Ativação de macrófagos derivados de medula óssea de camundongo em resposta a anticorpos

Após a exposição ao patógeno, os macrófagos sofrem ativação e liberam citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, coordenando a resposta do sistema imunológico.

Para estudar a ativação de macrófagos derivados da medula óssea in vitro, transfira uma suspensão isolada de células da medula óssea de camundongo para um frasco de cultura. Incube brevemente.

As células mesenquimais, monócitos e macrófagos maduros aderem à superfície do frasco, enquanto os progenitores hematopoiéticos permanecem em suspensão.

Recolha os meios contendo progenitores hematopoiéticos e centrifugue. Transferir as células ressuspensas em meio de fator estimulador de colónias de macrófagos, M-CSF, para um frasco de cultura.

O M-CSF faz com que a subpopulação progenitora mieloide se diferencie em macrófagos, que parecem ramificados e aderem ao frasco.

Descarte o meio que contém células não aderentes. Adicione o meio M-CSF e incuba. Quando os macrófagos atingirem seu estado totalmente funcional, colha-os. Centrifuga.

Macrófagos de placas ressuspensos em meio M-CSF em poços de placas de vários poços. Após a adesão dos macrófagos aos poços, adicione imunoglobulinas policlonais humanas e lipopolissacarídeo bacteriano, LPS, uma toxina.

As imunoglobulinas se ligam a receptores FCγ específicos, enquanto o LPS se liga a receptores do tipo Toll em macrófagos. Essa co-estimulação impulsiona a ativação anti-inflamatória de macrófagos por meio de cascatas de sinalização a jusante, causando a liberação de altos níveis de citocinas anti-inflamatórias e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias.

Colete o meio contendo citocinas para análise adicional para confirmar a ativação dos macrófagos.

Prenda um rato sacrificado em decúbito dorsal em uma placa de espuma com os membros estendidos e, em seguida, limpe as pernas com etanol a 70%. Em seguida, faça um corte raso com cerca de 2 milímetros de profundidade para remover a pele e o pelo da superfície de cada pata traseira. Em seguida, disseque os tecidos para acessar as tíbias e fêmures.

Para remover as tíbias e fêmures, corte o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos. Em seguida, remova o máximo possível do tecido muscular dos ossos. Em seguida, limpe os ossos com etanol a 70% e deixe evaporar por 1 minuto, depois coloque os ossos em uma placa de 6 poços cheia de meio de descarga óssea.

Na placa, apare 1 milímetro de cada extremidade dos fêmures para que suas cavidades internas fiquem expostas. Certifique-se de que uma agulha de calibre 26 possa acessar as cavidades. Em seguida, separe a tíbia e o fêmur da articulação do joelho. Em seguida, insira a agulha presa a uma seringa de 10 mililitros em uma cavidade óssea e colete a medula óssea.

Agrupe a medula óssea de todos os 4 ossos em um tubo cônico de 50 mililitros com 5 mililitros de meio de descarga óssea. Pipete o meio e a medula para cima e para baixo várias vezes, ou vórtice em baixa velocidade para dispersar suavemente os aglomerados na suspensão. Os fios de medula devem ser quebrados em pequenas manchas de medula com menos de meio milímetro de comprimento.

Em seguida, complete o tubo com 50 mililitros com meio de descarga óssea e transfira-o para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados. Incube a medula óssea por uma hora. Durante a incubação, as células amadurecidas irão aderir ao frasco e os progenitores hematopoiéticos desejados permanecerão em suspensão. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros e gire as células em um pellet.

Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mililitros de meio de cultura MCSF. Em seguida, ajuste a densidade da célula para 500.000 por mililitro e carregue 30 mililitros em um novo frasco de 75 centímetros quadrados. Continue cultivando as células e, nos dias 4, 7 e 10, verifique se as células estão aderentes e ligeiramente ramificadas usando um microscópio de campo claro de contraste de fase invertida.

Ao verificar as células, descarte o meio que contém as células não aderentes. Em seguida, lave as células aderentes com IMDM uma vez e adicione 30 mililitros de meio de cultura MSCF fresco de volta ao frasco. No dia 10, substitua o meio por 8 mililitros de tampão de dissociação celular à base de EDTA sem enzimas para coletar as células. Incube as células brevemente, em seguida, raspe as células suavemente e verifique se elas foram liberadas usando um microscópio.

Assim que as células forem liberadas, transfira o tampão com as células para um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, enxágue o frasco três vezes com 5 mililitros de IMDM para coletar mais células. Agrupe todas as coleções, centrifugue-as e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de MCSF. Agora, conte as células e ajuste sua concentração para 1 milhão por mililitro.

Em seguida, coloque 100 microlitros de suspensão de células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços. O prato inteiro deve ser preenchível. Cultive as células por cerca de uma hora até que estejam aderentes. Em seguida, estimule-os com diferentes concentrações de LPS ou imunoglobulina intravenosa ou ambas, preparadas no IMDM. Realize todas as manipulações em duplicata ou triplicata e certifique-se de manter os controles não tratados, em seguida, incube as células por 24 horas e analise os sobrenadantes.