Modelagem do câncer de próstata em modelos de camundongos geneticamente modificados: uma técnica de edição de genes localizada mediada por CRISPR/Cas9 em células do lobo anterior da próstata de camundongos

Comece com um modelo de camundongo knock-in CRISPR / Cas9 anestesiado e preparado com um genoma projetado para expressar endonucleases Cas9 e proteínas fluorescentes verdes, ou GFPs, por um forte promotor a montante. Um floxed-STOP ou LSL inserido imediatamente a jusante do promotor bloqueia a transcrição de Cas9 e GFP em condições normais.

Incise a parede abdominal do camundongo para expor seu lobo prostático anterior preso à vesícula seminal. Injete a suspensão adenoviral desejada no lobo anterior para facilitar a entrega do genoma viral direcionado nas células. Coloque o lobo da próstata de volta na cavidade abdominal e suture a incisão.

Dentro das células infectadas por vírus, o genoma viral expressa enzimas Cre recombinase e RNAs-guia direcionados ao gene a ser mutado. As enzimas Cre reconhecem o LSL e extirpam o bloqueador de transcrição floxed. Esta etapa permite que o promotor conduza a expressão de endonucleases Cas9 e GFPs.

Posteriormente, as endonucleases Cas9 formam complexos com RNAs-guia codificados por vírus que direcionam esses complexos para a sequência alvo dentro do gene a ser mutado. Essa localização permite que a endonuclease Cas9 clive o DNA genômico dentro do gene alvo, levando à alteração genética.

Uma alteração oncogênica faz com que as células mutantes se tornem cancerígenas. A co-expressão de proteínas repórter GFP dentro de células mutantes facilita a identificação e rastreamento da progressão do câncer.

Para entregar o vírus à próstata, após anestesiar um camundongo macho de 8 semanas de idade de acordo com o protocolo de texto, examine a profundidade do anestésico avaliando o relaxamento muscular, a retirada do pedal e os reflexos palpebrais. Quando for observada perda de reflexos, raspe a parte inferior do abdômen do animal. Usando um cotonete estéril, cubra cuidadosamente os olhos do animal com pomada oftálmica veterinária para evitar a cegueira causada pela xeroftalmia. Em seguida, use etanol 70% e iodopovidona 10% para limpar o abdômen raspado para desinfetar a área cirúrgica.

Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica estéril, faça uma incisão vertical na pele de aproximadamente 1 centímetro na linha média abdominal baixa. Em seguida, com uma pinça de ponta fina, levante o peritônio para evitar danos aos órgãos que estão por baixo e use uma tesoura cirúrgica para fazer cuidadosamente uma incisão de 8 milímetros ou menos no peritônio. Mova suavemente o tecido adiposo para o lado para descobrir a vesícula seminal. Em seguida, usando uma pinça com anel, levante cuidadosamente a vesícula seminal até que a próstata anterior possa ser identificada.

Agora, com uma seringa de insulina de 0,5 mililitro e uma agulha de 30G x 8 milímetros, injete um volume total de 30 microlitros de solução de vírus no epitélio anterior da próstata. Minimize o vazamento e certifique-se de que o fluido seja absorvido dentro do tecido, formando uma pequena bolha. Em seguida, coloque a vesícula seminal de volta na cavidade abdominal.

Para garantir que o fluido seja absorvido dentro do tecido em uma pequena bolha e sem vazamento, certifique-se de injetar paralelamente à vesícula seminal e seguindo a forma do lobo anterior da próstata.

Com uma agulha de ponta cônica e um círculo de 13 milímetros, 3/8, suturar o peritônio com dois a três pontos simples interrompidos de sutura absorvível 6-0. Em seguida, levantando a pele com uma pinça para evitar danificar o peritônio, grampeie a pele com três clipes estéreis de 4,8 x 6,5 milímetros.

Para uma melhor recuperação após a cirurgia, use uma seringa estéril de 1 mililitro e uma agulha de 27G x 1/2 polegada para administrar o antídoto anestésico na dose de 0,1 mililitros por grama de peso corporal por injeção intraperitoneal. Em seguida, coloque cuidadosamente o animal de volta em sua gaiola.