In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein in vivo Elektroporationsexperiment an neonatalen Mäusen durchzuführen, um genetisches Material stabil in die Zellen der Netzhaut einzubringen. Dies wird durch eine erste Anästhesie erreicht, bei der eine neugeborene Maus etwa fünf bis 10 Minuten lang auf Eis knallt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Verbindung der verschmolzenen Augenlider zu identifizieren und das Auge zu öffnen, indem entlang dieser Verbindung geschnitten wird.

Anschließend wird ein Schnitt im Auge gemacht, um das Einführen der Mikroinjektionsspritze zu erleichtern. Die Mikroinjektionsspritze wird dann durch den Schnitt eingeführt und die DNA-Lösung in den subretinalen Raum injiziert. Schließlich wird eine Pinzettenelektrode auf den Kopf des Pops gesetzt und eine Reihe von elektrischen Impulsen abgegeben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der retroviralen Transduktion besteht darin, dass bei der In-vivo-Elektroporation keine biologischen Wirkstoffe als Werkzeuge für die Genübertragung erzeugt und gehandhabt werden müssen. Infolgedessen erfordert die Technik weniger Arbeit, weniger Reagenzien und kann an jedem Arbeitsplatz durchgeführt werden, der für Tierversuche zugelassen ist. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Technik sind, Schwierigkeiten haben, da es Zeit und Wiederholung braucht, um ein Gefühl für die Platzierung der Mikroinjektionsspritze in den subretinalen Raum zu entwickeln.

Jimmy DeMilo, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Da die für die Elektroporation erforderliche DNA-Konzentration relativ hoch ist, wird die gewünschte Plasmid-DNA zunächst mit einem Maxi-Prep amplifiziert, inkompetente Zellen extrahiert, dann gereinigt und auf etwa fünf Mikrogramm pro Mikroliter konzentriert. Schneller grüner FCF-Farbstoff wird als Injektionstracer zugesetzt.

Nachdem die Plasmid-DNA präpariert wurde, werden neugeborene Mausbabys etwa fünf Minuten lang auf Eis betäubt und überwacht, bis die Bewusstlosigkeit durch Kompression der Fußballen bestätigt wird. Tauschen Sie den Bereich des Auges aus, der mit 70%igem ISOP-Profilalkohol injiziert werden soll, und verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um das FUS-Junktionalepithel zu identifizieren, wo die Augenlider zusammenkommen. Öffnen Sie das Auge vorsichtig mit einer scharfen 30-Gauge-Nadel, indem Sie entlang des verschmolzenen Verbindungsepithels schneiden, ohne übermäßigen Druck nach unten auszuüben oder über den Bereich des Augenlids hinaus zu schneiden.

Sobald das Augenlid geöffnet und das Auge freigelegt ist, machen Sie mit der Nadelspitze einen kleinen Schnitt in der Sklera in der Nähe des Übergangs zur Hornhaut, wobei Sie darauf achten, nicht zu tief einzudringen und die Linse zu durchstechen. Führen Sie die stumpfe Injektionsnadel in den Schnitt ein. Nur so lange, bis der Widerstand der gegenüberliegenden Skleralwand spürbar ist, injizieren Sie langsam 0,3 Mikroliter der viskosen DNA-Lösung in den subretinalen Raum.

Achten Sie darauf, nicht zu fest gegen die Skleralwand zu drücken, drehen Sie das Tier, um eine gleichmäßige Verteilung der DNA-Lösung in der Netzhaut zu überprüfen. Tränken Sie zunächst die Pinzettenelektrode in PBS, um die elektrische Leitfähigkeit zu maximieren. Platzieren Sie dann den Kopf des injizierten Welpen zwischen den Elektroden, wobei das injizierte Auge neben der Pluspolelektrode und das nicht injizierte Auge neben der Minuspolelektrode liegt.

Wenden Sie fünf quadratische Impulse mit einem Impulsgenerator an, wobei jeder Impuls 80 Volt und 50 Millisekunden lang ist, mit einem Intervall von 950 Millisekunden zwischen den Impulsen. Zum Schluss erwärmen Sie die Welpen unter einer Wärmelampe, bis sie sich von der Eisnarkose erholt haben. Geben Sie die elektroporierten Welpen nach der Genesung am dritten Tag nach der Geburt an ihre Mutter zurück.

Die Mehrzahl der elektroporierten EGFP-Zellen sitzt in der neuroplastischen Schicht der Netzhaut und weist keine ausgeprägten morphologischen Merkmale der differenzierten neuralen Gliazellen der Netzhaut auf. Am 14. postnatalen Tag finden sich elektroporierte Zellen in der äußeren Kernschicht und der inneren Kernschicht der Netzhaut sowie in den verschiedenen markierten Zellen. Zeigen nun charakteristische morphologische Merkmale differenzierter Neuronen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Schritte reibungslos und gleichmäßig auszuführen. Es ist sehr einfach, die Netzhaut während der Mikroinjektion zu beschädigen, und es sind Übungen erforderlich, um die manuelle Geschicklichkeit zu entwickeln, die erforderlich ist, um Gewebeschäden zu vermeiden. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Methoden, wie z. B. Immunhistochemie oder In-situ-Hybridisierung, können durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die Expression von Genen von Interesse in der Elektronetzhaut nach oben oder unten reguliert wird.