Avaliação das interações bactéria-célula hospedeira usando esferas biomiméticas

Pegue uma placa de vários poços contendo uma cultura de células epiteliais de mamíferos.

Nos poços de teste, adicione um patógeno bacteriano junto com grânulos de polímero acoplados a proteínas de superfície bacteriana.

Nos poços de controle, adicione o patógeno e as esferas sem proteínas de superfície bacteriana. Incubar.

Nos poços de teste, os grânulos imitam a superfície bacteriana e competem com o patógeno pela ligação ao ácido fosfatídico da membrana celular epitelial, reduzindo a fixação bacteriana.

Nos poços de controle, os grânulos não afetam a fixação bacteriana.

Remova a mídia e lave com tampão para eliminar os componentes não ligados.

Incube com um detergente não iônico para lisar as células, liberando bactérias e grânulos ligados à membrana.

Pipetar o lisado para criar uma suspensão homogénea e diluir em série o homogeneizado utilizando tampão.

Transfira as diluições para placas de ágar, incube para permitir a formação de colônias e conte as colônias.

A placa de teste exibe menos colônias do que os controles, indicando interações bactéria-hospedeiro reduzidas.

Prepare o meio de infecção diluindo culturas bacterianas em DMEM incolor sem aditivos.

Pré-aquecido a 37 graus Celsius contendo 10% de volume a volume de suspensão de cordão. Para dar um MOI de 10, prepare um mililitro por poço e 10 a 20% de excesso de volume por amostra. Remova o meio antigo dos poços e lave as células HeLa cultivadas adicionando a cada poço um mililitro de PBS estéril pré-aquecido a 37 graus Celsius. Remova o PBS e adicione um mililitro de meio de infecção por poço. Adicione soluções contendo esferas de controle e bactérias como controles positivos e esferas de adesão e nenhuma bactéria como controles negativos.

Adicione DMEM contendo 0,1% Triton X 100 como controles de lise.

Incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius pelo tempo desejado.

As medições da adesão bacteriana são feitas uma hora após a infecção. Remova a mídia da camada de células e lave bem a camada de células com PBS pré-aquecido estéril para remover quaisquer células soltas. Lave pelo menos três a quatro vezes com um mililitro de PBS de cada vez. Lisar as células hospedeiras adicionando a cada poço um mililitro de uma solução estéril de Triton X 100 a volume a 1% em PBS. Incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Pipete cada amostra para cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para tubos separados de 1,5 mililitro. Preparar diluições seriadas dez vezes das amostras em PBS estéril. Coloque 100 microlitros de cada amostra em ágar LB marinho e espalhe usando um espalhador de células. Otimize qual diluição colocar em placa, dependendo das cepas bacterianas e do ponto de tempo.

Para esta configuração experimental, uma diluição de 10 elevado a quinto ou 10 elevado a sexta vezes dará um número adequado de UFC. Incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, enumere as bactérias por contagem de colônias.