Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo de xenoenxerto de câncer de próstata ortotópico de camundongo que forneça uma abordagem útil para estudar os eventos moleculares do desenvolvimento do tumor primário nos eventos iniciais da cascata metastática. Este modelo pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre as interações espásticas entre células tumorais geneticamente e molecularmente alteradas no microambiente do tumor em crescimento. Também pode ajudar na avaliação pré-clínica de novas abordagens terapêuticas contra o câncer de próstata humano.

A principal vantagem desta técnica sobre os modelos metastáticos espontâneos é que ela promove o estudo dos eventos moleculares do desenvolvimento do tumor primário e também a recapitulação da fase inicial da metástase antes da entrada e embolia das células tumorais na circulação. O modelo ortotópico de câncer de próstata é um dos melhores modelos pré-clínicos para entender como as células do câncer de próstata metastatizam para diferentes órgãos. A maioria dos pacientes com câncer de próstata morre de metástase e, portanto, esse modelo é muito importante para investigar os mecanismos moleculares da metástase.

Usando este modelo, podemos projetar melhores estratégias para o tratamento de metástases usando compostos neurais, que são específicos para vias metastáticas. Demonstrando este procedimento estarão Melissa Colden, uma estudante de pós-graduação e o Dr. Varahram Shahryari, um pesquisador associado de nosso laboratório. Antes de iniciar o procedimento, lave a cultura de células tumorais de interesse com PBS e incube as células com 2 mililitros de tripsina a 05% por 3 a 5 minutos na incubadora de cultura de células.

Quando as células se desprenderem, pare a reação com 5 mililitros de meio completo e conte as células por exclusão de azul de tripano. Dilua as células para 2,5 vezes 10 a 5 células por 10 microlitros de concentração média e misture a suspensão celular com 10 microlitros de extrato de matriz extracelular semelhante a uma membrana basal. Segure as células no gelo e, em seguida, coloque um camundongo experimental imunocomprometido de seis a oito semanas anestesiado na posição supina em uma almofada de aquecimento estéril e confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.

Aplique pomada nos olhos dos animais e remova os pelos da parte inferior do abdômen. Desinfete a área cirúrgica com 10% de iodopovidona, seguido de etanol a 70% cerca de 1 a 2 centímetros acima da bainha do pênis e cerca de 2 a 3 centímetros abaixo da parte inferior da caixa torácica. Use uma pinça fina para levantar 2 milímetros de pele acima da glândula prepucial.

Usando um bisturi, faça uma incisão na linha média de 1 centímetro através da pele, seguida por uma incisão de 1 centímetro através da camada muscular. Localize a bexiga esférica amarela e marrom clara diretamente abaixo da incisão. Em seguida, use a pinça fina para segurar a bexiga e levantar o órgão para cima e para fora da cavidade do corpo em direção à bainha do pênis para expor as vesículas seminais.

Com um cotonete úmido em cada mão, exteriorize cuidadosamente as vesículas, uma de cada vez, e coloque-as de cima para baixo na superfície externa do abdômen com a bexiga no meio. Em seguida, use os cotonetes para inclinar suavemente as vesículas seminais no ponto de inserção próximo ao colo da bexiga em direção à bainha do pênis, de modo que os dois lobos dorsais da próstata fiquem claramente visíveis. Agora use uma micropipeta para ressuspender as células em uma suspensão de célula única e rotulá-las com luciferina.

Aspire 25 microlitros das células em uma seringa de 0,5 cc equipada com uma agulha de calibre 28,5 e transfira o camundongo para um microscópio de dissecação. Em seguida, insira a agulha da seringa em um lobo prostático dorsal e injete lentamente 20 microlitros da suspensão celular até observar a formação de uma bolha. Quando todas as células tiverem sido administradas, retraia a agulha, pressionando levemente o local da injeção com um cotonete por alguns segundos para evitar vazamentos.

Em seguida, use os cotonetes para retornar cuidadosamente as vesículas à cavidade corporal, uma de cada vez, seguidas pela bexiga. Depois de colocar os órgãos de volta na cavidade do corpo, suture a camada muscular primeiro em um padrão interrompido com suturas intestinais de gato crômicas 4-0 absorvíveis, seguidas pelo fechamento da pele com suturas cirúrgicas de náilon 4-0 não absorvíveis. A pele também pode ser unida e fechada com pinças cirúrgicas para fechar completamente a incisão.

Em seguida, imagine imediatamente o animal e devolva o camundongo a uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Após a implantação ortotópica de células de câncer de próstata marcadas com luciferina no lobo prostático posterior, como acabamos de demonstrar, imagens semanais usando imagens de bioluminescência de animais vivos revelam uma colonização bem-sucedida dos lobos da próstata pelas células tumorais. De fato, um aumento na bioluminescência ao longo do tempo é indicativo do aumento do tumor primário ao longo do experimento, confirmando a eficácia dessa técnica em imagens não invasivas, radiográficas, fluorescentes ou luminescentes para o crescimento tumoral e monitoramento de lesões metastáticas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a injeção intraprostática requer cirurgia abdominal aberta. Portanto, deve ser realizado em um ambiente livre de patógenos, usando técnicas cirúrgicas assépticas adequadas. Trabalhar com células cancerígenas humanas pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar equipamento de proteção individual e trabalhar dentro da contenção de nível dois de biossegurança, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

Este modelo abriu caminho para o transplante de fragmentos tumorais histologicamente intactos para examinar os efeitos de possíveis terapias medicamentosas no crescimento do tumor ou metástase de linfonodos originais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implantar células cancerígenas nos lobos prostáticos dorsais para o estabelecimento de um modelo ortotópico de camundongo xenoenxerto de câncer de próstata humano.