </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mcg / mL </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 mM (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Diversos Reagentes: <table border="1"><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Despacho n. </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Cat Não H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Selecione Delta </td><td> Arte Sem 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Cat Não DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampão HEPES </td><td> PAA </td><td> Cat Não S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> PAA </td><td> Cat Não P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinante murino Interleucina-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat Não 12340045 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A </td><td> Novartis </td><td> Cat Não NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> Fontes C. Diversos: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Despacho n. </td></tr><tr><td> Pipeta estéril dicas </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-bem placa </td><td> NUNC </td><td> Não Cat 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tubo cônico </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Não Cat 352070 </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> Cat Não 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

modelo murino de cd40-ativação de células b

Murine Model of CD40-activation of B cells

A investigação sobre células B CD40 mostrou que melhora a sua capacidade de ativação apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L), células B humano pode ser expandido sem dificuldades a partir de pequenas quantidades de sangue periférico dentro de 14 dias para grandes quantidades de altamente pura CD40 células-B (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Células por paciente) de doadores saudáveis, bem como pacientes com câncer<sup&gt; 04/01</sup&gt;. Células CD40-B expressam moléculas linfáticos importante nó de homing e podem atrair células T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Além disso, eles ocupam de forma eficiente, processar e apresentar antígenos às células T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Células CD40-B se mostraram não só ingênua prime, mas também expandir células T de memória<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Portanto CD40-ativação de células B (CD40-células B) têm sido estudadas como uma fonte alternativa de imuno-estimulantes células apresentadoras de antígenos (APC) para a célula-base immunotherapy1, 5,10. A fim de estudar ainda mais se as células CD40-B induzir eficazes respostas de células T in vivo e estudar o mecanismo subjacente foi estabelecido um sistema de cultura celular para a geração de células CD40 de murino B ativadas. Usando esplenócitos ou purificada de células B de camundongos C57BL / 6 para CD40-ativação, as condições ideais foram identificados da seguinte forma: A partir de esplenócitos de camundongos C57BL / 6 (haplótipo H-2b) linfócitos são purificados por gradiente de densidade centrifugação e co-cultivados com HeLa células que expressam recombinante ligante CD40 de murino (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Células são recultured cada 3-4 dias e componentes-chave, como CD40L, a interleucina-4, Mercaptoetanol e ciclosporina A são reabastecidos. Neste protocolo que demonstrar como obter totalmente ativado murino CD40-B células (mCD40B) com semelhante APC-fenótipo CD40 humano para células-B (Fig. 1a, b). CD40-estimulação leva a um resultado rápido e expansão de alta pureza (&gt; 90%) CD19 + células B no prazo de 14 dias de cultura de células (Fig 1c, d). Para evitar a contaminação com os não-transfectadas células, a expressão do ligante CD40 de murino na transfectants tem que ser controlado regularmente (Fig. 2). Murino células CD40-activated B pode ser usado para estudo de células B de ativação e diferenciação, bem como para investigar seu potencial para funcionar como APC in vitro e in vivo. Além disso, eles representam uma ferramenta promissora para o estabelecimento de vacinação terapêutica ou preventiva contra tumores e vai ajudar a responder questões relativas à segurança e imunogenicidade desta abordagem<sup&gt; 12</sup&gt;.

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Pesquisas sobre as células B demonstraram que a ativação do CD40 melhora a sua capacidade de apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e ligante de CD40...

Olá, meu nome é Tanya Wig e sou estudante de doutorado, trabalhando no laboratório de imunologia tumoral e imunologia de transplantes do Hospital Universitário de Colônia. Meus estudos focam principalmente em células B ativadas por CD40 humanas e sua capacidade de induzir respostas imunes in vivo. Originalmente, as células B humanas CD40 foram geradas como alternativa às células dendríticas como células apresentadoras de antígeno.Essas células têm como objetivo ser utilizadas para fins imunoterapêuticos. Em ambientes clínicos, as células B CD40 são geradas sob sinalização CD40 e estimulação com IL-4. De acordo com este sistema, elas podem ser expandidas por várias semanas. Após otimizar a geração de células B CD40 humanas a partir de PBMCs em nosso laboratório, transferimos esse princípio com sucesso para camundongos, e é isso que quero mostrar a vocês hoje.Partindo do baço, geramos células B ativadas por CD40 murinas em 14 dias de cultura celular. Os principais passos são a preparação das células alimentadoras; para isso, utilizamos uma linhagem celular Heer transfectada com o ligante murino de CD40, que é aderente, irradiada com 78 gray e semeada em placas de seis poços. Em segundo lugar, iniciamos a cultura de células B murinas CD40 utilizando esplenócitos recém-purificados de camundongos C57BL/6, que são tratados com interleucina-4 murina, beta-macroglobulina e etanol, além de ciclosporina A. Essas células são então transferidas para as células alimentadoras irradiadas em placas de seis poços.Este procedimento é repetido a cada três a quatro dias até o dia 14 do cultivo celular. Para obter linfócitos B ativados por CD40 marinhos altamente puros, iniciamos a geração de linfócitos B ativados por CD40 marinhos utilizando esplenócitos purificados recentemente de camundongos LXi. Primeiro, lavamos os esplenócitos ressuspendendo as células em 50 mililitros de meio de lavagem para linfócitos B CD40 marinhos.Em seguida, centrifugue as células por sete minutos a 1300 RPM, correspondendo a 260 ×g, para determinação da contagem celular. Reuspenda completamente as células em 10 mililitros de meio de lavagem marinho CD 40 B e, por fim, homogeneíze as células por vortex. Em seguida, determine a contagem celular.Centrifugue a quantidade necessária de células por sete minutos a 1300 RPM, correspondendo a 260 ×g, utilizando uma placa de seis poços. São necessárias cinco vezes 10 à sexta potência de células por poço, ou seja, 30 vezes 10 à sexta potência de células por placa. Suspender a quantidade necessária em 1,25 vezes 10 à sexta potência de células por mililitro em meio de cultura Marine CD40B.Em seguida, suplemente frescamente a suspensão celular com IL marina quatro numa concentração de uma unidade por mililitro para estimulação, ciclosporina A numa concentração de 0,63 micrograma por mililitro para inibir o crescimento de células T e 100 micromolar de Beamer CAPTA etanol. Agora, a suspensão celular está pronta para estimulação com células feer. Estamos utilizando células healer transfectadas com ligante marinho de CD40 para estimular a sobrevivência, diferenciação e proliferação celular, já que a linhagem celular heer pode sobreviver em cultura por vários meses.A perda da expressão do ligante CD40 marinho deve ser excluída regularmente por meio de fox. O ligante CD40 transfectado é uma linhagem celular aderente cultivada a 37 graus com 5% de CO2 em meio de seleção suplementado com vitamina B numa concentração de 0,2 miligrama por mililitro. Para seleção, esta linhagem celular epitelial aderente nunca deve ficar completamente confluente e deve ser repicada duas vezes por semana para dividir as células aderentes.Aspire o meio, lavando uma vez com 10 mililitros de PBS. Gire suavemente e adicione quatro mililitros de tripsina-EDTA em um frasco de 75 centímetros quadrados. Incube o frasco por cinco a 10 minutos a 37 graus no incubador.Retire o frasco novamente. Use batidas suaves para destacar as células do plástico. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio biotipo, gire suavemente e transfira as células para um tubo de 50 mililitros.Centrifugar as células alimentadoras por sete minutos a 1300 RPM, correspondendo a 260 ×g. Suspender cuidadosamente as células em pellet em 10 mililitros de meio selvagem para determinar a contagem celular para a subcultura; semear 2,5 vezes 10 à sexta potência de células em 10 mililitros de meio de seleção e transferi-las para um frasco de 75 centímetros quadrados, incubando as células alimentadoras a 37 graus Celsius em 5% de CO₂ para estimulação do CD40. Coletar o restante das células alimentadoras e irradiá-las letalmente com 78 Gy para impedir sua proliferação.Dilua as células de suporte em meio do tipo selvagem com uma densidade celular de 0,2 vezes 10⁶ células por litro e plaque dois mililitros por poço em uma placa de seis poços. Deixe as células aderirem novamente antes de usá-las como células estimuladoras, incubando-as por 24 horas a 37 °C e 5% CO₂ para estimulação de células com ligante próximo ao CD40. Verifique ao microscópio se as células de suporte plaqueadas um dia antes estão aderidas.Se as células de apoio forem aderentes, remova cuidadosamente o SUP natin de cada poço, em seguida transfira suavemente quatro mililitros da suspensão de células SPOC, que foi ajustada para 1,25 × 10⁶ células por mililitro pouco antes, para cada poço para estimulação, e incube a placa a 37 graus e 5% CO₂. No quarto dia, subcultive novamente as células B CD40 murinas para a primeira subcultura de células B CD40 ativadas no dia quatro e para subculturas subsequentes a cada três a quatro dias. Colete suavemente as células agrupadas da placa de seis poços por ressuspensão com uma pipeta de 10 mililitros. Reúna as células B CD40 murinas em um tubo de 50 mililitros e centrifugue as células por sete minutos a 1300 RPM, correspondendo a 260 × g, trocando completamente o meio pelo meio de lavagem para células B CD40 murinas.E para determinar a contagem celular de linfócitos B CD40 marinhos, suspendemos os linfócitos B CD40 marinhos numa densidade celular de 0,75 × 10⁶ células por mililitro em meio de cultura para linfócitos B CD40 marinhos. Em seguida, suplementamos a suspensão celular com IL-4 marinha fresca numa concentração de uma unidade por mililitro, ciclosporina A numa concentração de 0,63 µg/mL e 100 micromolar de beam up em etanol. É claro que as células alimentadoras irradiadas precisam novamente ser verificadas quanto à aderência ao microscópio imediatamente antes do uso.Se as células de suporte forem aderentes, remova cuidadosamente o sobrenadante de cada uma. Em seguida, transfira a suspensão de células B CD40 marinhas preparada pouco antes para cada poço, para estimulação. A subcultura é repetida de forma idêntica após três a quatro dias, duas vezes por semana, até se obterem células B CD40 ativadas marinhas altamente puras no dia 14 do cultivo.Neste momento, os linfócitos B CD40 marinhos expressam moléculas coestimuladoras como CD80, CD86 e moléculas MHC classe I e II, que podem ser verificadas por Fox durante a geração. As células que geramos agora podem ser utilizadas para pesquisas sobre ativação, diferenciação e função dos linfócitos B, por exemplo, para investigar seu potencial uso com finalidades imunoterapêuticas.

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Geração de humanos CD40-activated células B

Neste vídeo, demonstramos a ativação de macrófagos derivados da medula óssea em resposta ao lipopolissacarídeo bacteriano e imunoglobulina intravenosa.

Ativação de macrófagos derivados de medula óssea de camundongo em resposta a anticorpos

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir inflamação colônica em camundongos por transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB singênicas para receptores deficientes em células T e B. As características clínicas e histopatológicas mimetizam as doenças inflamatórias intestinais humanas. Este método permite o estudo do início da inflamação colônica e da progressão da doença.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

O protocolo detalha um modelo in vitro da carcinoma murino do alongamento defeituoso não-genético da transcrição. Aqui, a inibição crônica do CDK9 é usada para reprimar o alongamento produtivo do RNA Pol II ao longo dos genes de resposta pró-inflamatória para imitar e estudar o fenômeno TEdefinitivamente superatendido, presente em cerca de 20% de todos os tipos de câncer.

Uma linha celular murine baseou o modelo da inibição CDK9 crônica para estudar defeitos não-genéticos difundidos do alongamento do transcriptional (TEdefinitivamente) nos cancros

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

Aprenda a ativar e expandir células B murinas de esplenócitos de camundongos C57BL/6 usando sinalização de CD40 e IL-4. Este método permite gerar células apresentadoras de antígenos para estudos de imunologia e imunoterapia.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

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