Modelagem do câncer de próstata em modelos de camundongos geneticamente modificados: uma técnica de edição de genes localizada mediada por CRISPR/Cas9 em células do lobo anterior da próstata de camundongos

Comece com um modelo de camundongo knock-in CRISPR / Cas9 anestesiado e preparado com um genoma projetado para expressar endonucleases Cas9 e proteínas fluorescentes verdes, ou GFPs, por um forte promotor a montante. Um floxed-STOP ou LSL inserido imediatamente a jusante do promotor bloqueia a transcrição de Cas9 e GFP em condições normais.

Incise a parede abdominal do camundongo para expor seu lobo prostático anterior preso à vesícula seminal. Injete a suspensão adenoviral desejada no lobo anterior para facilitar a entrega do genoma viral direcionado nas células. Coloque o lobo da próstata de volta na cavidade abdominal e suture a incisão.

Dentro das células infectadas por vírus, o genoma viral expressa enzimas Cre recombinase e RNAs-guia direcionados ao gene a ser mutado. As enzimas Cre reconhecem o LSL e extirpam o bloqueador de transcrição floxed. Esta etapa permite que o promotor conduza a expressão de endonucleases Cas9 e GFPs.

Posteriormente, as endonucleases Cas9 formam complexos com RNAs-guia codificados por vírus que direcionam esses complexos para a sequência alvo dentro do gene a ser mutado. Essa localização permite que a endonuclease Cas9 clive o DNA genômico dentro do