Amostragem de célula única usando microdissecção por captura a laser: uma técnica para colher células-alvo de uma população de células heterogêneas

A microdissecção por captura a laser ajuda a obter uma única célula-alvo a partir de uma mistura de células preparada em uma lâmina de vidro. Comece pegando uma lâmina de vidro adequada revestida com uma membrana bioquimicamente inerte e permeável aos raios UV em sua superfície. Exponha o slide à luz UV para torná-lo mais hidrofílico para melhor aderência celular.

Monte a lâmina em um aparelho de citocentrífuga. Adicione a suspensão celular na porta do funil do aparelho. Citocentrífuga para permitir que a força centrífuga se concentre e deposite uma monocamada de células em uma pequena área na lâmina de vidro. Deixe o slide secar ao ar.

Coloque a lâmina, com a amostra voltada para cima, sob um microscópio de microdissecção a laser. Defina a região ao redor da célula de interesse. Agora, concentre o feixe de laser para dissecar a região que contém a célula-alvo junto com o revestimento da membrana. Em seguida, desfoque o feixe de laser e pulse-o para gerar pressão. Essa energia catapulta a região microdissecada para a tampa invertida de um tubo de coleta pré-montado contendo um tampão colocado acima da lâmina.

Recupere o tubo e feche sua tampa. Gire o tubo para trazer o buffer contendo a única célula-alvo para o fundo do tubo. Refrigere o tubo até uma análise mais aprofundada.

Para a mircodissecção a laser, citocentrifugue todos os 300 microlitros de suspensão celular em uma lâmina revestida de membrana a 300 x g por 5 minutos. Em seguida, coloque a lâmina revestida de membrana em um microscópio capaz de fazer microdissecção a laser. Em seguida, pipete 4,5 microlitros de mistura mestre de lise celular na tampa do tubo de PCR de 0,2 mililitro.

Coloque a tampa acima da amostra e colha uma única célula por microdissecção a laser. Logo em seguida, verifique se há células isoladas na tampa de PCR. Remova o tubo de PCR do microscópio de mircodissecção a laser e feche o tubo. Colete todo o líquido no fundo do tubo com uma rotação curta.