Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Общей целью данной процедуры является получение высококачественных кристаллов мембранного белка для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии. Это достигается путем восстановления белка в мембране липической кубической фазы и инкубации с раствором осадителя, который индуцирует зарождение и рост кристаллов из-за огромного размера пространства кристаллизации и ограниченной обратной связи от экспериментов по кристаллизации. Восстановление флуоресценции липической кубической фазы после PHOTOBLEACHING или кристаллизационного анализа LCP Frap Prec было разработано для выбора наиболее перспективных условий кристаллизации.

Этот анализ уменьшает объем скрининга и увеличивает шансы получения начальных кристаллизационных ударов. Как только будут найдены первые попадания, будут организованы испытания по оптимизации, чтобы улучшить рост кристаллов. Наконец, оптимизированные кристаллы собирают и замораживают в жидком азоте для сбора данных на синхротронном источнике.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективном использовании анализа LCP FRA для получения исходных кристаллов BE two two adrenergiacor в LCP, дальнейшая оптимизация которых привела к получению кристаллов дифракционного качества. Этот метод использует преимущества нативной мембранной среды, обеспечиваемой повторяющейся кубической фазой, и обычно приводит к получению кристаллов с низким содержанием раствора и лучшей порядочностью по сравнению с кристаллизационными и моющими растворами. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за высокой вязкости липидных массовых фаз на Гаити, что затрудняет работу с этими материалами.

Однако при использовании правильных инструментов и освоении техники эта процедура не сложнее, чем любой другой метод кристаллизации белка, и поддается автоматизации и высокой производительности. Итак, приступим. Очистите интересующий мембранный белок в растворе детергента и сконцентрируйте белковые моющие комплексы примерно до 10-20 миллиграммов на миллилитр.

Перенесите около 25 миллиграммов липида хозяина или липидной смеси в пластиковую пробирку и инкубируйте при температуре 40 градусов Цельсия в течение нескольких минут, пока липид не растает. Затем прикрепите шприцевую муфту к герметичному шприцу объемом 100 микролитров. Загрузите в шприц расплавленный липид с помощью пипетки с регулируемым объемом.

Запишите объем липидов в шприц, загрузите еще 100 мкл шприца с достаточным количеством раствора белка, чтобы в результате соотношение белкового раствора к липидам составляло два-три объема по объему. Соедините оба шприца вместе с помощью соединительной муфты для шприца. Поочередно нажимайте на поршни шприца, чтобы перемещать липиды и белок через внутреннюю иглу соединителя вперед и назад, пока липидная мезофаза не станет однородной.

LCP образуется спонтанно при механическом смешивании, и белок восстанавливается в липидном бислое LCP. Образование ЛЦП может быть проверено по его прозрачной и гелеобразной консистенции, а также по отсутствию двойного лучепреломления при рассмотрении под микроскопом, оснащенным кросс-поляризаторами, или, по возможности, с помощью малоугловой рентгеновской дифракции. Чтобы начать анализ LCP FRAP, пометьте белок флуоресцентной диетой с соотношением белка к умиранию примерно 100 к одному, как описано в письменном протоколе.

Удалите нереактивный краситель и сконцентрируйте белок примерно до одного миллиграмма на миллилитр. Затем восстановите меченый белок в LCP таким же образом, как это делается для немеченого белка. Установите пробирные пластины.

Использование решений для просеивания пленки LCP. Сначала переложите насыщенный белком LCP в газоплотный шприц объемом 10 микролитров, прикрепленный к дозатору повторяющегося шприца, затем прикрепите короткую съемную иглу к шприцу объемом 10 микролитров. Диспонируйте 200 нанолитровых болюсов LCP на поверхность четырех соседних лунок, образуя квадратное наложение два на два каждого из болюсов LCP с одним микролитром соответствующего просеивающего раствора LCP FRA.

После того, как раствор для грохочения будет дозирован, закройте четыре загруженные лунки стеклянной крышкой размером 18 мм квадратного сечения. Слегка надавите на крышку, чтобы герметизировать лунки. Повторите этот процесс для следующего набора из четырех лунок, пока вся пластина не будет заполнена.

После заполнения накройте тарелку фольгой. Инкубируйте пластины при температуре 20 градусов Цельсия не менее 12 часов. Чтобы достичь равновесного состояния, поместите одну из пластин на станцию LCP Frap и сфокусируйтесь на первой скважине, используя объектив 10-кратного увеличения.

Сбор данных frap выполняется автоматически с помощью скрипта image pro, в котором пользователь сначала вводит все параметры сбора, а затем нажимает кнопку «Пуск». Типичная последовательность сбора данных начинается с записи пяти предварительно отбеленных изображений, затем запускается лазер отбеливания, синхронизированный с потоковой передачей, и выполняется быстрая последовательность восстановления примерно из 200 изображений с максимально возможной скоростью, за которой следует медленная последовательность восстановления из 50 изображений с интервалами от одной до 20 секунд между изображениями в зависимости от скорости диффузии белка. После завершения сбора данных интегрируйте интенсивность внутри пятна обесцвечивания и для опорных точек, расположенных за пределами области лазерного обесцвечивания, во всех кадрах скорректируйте.

Интегрированная кривая интенсивности для отклонений, вызванных колебаниями света и обесцвечиванием во время сбора данных, нормализует скорректированную интенсивность, чтобы сделать интенсивность предварительного обесцвечивания равной единице, а начальную интенсивность обесцвечивания равной нулю, подогнана к кривой нормализованной интенсивности от времени, как описано в письменном протоколе, для получения подвижной фракции и коэффициента диффузии. Повторите эту процедуру для следующего, хорошо сравните подвижные фракции и коэффициенты диффузии, полученные для различных условий грохочения. Разработать экраны кристаллизации nu на основе компонентов, способствующих диффузии белка, и исключить условия, при которых диффузия белка не наблюдалась, для проведения испытаний кристаллизации LCP.

Восстановите белок в LCP, как и раньше, затем установите кристаллизационные планшеты как для LCP frap, но с помощью растворов для кристаллизационного скрининга. В качестве альтернативы испытания кристаллизации могут быть организованы с помощью робота после подготовки кристаллизационных планшетов, инкубировать их при постоянной температуре, периодически проверяя образование и рост кристаллов. После того, как кристаллы белка вырастут, поместите планшет с кристаллами под стереомикроскоп с переменным зумом, оснащенный линейным вращающимся поляризатором и анализатором.

Сфокусируйтесь на интересующем вас колодце с помощью маломощного зума, чтобы весь колодец находился в поле зрения. Надрежьте крышку стекла в четыре приема, сделав квадрат внутри границы скважины с помощью острого угла из керамического капиллярного режущего камня. Прижмите по периметру надрез сильным пинцетом с острым концом, чтобы распространить царапины по толщине крышки.

Стеклом пробейте два небольших отверстия в противоположных углах надрезанного квадрата. Введите несколько микролитров раствора осадка через одно из отверстий, чтобы уменьшить обезвоживание во время последующих этапов. С помощью наклонного острого игольчатого щупа разбейте стекло с одной или двух сторон, чтобы освободить вырезанный квадрат.

Осторожно поднимите стеклянный квадрат, наблюдая за болюсом кубической фазы. Добавьте дополнительно несколько микролитров раствора осадителя, дополненного криопротектором, при необходимости поверх экспонированного кубического фазового кома в лунку увеличьте увеличение микроскопа и сфокусируйтесь на кристалле. Отрегулируйте угол между поляризатором и анализатором, чтобы увеличить контраст между первым кристаллом и фоном, сохраняя при этом достаточно света, чтобы увидеть контур сбора урожая.

Затем удалите излишки липидов и соберите кристалл непосредственно из LCP, зачерпнув его в мощное gen-микрокрепление, которое было выбрано таким образом, чтобы его диаметр соответствовал размеру кристаллической вспышки. Заморозьте микрометровую монтировку вместе с собранным кристаллом в жидком азоте и отправьте его на синхротронный источник для сбора рентгеновских данных, сконструированный бета-2-адренергический рецептор был помечен S-SI-3 NHS-эфиром NHS и использован в анализах кристаллизации LCP Frep prec в автоматическом высокопроизводительном режиме, в котором каждый образец 96-луночного планшета последовательно отбеливается, а восстановление флуоресценции измеряется после 30-минутной инкубации. Для всех 96 образцов построены полученные флуоресцентные рекуперации, представляющие собой подвижную фракцию в каждом образце.

Просеивающие растворы содержат 0,1 моляра с pH 8 30% по объему PEG 400 в сочетании с 48 различными солями в двух разных концентрациях. Показаны профили восстановления флуоресценции для нескольких репрезентативных условий. Сплошные линейные кривые представляют собой аппроксимации нормализованной интенсивности в зависимости от времени: быстрое восстановление менее 10% в образце, содержащем хлорид натрия, обусловлено флуоресцентно меченными липидами.

Соочищенные с помощью белка начальные кристаллические удары бета-двух адренорецепторов в комплексе с ололом были получены методом грубого сетчатого скрининга вокруг наиболее перспективных условий, выявленных с помощью LCP Frap, содержащего сульфат натрия и формиат натрия. Дальнейшая оптимизация условий осаждения позволяет получить дифракционное качество кристаллов. Здесь изображения кристаллов, выращенных в присутствии сульфата натрия и формиата калия, сделаны в режиме светлого поля.

Эти же кристаллы можно просматривать и с помощью кросс-поляризаторов. После освоения восстановительный белок в липидных кубических фазах может быть завершен в течение 10-15 минут, а ручная настройка 96-луночного кристаллизационного планшета в течение одного часа. Процедуры, показанные в этом видео, дают общее руководство по подходу к испытаниям кристаллизации музыки.

Однако, как и в любом эксперименте по кристаллизации, требуется обширный скрининг и оптимизация, и успешный результат не обязательно гарантирован.