Microscopia microfluídica de lapso de tempo para estudar a persistência de antibióticos em bactérias

Comece com células bacterianas em crescimento exponencial expressando uma proteína de fusão de ligação ao DNA marcada com fluorescência para visualizar o nucleóide.

Adicione as células às entradas de células de uma placa microfluídica pré-preparada.

Em seguida, introduza meios contendo antibióticos e meios livres de antibióticos em entradas de solução separadas.

Sele a placa, monte-a na platina do microscópio e inicie a imagem de lapso de tempo.

Primeiro, carregue as células na câmara de cultura.

Em seguida, perfunda meios livres de antibióticos na câmara para apoiar o crescimento celular exponencial.

Por fim, introduza o meio contendo antibióticos.

O antibiótico induz quebras de DNA de fita dupla, matando células suscetíveis. Essas células exibem nucleóides compactados e não replicantes com fluorescência estável.

Volte para meios livres de antibióticos para promover a recuperação.

As células persistentes - uma pequena subpopulação que sobrevive ao tratamento com antibióticos - retomam a replicação, alongam e dividem o DNA.

Essa recuperação leva ao aumento da fluorescência nas células persistentes, permitindo que elas sejam visualmente distinguidas das células suscetíveis.

Remova a solução de conservação de cada poço da placa microfluídica e substitua-a por meio de cultura fresco. Sele a placa microfluídica com o sistema manifold clicando no botão Seal ou através do software microfluídico.

Em seguida, na interface do software microfluídico, execute uma primeira sequência de escorva clicando em Executar sequência de escorva líquida. Incube a placa em um gabinete do microscópio controlado termostaticamente a 37 graus Celsius por no mínimo duas horas antes de iniciar a imagem microscópica. Em seguida, inicie uma segunda sequência de escorva líquida antes de iniciar o experimento.

Sele a placa microfluídica clicando em Unseal Plate na interface do software microfluídico. Substitua o meio nos poços por 200 microlitros de meio fresco, antibiótico contendo meio fresco e 0,01 OD de amostra de cultura diluída no meio fresco. Depois de selar a placa microfluídica conforme demonstrado anteriormente, coloque a placa na objetiva do microscópio dentro do gabinete do microscópio.

No software microfluídico, clique em Executar Sequência de Carregamento de Célula para permitir o carregamento das células na placa microfluídica. Defina um foco ideal usando o modo de luz transmitida e selecione várias regiões de interesse onde um número de células apropriado de até 300 células por campo pode ser observado. No software microfluídico, edite a Executar uma sequência personalizada para programar a injeção de meio fresco a 6,9 quilopascais por seis horas para os poços um e dois, seguido pelo meio contendo antibiótico a 6,9 quilopascais por seis horas para o poço três e, finalmente, o meio fresco a 6,9 quilopascais por 24 horas para os poços quatro e cinco.

Realize imagens de microscopia no modo de lapso de tempo com um quadro a cada 15 minutos usando luz transmitida e a fonte de luz de excitação para o repórter fluorescente e inicie o programa microfluídico. Abra o software ImageJ ou Fiji no computador e arraste as imagens de microscopia de lapso de tempo hyperstack para a barra de carregamento Fiji. Use Image, seguido por Color e, em seguida, Make Composite para fundir os diferentes canais do hyperstack.

Use Imagem, Cor e Organizar Canais se os canais não corresponderem à cor desejada. Abra o plug-in MicrobeJ e detecte as células bacterianas usando a interface de edição manual. Exclua as células detectadas automaticamente e contorne manualmente as células persistentes de interesse quadro a quadro.

Após a detecção, use o ícone Resultado na interface de edição manual do MicrobeJ para gerar uma tabela ResultJ. Use a tabela ResultJ para obter insights sobre diferentes parâmetros de interesse da análise de célula única e salve o arquivo ResultJ.