Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Este protocolo utiliza uma abordagem de mancha-livre para visualizar e isolar as células de Purkinje no tecido fresco congelado do cerebelo humano post mortem através do laser microdissection de captura. O propósito do presente protocolo é gerar quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para a sequenciação do ARN.

Este protocolo é significativo, pois utiliza um método de visualização livre de manchas em vez de visualização baseada em corante no tecido cerebral humano pós-morte, o que ajuda a preservar a integridade do RNA. A preservação do RNA é uma grande vantagem neste protocolo, pois é útil, não apenas no tecido cerebral humano pós-morte, mas também em outros tipos de tecido, com alta atividade RNase. Para começar, retire o tecido do congelador e coloque-o em gelo seco para transporte ao criostat.

Coloque os pincéis limpos, o mandril e o tecido no criostat por pelo menos 20 minutos, para permitir que eles atinjam a temperatura ideal. Para criostatas com câmaras duplas e temperaturas de fixação de espécimes, coloque a temperatura do objeto em menos 16 graus Celsius e a temperatura da câmara para menos 18 graus Celsius. Coloque a espessura da seção do criostat para 14 micrômetros e a espessura do corte para 30 micrômetros.

Em seguida, limpe o palco com uma mistura de descontaminador RNase e 70% de etanol, para evitar o congelamento. Obtenha uma nova lâmina criostat descartável e limpe-a com descontaminador RNase. Coloque a lâmina limpa no suporte da lâmina no palco.

Em seguida, limpe a placa anti-rolo com o descontaminador RNase. Coloque a placa limpa no palco e espere pelo menos 20 minutos para que a lâmina e a placa anti-rolo desçam até a temperatura do criostat. Primeiro, corte um pequeno pedaço de tecido para seção, certificando-se de que a seção é aproximadamente 95% de córtex cerebelar.

Devolva o tecido restante para gelo seco, ou um para um congelador, a menos 80 graus Celsius. Em seguida, comece a adicionar lentamente OCT em cima do mandril com um movimento lento e circular. Construa camadas de OTC até que haja uma montagem de aproximadamente três milímetros de altura cobrindo o mandril.

Quando o OCT estiver parcialmente congelado, mas ainda tiver algum líquido no centro, coloque os tecidos no topo da montagem. Deixe o tecido sentar em cima do OCT por um a dois minutos até que esteja completamente congelado. Em seguida, transfira o mandril com a OCT congelada e tecido para o braço de corte criostat.

Ajuste o tecido para que ele fique alinhado com a lâmina de corte e deixe o tecido sentar no braço de corte por 20 minutos para ajustar à nova temperatura. O passo mais crítico é permitir que o tecido se aclimata no braço de corte criostat por quanto tempo necessário. Se o tecido rasgar, a visualização da célula purkinje será muito difícil.

Recomendo usar pedaços menores e mais finos de tecido, para permitir que o tecido se aclimata mais rápido. Depois disso, mova lentamente o tecido mais perto da lâmina. Uma vez que o tecido tenha atingido a lâmina, comece o processo de corte.

Corte o tecido duas a três vezes, até que as camadas do córtex sejam visíveis. Em seguida, coloque e alinhe a placa anti-rolo logo acima da lâmina criostat. Corte de quatro a seis seções de 14 micrômetros de espessura, observando que as seções cortadas adequadamente serão planas sob a placa anti-rolo.

Alinhe as seções de corte horizontalmente através do estágio criostat. Anguore um slide para pegar todos os pedaços de tecido simultaneamente. Imediatamente após a secção do tecido, coloque o slide no porta-lâminas com 70% de etanol no gelo por dois minutos.

Transfira o slide para um suporte de slides com 95% de etanol no gelo por 45 segundos. Em seguida, coloque o slide no porta-slides com 100% de etanol em temperatura ambiente por dois minutos. Mergulhe o slide três vezes no suporte de slides contendo xileno número um à temperatura ambiente.

Em seguida, coloque o slide no porta-slides com xileno dois em temperatura ambiente por cinco minutos. Levante os slides em um capô de fumaça limpa e deixe-os secar por pelo menos 30 minutos. Se armazenar os slides, coloque cada um em um tubo separado de 50 mililitros e coloque os tubos em um congelador a menos 80 graus Celsius por até sete dias.

Primeiro, use o descontaminador RNase para limpar o estágio do microscópio e o braço de coleta da tampa. Com as mãos enluvadas, coloque o slide no microscópio e uma tampa opaca de 500 microliter no braço de coleta. Em baixa ampliação, alinhe a tampa opaca sobre o tecido cerebelar, garantindo que a tampa cubra toda a área visualizada na peça ocular.

Use de cinco vezes a dez vezes o objetivo de visualizar as camadas cerebelares. Coloque o cursor sobre a seção onde a camada molecular e a camada celular granual se cruzam. Mova-se para uma ampliação 40 vezes e visualize as células purkinje.

Então, comece a capturá-los. Para iniciar a coleta de RNA após a microdisseção, adicione 50 microliters de tampão de lise celular à tampa opaca com a tampa voltada para cima. Feche cuidadosamente o tubo sobre a tampa e proceda com a coleta conforme descrito no protocolo de texto.

Neste protocolo, tecido cerebral humano fresco, congelado, pós-morte, é preparado para microdisseção de captura de laser UV. Após a secção do criostat no tempo de desenho atribuído, as camadas celulares do cerebelo são facilmente visíveis com lentes objetivas de cinco vezes e 10 vezes. Como visto aqui, a incubação adequada do xileno faz com que o tecido se torne mais escuro e melhor delineie camadas celulares do que o etanol sozinho.

Ao cortar no microscópio de captura a laser, a lente objetiva de 40 vezes é necessária para garantir a captura apenas de células purkinje e não do tecido circundante. Como visto aqui, a incubação adequada no xileno produz uma imagem morfologicamente intacta de alta qualidade quando comparada apenas à fixação do etanol. A capacidade de deslizamento de cobertura de uma tampa opaca é então testada enquanto outros protocolos utilizam uma tampa cheia de líquido, essas tampas podem reduzir a visualização do tecido e fazer com que a imagem resultante seja granular e iridescente sob o microscópio.

No entanto, a visualização através de uma tampa opaca resulta na aparência de tecido suavizada que é mais macia e mais nítida na forma. Imagens representativas de células purkinje excisadas em baixa potência e em alta potência mostram remoção precisa apenas do corpo celular purkinje. Depois disso, a Rnase de alta qualidade é obtida para sequenciamento subsequente de RNA.

Seis amostras representativas foram submetidas à extração de RNA e foram resuspengiadas em 14 microlitadores de água sem Rnase e todas as seis amostras produziram RNA de alta qualidade com números de integridade de RNA iguais ou maiores que oito. A coisa mais importante a se lembrar é que a qualidade do tecido é tudo. Mesmo a colocação de corte e slides fará ou quebrará este protocolo.

Após esse procedimento, qualquer método que investigue RNA ou DNA poderia ser realizado, especificamente sondamos nosso RNA para expressão genética diferencial, mas outras questões sobre regulação genética também poderiam ser investigadas. Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de tecido que tenha morfologia delineada específica que não exija o uso de reagentes específicos de antígeno ou corante para identificação de células de interesse. Esperamos que essa técnica nos ajude a entender a genética do tremor essencial e outras doenças que têm um fenótipo de tremor.

O produto químico mais perigoso usado neste protocolo é o xileno. Deve ser manuseado adequadamente em um capô de fumaça, descartado adequadamente, e os slides devem ser permitidos secar adequadamente até que seja usado em um espaço aberto. Além disso, ao trabalhar com amostras humanas, deve-se utilizar o gerenciamento de resíduos de risco biológico e a segurança.