Colheita de subpopulações leucêmicas: um método para separação espacial de subpopulações de células leucêmicas da co-cultura 2D

- Quando as células leucêmicas são co-cultivadas com células estromais mesenquimais, elas interagem com as células estromais e formam três subpopulações. Células suspensas flutuantes livremente, células brilhantes de fase aderentes à superfície da monocamada mesenquimal e células de fase fraca abaixo da monocamada mesenquimal. Para separar cada subpopulação, pegue uma placa de cultura de tecidos com uma monocamada de células estromais mesenquimais.

Semeie células leucêmicas presentes em meios de cultura específicos do tumor na monocamada e incube a placa pela duração desejada. Em seguida, colete as células tumorais em suspensão, pipetando as células flutuantes em um tubo separado. Agora, adicione o meio fresco à placa e pipete vigorosamente para desalojar as células tumorais brilhantes da superfície da monocamada mesenquimal.

Colete essas células pipetando-as em um tubo separado. Adicione tripsina à placa para remover as células mesenquimais aderentes. Adicione soro fetal bovino, ou FBS, para interromper a ação da tripsina e quebrar os agregados celulares. Agora, colete as células de fase fraca em um tubo. Centrifugue os três tubos contendo diferentes subpopulações celulares individualmente e ressuspenda o pellet em meio fresco para análise posterior. No protocolo a seguir, isolaremos células leucêmicas em suspensão, fase brilhante e fase escura da co-cultura 2D.

- Para colher a subpopulação de tumor suspenso, aspire o meio da placa de co-cultura de células leucêmicas e use o mesmo meio para enxaguar suavemente a placa uma vez. Em seguida, transfira a subpopulação de células leucêmicas de suspensão flutuante para um tubo cônico de 15 mililitros. Para colher a subpopulação tumoral de fase brilhante, adicione 10 mililitros de meio fresco de volta à placa de co-cultura

e enxágue aproximadamente cinco vezes vigorosamente o suficiente, para remover as células leucêmicas aderentes sem desalojar a monocamada de células aderentes. Em seguida, transfira a subpopulação de fase brilhante para seu próprio tubo cônico de 15 mililitros. Para colher a subpopulação tumoral de fase reduzida, remova o meio restante com um enxágue PBS de um mililitro e retire as células com três mililitros de tripsina a 37 graus Celsius.

Após cinco minutos, bata suavemente nas laterais da placa para desalojar as células aderentes, seguido pela adição de um mililitro de FBS para interromper a reação enzimática. Em seguida, enxágue o soro três a cinco vezes para separar quaisquer agregados de células grandes e transfira a subpopulação de fase não purificada para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Quando todas as subpopulações tiverem sido coletadas, gire as células e ressuspenda cada um dos pellets em um mililitro de meio pré-aquecido.